專利名稱：：一種苦馬豆素降解菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌ylzz-2及其分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種新的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(6^/70trap/0/z70;7as/za"o//Wi'a)，具體涉及一種能夠有效降解瘋草主要毒素苦馬豆素(Swainsonine，SW)的降解菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YLZZ-2,還涉及該降解菌分離鑒定和培養(yǎng)方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：瘋草(Locoweed)是豆科棘豆屬(fl^^^w's)和黃芪屬(A^ra^a7"s)有毒植物的總稱，也是世界范圍內(nèi)危害草原畜牧業(yè)最嚴重的一類毒草。在我國，瘋草廣泛分布于西北、華北和西南的廣大草原，危害面積達1100萬hm2，占全國草場面積的2.8%。。由于瘋草具有很強的適應(yīng)能力，在荒漠草原上生長旺盛，而且返青早，枯萎遲，放牧動物在其它植物缺少或長勢不好的情況下，長期或大量采食，造成大批家畜中毒死亡，或母畜不孕、流產(chǎn)、胎兒畸形、公畜不育及畜產(chǎn)品質(zhì)量下降，給草原畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失?？囫R豆素(Swainsonine，SW)是瘋草(Locoweed)類植物體內(nèi)含有的水溶性吲哚茲定生物堿，分子式為C8H15N03，化學(xué)名稱為1，2，8-三羥基八氫吲哚里西啶(1，2，8-trihydroxyoctahydroindoliziding)，是瘋草類植物的主要有毒成分之一。苦馬豆素能抑制溶酶體ci-甘露糖苷酶活性，使細胞內(nèi)低聚糖聚積，造成細胞空泡化，從而使細胞失去正常功能，甚至造成細胞死亡，還能抑制高爾基甘露糖苷酶II，影響糖蛋白的合成、處理和轉(zhuǎn)移，這些導(dǎo)致細胞粘附、激素轉(zhuǎn)運及細胞表面受體功能障礙。動物中毒的臨床表現(xiàn)包括精神沉郁、感覺遲鈍、神經(jīng)過敏、四肢無力、惡病質(zhì)、生殖機能受損等，慢性中毒常造成神經(jīng)系統(tǒng)的持久的不可恢復(fù)的損害。瘋草雖然是毒草，其營養(yǎng)價值也很豐富，有些棘豆的粗蛋白含量高達20%，超過"飼料之王"的苜蓿。針對我國而言，將西部草原30%以上的生長茂盛的瘋草變成可利用的優(yōu)質(zhì)牧草，可以增加近一倍的飼草資源，可對當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)的發(fā)展起到強大的促進作用。近年來，國內(nèi)外在瘋草的危害、有毒成分、毒理機制、防除和利用等方面的研究取得了重要進展，但迄今還沒有控制瘋草蔓延的特效方法，致使瘋草中毒問題日趨嚴重，成為草原畜牧業(yè)的大患。國內(nèi)學(xué)者曾嘗試用水浸法、酸水浸泡法和高溫處理法等處理瘋草，在去除瘋草毒性的同時破壞了瘋草的適口性和營養(yǎng)價值，并且費用高，不適宜推廣。王凱等研制出"棘防E號"等系列解毒劑，能有效推遲瘋草中毒癥狀出現(xiàn)的時間，童德文等將SW與大分子載體蛋白BSA連接合成SW-BSA,以SW-BSA免疫原接種動物，使動物獲得免疫力并在采食瘋草時得到保護，這兩項研究已取得一定進展，為防除動物瘋草中毒病帶來希望。目前，應(yīng)用微生物降解有毒物質(zhì)一直是國內(nèi)外研究的熱點，涉及的領(lǐng)域十分廣泛，但在微生物降解植物毒素方面的研究較少，不過也取得了一定的成果，周斌從菜籽餅中分離到能夠降解芥子甙的多種微生物70多株，經(jīng)鑒定這些菌是白色球擬酵母(7b2i/Jop幻'scs77力Va)、華根霉(^Zj'zo/iASc/n'/7e/7s^)、總狀毛霉(M/corrac柳。ms)、米曲霉"spe，7ii/s。2yzae)，通過發(fā)酵試驗確定其脫毒率為80%。譚蓓英等從廣西潿洲島的黃牛瘤胃中，分離出4株厭氧細菌，經(jīng)鑒定為乳桿菌屬(lactoneJ77i/s)(2株)、牛鏈球菌(5"z^印tococc^6ow's)和生孢梭菌(C/os^ri'必咖sparoge/7es)，上述菌株對含羞草素和二羥基吡啶類毒素具有降解活性，這些脫毒菌生活在瘤胃中，可以保護宿主動物免受銀合歡的毒害。瘋草毒素生物降解研究還未見報道，但這些研究方法可供借鑒，探索一條sw生物降解的途徑，篩選出能夠降解sw的微生物，并將降解該毒素的酶基因轉(zhuǎn)入動物胃腸道正常菌群或動物機體上，不僅能從根本上解決動物瘋草中毒問題，還能帶來很好的經(jīng)濟效益和環(huán)境效益，對草原毒草的生物學(xué)控制和草原生態(tài)學(xué)研究起到積極作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種降解瘋草毒素苦馬豆素的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YLZZ-2(5^e/7"rop力oyzo/7as^3"o/力WiaYLZZ-2);它能夠有效減少瘋草中的苦馬豆素含量，使之對動物毒性降低。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明提供的一種苦馬豆素降解菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YLZZ-2(5Ye;7"ro;/o/z70/7as歷a7i^。力ih'aYLZZ-2)，屬于寡養(yǎng)單胞菌屬，已于2007年7月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，本保藏中心保藏編號為CCTCCN0:M207109，保藏地址中國.武漢.武漢大學(xué)。本發(fā)明還有一目的是提供嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YLZZ-2的分離方法，具體包括下列步驟1)采集草樣采自甘肅、西藏、內(nèi)蒙、青海等生長地的瘋草；2、制備土樣將lkg瘋草埋于土壤中，深度為1020cm,半年后取出草樣周圍的土壤，將采集的土樣充分混合；3、菌株的分離篩選取10g充分混合的土樣加入裝有90mL無菌水和無菌玻璃珠的三角瓶內(nèi)，置于搖床上，200r/min充分振蕩10min，制備菌懸液，然后取10mL菌懸液加入100mL富集培養(yǎng)液中，并在30°C，180r/min，pH7.0條件下培養(yǎng)過夜，然后再以10%接種量接種于新鮮的含SW30mg/L的馴化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以后每隔4d移種一次，并逐漸增加SW含量分別為50，80，100，120，150，180，200mg/L。當(dāng)SW濃度達到200mg/L時,再以10%接種量接種于新鮮的含SW200mg/L的無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d，然后將培養(yǎng)液稀釋平板法涂布SW無機鹽固體培養(yǎng)基上，挑選菌落形態(tài)各異的單菌落菌株，純化后保存于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，得到一株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YLZZ-2。所述的富集培養(yǎng)液的組分及配比為牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，KH2P04lg，蒸餾水1L，pH為7.07.2，12rC高壓滅菌20min。所述的普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的組分及配比為牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，KH2P041.0g，瓊脂20g，蒸餾水1L，pH7.07.2，121。C高壓滅菌20min。所述的無機鹽培養(yǎng)基的組分及配比為NH4N031.0g，MgS040.15g，(NH4)2S040.5g，KH2P040.5g，NaClO.5g，K2HP041.5g，蒸餾水100mL，pH7.07.2，121'C滅菌20min，滅菌后加入過濾除菌的SW溶液，使無機鹽培養(yǎng)基中SW的濃度為0200mg/L。所述的馴化培養(yǎng)基根據(jù)不同需要，向滅菌后的富集培養(yǎng)液中無菌加入過濾除菌的SW溶液，使馴化培養(yǎng)基中SW的濃度為0200mg/L。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YLZZ-2菌株具有以下述性質(zhì)1、形態(tài)與生理生化特征YLZZ-2菌株的菌體呈球桿狀，(0.30.5)umX(1.31.5)um,革蘭氏陰性桿菌，無莢膜，無芽孢，有運動性，數(shù)根鞭毛；菌落呈圓形，淺黃綠色，表面光滑，濕潤，隆起，邊緣整齊，不透明，培養(yǎng)時間長時有同心圓狀半透明內(nèi)環(huán)；不發(fā)酵葡萄糖，不產(chǎn)生吲哚，M.R試驗陰性，V.P試驗陽性，不水解淀粉，不還原硝酸鹽，不能利用檸檬酸鹽，利用丙二酸鹽，不產(chǎn)生H2S,液化明膠，接觸酶陽性，氧化酶陰性，尿素酶陽性，在5XNaCl中生長，但較緩慢，7%NaCl中不生長。具體生理生化特征見表l。表l.YLZZ-2菌株的生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注"+"表示生長或反應(yīng)陽性；"一"表示不生長或反應(yīng)陰性。YLZZ—2株的16SrDNA序列同源性分析YLZZ-2菌株16SrDNA序列如SEQIDNO.1所述，其GenBank登錄號為EU022689(序列未公開)。經(jīng)16SrDNA序列同源性分析，依據(jù)同源性在系統(tǒng)發(fā)育中的分類原則并結(jié)合形態(tài)、生理生化特征，參考《伯杰細菌學(xué)手冊(第八版)》，最終確定YLZZ-2菌株為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(&，加/ta謹51鵬7t。//y力'a)。該苦馬豆素降解菌YLZZ—2經(jīng)形態(tài)、生理生化特性分析和16SrDNA基因序列同源性分析，鑒定為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，該菌株能以苦馬豆素為惟一碳源生長。本發(fā)明的苦馬豆素降解菌YLZZ—2可降解瘋草類有毒植物的主要毒素SW，為徹底解決瘋草的毒害奠定基礎(chǔ)。圖1是YLZZ-2菌株在顯微鏡鏡下的形態(tài)；圖2是YLZZ-2菌株的單個菌落形態(tài)；圖3利用DNAStar軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；圖4是YLZZ-2降解SW的對照組氣相色譜圖；圖5是YLZZ-2降解SW的試驗組中期氣相色譜圖；圖6是YLZZ-2降解SW的試驗組后期氣相色譜圖；圖7是YLZZ-2降解SW的降解曲線。具體實施方式實施例l:嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YLZZ-2菌株的制備方法1)采集草樣采自甘肅、西藏、內(nèi)蒙、青海等生長地的瘋草；2)制備土樣將lkg瘋草埋于土壤中，深度為1020cm，半年后取出草樣周圍的土壤，將采集的土樣充分混合；3)菌株的分離篩選取10g充分混合的土樣加入裝有90mL無菌水和無菌玻璃珠的三角瓶內(nèi)，置于搖床上，200r/min充分振蕩10min，制備菌懸液，然后取10mL菌懸液加入100mL富集培養(yǎng)液中，并在30°C，180r/min，pH7.0條件下培養(yǎng)過夜，然后再以10%接種量接種于新鮮的含SW30mg/L的馴化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以后每隔4d移種一次，并逐漸增加SW含量分別為50，80，100，120，150，180，200mg/L。當(dāng)SW濃度達200mg/L時，再以10%接種量接種于新鮮的含SW200mg/L的無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d，然后將培養(yǎng)液稀釋平板法涂布SW無機鹽固體培養(yǎng)基上，挑選菌落形態(tài)各異的單菌落菌株，純化后保存于瓊脂斜面上，得到一株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YLZZ-2。所述的富集培養(yǎng)液的組分及配比為牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，KH2P04lg，蒸餾水1L，pH為7.07.2，121。C高壓滅菌20min。所述的普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的組分及配比為牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，歸041.Og，瓊脂20g，蒸餾水1L，pH7.07.2，121。C高壓滅菌20min。所述的無營養(yǎng)培養(yǎng)基的組分及配比為NH4NO:,1.Og，MgS040.15g，(NH4)2S040.5g,KH2P040.5g，NaCl0.5g，K2HP041.5g，蒸餾水100mL，pH7.07.2，12rC滅菌20min，滅菌后加入過濾除菌的SW溶液，使無機鹽培養(yǎng)基中SW的濃度為200mg/L。所述的馴化培養(yǎng)基根據(jù)需要，向滅菌后的富集培養(yǎng)液中無菌加入過濾除菌的SW溶液，使其濃度為50，80，100，120，150，180，200mg/L。試驗例1YLZZ-2菌株的16SrDNA序列的同源分析將YLZZ-2菌株的16SrDNA序列(SEQIDNO.1)通過NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進行序列同源性分析，利用DNAStar軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，見圖3。由圖3得出，YLZZ-2菌株的遺傳進化距離與寡養(yǎng)單胞菌屬最近，它與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)同處于一個最小的分支，與己知菌株Stenotrophoraonasmaltophilia(AB194708)的同源性達到99.5%,說明該菌在分子系統(tǒng)發(fā)育分類學(xué)上屬于嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。試驗例2:嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YLZZ-2菌株的降解SW試驗采用氣相色譜法測定該菌對SW的降解率。以5%的接種量將降解菌接種到含有50mg/LSW的無機鹽培養(yǎng)基中，30°C，180r/min搖動培養(yǎng)，以不接菌的SW無機鹽培養(yǎng)基為對照，每隔2h取樣，用氣相色譜法測定苦馬豆素的含量(圖4，圖5，圖6)，結(jié)果見表2，計算降解率，繪制降解曲線(圖7)。表2.不同培養(yǎng)時間SW的降解率(％)菌<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>總結(jié)YLZZ-2菌株在14h內(nèi)基本上將50mg/L的苦馬豆素降解完全，而對照組苦馬豆素?zé)o降解。該菌最適生長條件為pH為68，溫度為25T:35。C。<110>西北農(nóng)林科技大學(xué)<120〉一種苦馬豆素降解菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YLZZ-2及其分離方法〈160〉1<210>1<211〉1443<212>腿<213〉5te/3otro;力cw7an3S鵬J鄉(xiāng)力/JisYLZZ—2〈400〉1MTGCAGTCGAACGGCAGCACAGAGGAGCTTGCTCCTTGGGTGGCGAGTGGCGGACGGGT60GAGGMTACATCGGMTCTACTTTTTCGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTMTA120CCGCATACGACCTACGGGTGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCGATTGMTGAGCC180GATGTCGGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAMGGCCCACCMGGCGACGATCCGTAGCTGGT240CTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAG300CAGTGGGGMTATTGGACMTGGGCGCMGCCTGATCCAGCCATACCGCGTGGGTGAAGA360AGGCCTTCGGGTTGTAAAGCCCTTTTGTTGGGAAAG嵐TCCAGCCGGCTMTACCTGGT420TGGGATGACGGTACCCAAAGMTMGCACCGGCTMCTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTMT480ACGAAGGGTGCMGCGTTACTCGGMTTACTGGGCGT嵐GCGTGCGTAGGTGGTTGTTT540MGTCTGTTGTG嵐GCCCTGGGCTCMCCTGGGAACTGCAGTGG嵐CTGGACMCTAG600AGTGTGGTAGAGGGTAGCGGAATTCCCGGTGTAGCAGTGAAATGCGT歸GATCGGGAGG660MCATCCATGGCGAAGGCAGCTACCTGGACCAACACTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGG720GGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTT780GGGTGCAATTTGGCACGCAGTATCGAAGCTMCGCGTTMGTTCGCCGCCTGGGGAGTAC840GGTCGCMGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACMGCGGTGGAGTATGTG900GTTTMTTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGTCGAGAACTTTCCAG960AGATGGATTGGTGCCTTCGGGMCTCGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGT1020GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCMCCCTTGTCCTTAGTTGCCAGCA1080CGTAATGGTGGGMCTCTAAGGAGACCGCCGCTGACAAACCGGAGGMGGTGGGGATGAC1140CTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTACTACMTGGTAGGGACAGA1200GGGCTGCMGCCGGCGACGGTMGCCMTCCCAG嵐CCCTATCTCAGTCCGGATTGGAG1260TCTGCMCTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTMTCGCAGATCAGCATTGCTGCGG1320TGMTACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTTGTTGCACCA1380GMGCAGGTAGCTTMCCTTCGGGAGGGCGCTTGCCACGGTGTGGCCGATGACTGGGGTG1440MG144權(quán)利要求1、一種苦馬豆素降解菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YLZZ-2(StenotrophomonasmaltophiliaYLZZ-2)，于2007年7月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCNOM207109。2、權(quán)利要求1所述的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YLZZ—2的分離方法，其特征在于包括下列步驟1)采集草樣采自甘肅、西藏、內(nèi)蒙、青海等生長地的瘋草；2)制備土樣將lkg瘋草埋于土壤中，深度為1020cm，半年后取出草樣周圍的土壤，將采集的土樣充分混合；3)菌株的分離篩選取10g充分混合的土樣加入裝有90mL無菌水和無菌玻璃珠的三角瓶內(nèi)，置于搖床上，200r/min充分振蕩10min，制備菌懸液，然后取lOmL菌懸液加入lOOmL富集培養(yǎng)液中，并在30°C，180r/min，pH7.0條件下培養(yǎng)過夜，然后再以10%接種量接種于新鮮的含SW30mg/L的馴化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以后每隔4d移種一次，并逐漸增加SW含量分別為50，80,100，120，150，180，200mg/L。當(dāng)SW濃度達200mg/L時，再以10%接種量接種于新鮮的含SW200mg/L的無機鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d，然后將培養(yǎng)液稀釋平板法涂布SW無機鹽固體培養(yǎng)基上，挑選菌落形態(tài)各異的單菌落菌株，純化后保存于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，得到一株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YLZZ-2。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YLZZ—2的分離方法，其特征在于所述的富集培養(yǎng)液的組分及配比為牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，KH2P04lg，蒸餾水1L，pH為7.07.2，121。C高壓滅菌20min。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YLZZ—2的分離方法，其特征在于所述的普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的組分及配比為牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，KH2P041.Og，瓊脂20g，蒸餾水1L,pH7.07.2，121。C高壓滅菌20min。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YLZZ—2的分離方法，其特征在于所述的無機鹽培養(yǎng)基的組分及配比為NH4N031.0g，MgS040.15g，(NH4)2S040.5g，KH2P040.5g，NaC10.5g，K2HP041.5g，蒸餾水100mL，pH7.07.2，121。C滅菌20min，滅菌后加入過濾除菌的SW溶液，使無機鹽培養(yǎng)基中SW的濃度為0200mg/L。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YLZZ—2的分離方法，其特征在于所述的馴化培養(yǎng)基是在富集培養(yǎng)液中加入過濾除菌的SW溶液，使馴化培養(yǎng)基中SW的濃度為0200mg/L。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YLZZ—2的分離方法，其特征在于所述的無機鹽固體培養(yǎng)基是在無機鹽培養(yǎng)基中加入瓊脂，使瓊脂在其中的濃度為20g/L。8、權(quán)利要求1所述的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YLZZ—2在降解瘋草毒素苦馬豆素中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種苦馬豆素降解菌嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌YLZZ-2，菌體呈桿狀，(0.3～0.5)μm×(1.3～1.5)μm，革蘭氏染色陰性，無莢膜，無芽孢，有運動性，數(shù)根鞭毛；菌落呈圓形，淺黃綠色，表面光滑，濕潤，隆起，邊緣整齊，不透明，培養(yǎng)時間長時有同心圓狀半透明內(nèi)環(huán)；該菌株從埋藏過從甘肅、西藏、內(nèi)蒙、青海等地生長的瘋草的土壤中經(jīng)人工分離、篩選而得，其于2007年7月20日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCNOM207109。該菌株具有降解瘋草主要毒素苦馬豆素(Swainsonine，SW)的特性。文檔編號C12N1/20GK101220339SQ20071001872公開日2008年7月16日申請日期2007年9月21日優(yōu)先權(quán)日2007年9月21日發(fā)明者王建華,耿果霞,趙興華申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)