專利名稱：通用型高效真核表達載體p3I-GFPN及采用該載體構(gòu)建的抗乳腺炎的轉(zhuǎn)基因載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及真核表達載體的構(gòu)建，特別涉及一種高效真核表達 載體p31-GFPN及由該載體構(gòu)建的高效抗乳腺炎的轉(zhuǎn)基因載體。
背景技術(shù)：
構(gòu)建高效真核表達載體是目前動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的研究重點和熱點，迄今用于動物 基因工程的表達載體大致分為質(zhì)粒載體、病毒載體和人工染色體。良好的動物基因工程 表達載體，必須具備高效整合到動物基因組中并在動物體內(nèi)高效表達外源基因的能力， 雖然病毒載體較好的解決了高效整合的問題，但高效表達外源基因的問題有待解決。間 插序列(intervening sequence, IVS)是基因內(nèi)部不編碼蛋白的一段DNA序列，屬于 內(nèi)含子，在基因轉(zhuǎn)錄過程中隨外顯子一同轉(zhuǎn)錄，它在加工轉(zhuǎn)錄本時具有切出隨后的ra謂A 的作用，從而有利于翻譯過程中核糖體結(jié)合和高效起始翻譯。目前，以轉(zhuǎn)基因體細胞為 核移植的供體細胞來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物是制作轉(zhuǎn)基因動物中最常用也是最有效的手段，但 轉(zhuǎn)基因體細胞的篩選和鑒定是一項長期而繁瑣的工作，目前常用真核表達載體中具有抗 抗生素如Geneticin、hygromycinB作用的基因如 neomycine phosphotransferase基因、 hygromycin B phosphotransferase基因使轉(zhuǎn)基因細胞在含有抗生素的培養(yǎng)液中存活， 但由于載體具有隨機整合到基因組中的特性，使部分具有抗性的轉(zhuǎn)基因細胞不能正常表 達外源基因，為區(qū)分可表達外源蛋白的轉(zhuǎn)基因細胞和不能表達外源蛋白的轉(zhuǎn)基因細胞帶 來了難度，如果在外源基因的同一轉(zhuǎn)錄本上引入一個方便檢測的標記基因如綠色熒光蛋 白基因并結(jié)合抗藥篩選，就能簡化并有效地篩選出表達外源蛋白的轉(zhuǎn)基因細胞。同時， 為了使位于同一個轉(zhuǎn)錄本上的外源基因與標記基因在翻譯過程中不形成融合蛋白，可以 利用具有核糖體結(jié)合并起始翻譯作用的IRES序列將外源基因和標記基因連來，并在外源 蛋白的編碼區(qū)之后插入終止密碼子。另外，為提高外源基因和標記基因的表達量，可在 插入外源基因的多克隆位點前和與標記基因相連的IRES序列前各插入一個具有轉(zhuǎn)錄后 切出作用的間插序列。
乳腺炎是由一種或多種致病微生物經(jīng)乳頭皸裂處或乳管口侵入乳管，引起乳腺組織 急性化膿性感染的一類疾病，在產(chǎn)奶量較高的大家畜中尤為常見，另外， 一些病毒感染 乳腺細胞后也能引發(fā)乳腺炎。乳腺炎嚴重影響著奶業(yè)和畜牧業(yè)的發(fā)展，家畜乳腺炎特別 是牛羊等產(chǎn)奶大家畜的乳腺炎嚴重危害著畜牧業(yè)的發(fā)展，僅美國每年由于家畜乳腺炎而
直接導致的經(jīng)濟損失多達20億美元；據(jù)有關(guān)資料統(tǒng)計，在美國每年由于乳腺炎而引起的 損失占畜牧業(yè)的5-10%。目前治療乳腺炎主要是運用抗生素和疫苗，而使用抗生素后的 動物奶中因含有大量的抗生素而不能上市，更嚴重的是許多患乳腺炎的動物產(chǎn)奶量嚴重 下降甚至終身不能產(chǎn)奶；疫苗雖然能較好的治療乳腺炎，但由于細菌的高變異性，使疫 苗易在短期內(nèi)失效。
基因治療是1980年代興起于美國的一種高端醫(yī)療技術(shù)，它利用分子生物學的方法將 正常的基因或具有治療作用的基因通過一定方式導入體內(nèi)，使之表達目的產(chǎn)物以糾正基 因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，是現(xiàn)代醫(yī)學和分子生物學相接合而誕生的一門新技術(shù)。如 果利用基因治療的手段從根本上改良動物基因組，提高家畜抗乳腺炎的能力，就能較好 的降低和防治乳腺炎。
溶菌酶是一種具有水解致病菌胞壁中黏多糖的小分子蛋白，Phillips等在論文《The 3-dimensional structure of an enzyme molecule》中指出它通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的e-1， 4糖苷鍵，使細胞壁中不溶性黏多糖分解成可 溶性糖肽，導致細胞壁破裂和內(nèi)容物逸出而使細菌溶解；溶菌酶還可與帶負電荷的病毒 蛋白直接結(jié)合，與DNA、 RNA、脫輔基蛋白形成復鹽，使病毒失活，具有抗菌、消炎、抗 病毒等作用。Z. Yu等在發(fā)表的《Expression and Bioactivity of Recombinant Human Lysozyme in the Milk of Transgenic Mice》中禾口E. A. Maga等在論文《Production and Processing of Milk from Transgenic Goats Expressing Human Lysozyme in the Mammary Gland》中均指出，通過乳腺分泌人溶菌酶的轉(zhuǎn)基因動物比普通動物更具溶菌和防止細菌 感染的作用。干擾素是一類具有多功能的活性蛋白質(zhì)，具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗細胞 增殖等作用，是一類重要的具有免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子。由于乳腺炎是由一種或多種 致病菌引起的急性化膿性疾病，如果能較好的控制和殺死感染乳腺的細菌，同時提高機 體的免疫能力，就能從根本上防治乳腺炎，而溶菌酶和干擾素正能起到溶解細菌、中和 病毒、防止微生物感染和增強免疫力等作用。故將人溶菌酶基因和人干擾素基因插入通 用性高效真核表達載體p3I-GFPN中，并根據(jù)動物在泌乳期易感染乳腺炎的特點，構(gòu)建一 個在干乳期稍低水平表達溶菌酶和干擾素，而在泌乳期高效表達溶菌酶和干擾素的抗乳 腺炎真核表達載體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，構(gòu)建一種高效表達外源基因和標記基因的通用型真核表達載體 p3I-GFPN，便于將所需的目的基因?qū)胝婧松飪?nèi)進行表達；為防治家畜乳腺炎和利用 基因防治的手段建立一種動物疾病防治模式，在通用型高效真核表達載體p3I-GFPN的基
礎(chǔ)上構(gòu)建一種高效抗乳腺炎的轉(zhuǎn)基因載體pCMV/CSN2-hLY-hIFA，為制作乳腺生物反應(yīng)器 和抗乳腺炎等疾病的轉(zhuǎn)基因動物奠定基礎(chǔ)。
為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下技術(shù)解決方案
一種通用型高效真核表達載體p3I-GFPN，其特征在于與多克隆位點同一轉(zhuǎn)錄本下的 標記基因即綠色熒光蛋白基因前添加了一段具有核糖體結(jié)合并起始其后順反子翻譯的 IRES序列，使插入到多克隆位點的外源基因與綠色熒光蛋白基因在同一轉(zhuǎn)錄本中各自獨 立翻譯，并能指示插入到多克隆位點的外源蛋白在轉(zhuǎn)基因細胞或動物中的表達狀況。同 時，在多克隆位點的前后均添加了一段具有增強mRNA切出作用的間插序列，有利于插入 到多克隆位點的外源基因和綠色熒光蛋白基因的高效表達；另外，在綠色熒光蛋白基因 后面具有多個酶切位點，便于另一個外源基因的替代，使一個轉(zhuǎn)錄本能翻譯出兩個不同 目的蛋白。其DNA序列如序列表中SEQ ID NO: 1所示。
利用上述通用型高效真核表達載體p3I-GFPN構(gòu)建的一種抗乳腺炎轉(zhuǎn)基因載體 pCMV/CSN2-hLY-hIFA，其特征在于在多克隆位點插入了一個具有溶菌、抗菌、消炎、抗 病毒等作用的人溶菌酶基因，并用具有抗病毒、調(diào)解免疫系統(tǒng)、抗細胞增殖等作用的人 干擾素A基因替代綠色熒光蛋白基因，同時在間插序列和人溶菌酶基因之間插入了 CSN2 的啟動子和到編碼信號肽的DNA序列，便于增強外源基因在泌乳期乳腺細胞中的表達。 其DNA序列如序列表中SEQ ID NO: 2所示。
本發(fā)明構(gòu)建的高效表達外源基因和標記基因即綠色熒光蛋白基因(GFP gene)的通 用型高效真核表達載體p31-GFPN，外源基因通過多克隆位點(Nhe I ， BspT I ， Sal I ， Xhol ， EcoRI ;其序列為GCTAGCTTAAGTCGACTCGAGAATTC)插入該載體，多克隆位點序 列與內(nèi)部核糖體進入位點(internal ribozyme entry site, IRES)相鄰，根據(jù)IRES 在翻譯中能夠與核糖體結(jié)合并起始其后mRNA翻譯的特性使插入到多克隆位點的目的基因 和標記基因在一個轉(zhuǎn)錄本上各自獨立翻譯，且當目的基因的編碼框后插入終止密碼子時 不與綠色熒光蛋白形成融合蛋白，有利于維持目的蛋白原有的特性和活性。在多克隆位 點前后(即CMV啟動子之后和IRES序列之前)各插入了一段O. 3kb的間插序列(intervening sequence, IVS)，有利于轉(zhuǎn)錄后其后mRNA的切出，使插入到多克隆位點的目的基因和帶 有IRES的GFP基因的mRNA能夠被剪切出來，有利于核糖體結(jié)合和提高翻譯效率，增加外源 蛋白和綠色熒光蛋白的表達量。另外，該載體中存在抗遺傳霉素(Geneticin)的新霉素 磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neomycin phosphotransferase gene， neo)，使被轉(zhuǎn)染的真核細胞能 夠在含有Geneticin的培養(yǎng)液中存活，便于轉(zhuǎn)基因細胞的篩選。
在此基礎(chǔ)上，將具有溶菌、消炎、抗病毒等作用的人溶菌酶基因插入多克隆位點，
并將山羊乳腺細胞特異性的P-酪蛋白(3-casein, CSN2)的啟動子和到編碼信號肽為 止的DNA序列插入到CMV啟動子和溶菌酶基因之間，以增強其在泌乳期乳腺細胞中的表 達量，經(jīng)乳腺細胞轉(zhuǎn)染后證明構(gòu)建的雙啟動子表達標記基因的量要明顯高于單啟動子載 體。在此基礎(chǔ)上將具有中和病毒、提高免疫力等作用的人干擾素A基因(human interferon-a ， hIFA)替代GFP基因，有利于提高家畜乳腺炎易染期的抵抗力，最終構(gòu) 建了 一種溶菌抗病毒的雙啟動子啟動雙順反子的抗乳腺炎轉(zhuǎn)基因載體 pCMV/CSN2-hLY-hlFA，為制作乳腺生物反應(yīng)器和抗乳腺炎轉(zhuǎn)基因動物提供了基礎(chǔ)。
經(jīng)細胞轉(zhuǎn)染后熒光檢測分析證實，載體p3I-GFPN和p3I-GFP的熒光強度大于pIGD 和pIGPb，且均高于市售載體pIRES-AcGFP-Nuc，說明構(gòu)建的通用型高效真核表達載體 p3I-GFPN能夠高效表達外源基因和標記基因；另外，它具有多個可用酶切位點，適用于 大多數(shù)外源基因的插入，并且由于插入的外源基因和標記基因在一個轉(zhuǎn)錄本上，故能通 過檢測綠色熒光蛋白的表達量來確定外源蛋白在真核細胞內(nèi)的表達狀況，是一種簡單易 行的檢測手段，并通過結(jié)合Geneticin的篩選，大大簡化了陽性克隆細胞的篩選。
構(gòu)建的雙啟動子啟動雙順反子的真核表達載體之一的pCMV/CSN2-hLY-GFP,在乳腺 細胞中能高水平表達綠色熒光蛋白，說明CMV啟動子和CSN2啟動子在乳腺細胞中能高水 平啟動外源基因和標記基因的表達，當標記基因被另一個外源基因取代后，兩個外源基 因均能在泌乳期的乳腺細胞中高效表達；在成纖維細胞中pCMV/CSN2-hLY-GFP表達GFP 比pCMV-hLY-GFP要低一些，顯示熒光的細胞數(shù)要少，說明CSN2啟動子對CMV啟動 子有抑制作用，證實轉(zhuǎn)pCMV/CSN2-hLY-hlFA的細胞和動物在干乳期的細胞和其他類型 的細胞中不易過量表達和積累，在起到抗菌抗病毒的同時不影響轉(zhuǎn)基因細胞和動物的正 常生理代謝和生命活動。在泌乳期的乳腺細胞中，由于CSN2的啟動子發(fā)揮了啟動作用， 使轉(zhuǎn)pCMV/CSN2-hLY-hlFA的乳腺細胞分泌大量的人溶菌酶和人干擾素A，在通過乳汁 分離獲得目的蛋白的同時又能較好的防治家畜乳腺炎。


圖1是通用型高效表達載體p31-GFPN的構(gòu)建流程圖2是抗乳腺炎轉(zhuǎn)基因真核表達載體pCMV/CSN2-hLY-hlFA的構(gòu)建流程圖； 圖3是制作載體pCMV/CSN2-hLY-hIFA過程中購買和制作的各種載體的圖譜；其中， (1)是pEGFP-Cl, (2)是pIRESneo3， (3)是pIRES， (4)是pGFP， (5)是pGFPB， (6) 是pT-21， (7)是pIGD， (8)是pIGPb， (9)是p31-GFP， (10)是p3I-GFPN， (11)是 MD-hLY， (12)是pT-hLY， ( 13)是pT-7912， ( 14)是pT-CSN5， ， ( 15)是pT-hIFA， (16) 是pCMV-hLY-GFP， (17)是pCMV/CSN2-hLY-GFP， (18)是p CMV/CSN2-hLY-hlFA， (19)
是pIRES2-AcGFP-Nuc;
圖4是制作載體過程中的電泳圖譜；其中，(1)是DNAMarkerIII (TIANGEN)(泳 道l)， PCR產(chǎn)物GFP1(泳道2)， PCR產(chǎn)物GFP2(泳道3)。箭頭A表示PCR產(chǎn)物。(2) 是D2000(TIANGEN)(泳道1)， PCR產(chǎn)物GFP1用Nhel/BamHI雙酶切(泳道2)， PCR 產(chǎn)物GFP2用Smal/ Notl雙酶切(泳道3)。箭頭A表示酶切產(chǎn)物。(3)是D15000 (TIANGEN)(泳道1)， pGFP用Nhel禾D BamHI雙酶切(泳道2)， pGFPB用Smal禾口 Notl雙酶切(泳道3)。箭頭A表示雙酶切質(zhì)粒后的小片段DNA，箭頭B表示雙酶切質(zhì) 粒后的大片段DNA。 (4)是D15000 (TIANGEN)(泳道)，pGFPB用Nhel禾口 Smal 雙酶切(泳道2)。箭頭A表示雙酶切后的DNA片段。(5)是pT-21用Smal/Nhel雙酶 切(泳道1 3)， D15000 (TIANGEN)(泳道4)。箭頭A表示雙酶切質(zhì)粒后的小片段 DNA，箭頭B表示雙酶切質(zhì)粒后的大片段DNA。 ( 6 )是GeneRuler lkb DNA Ladder (MBI) (泳道1)，質(zhì)粒pIGD用Nhel/Smal雙酶切(泳道2 4)。箭頭A表示雙酶切質(zhì)粒后的 小片段DNA，箭頭B表示雙酶切質(zhì)粒后的大片段DNA。 (7)是質(zhì)粒pIGPa用MluI/Notl 雙酶切(泳道1 4) ， GeneRuler lkb DNA Ladder (MBI)(泳道5)， 箭頭A表示雙酶切 質(zhì)粒后的小片段DNA，箭頭B表示雙酶切質(zhì)粒后的大片段DNA。 (8)是GeneRuler lkb DNA Ladder (MBI)(泳道1)， pIGPa用Nhel/Notl雙酶切(泳道2 4)，箭頭A表示雙 酶切質(zhì)粒后的小片段DNA，箭頭B表示雙酶切質(zhì)粒后的大片段DNA。 (9)是pIGPb用 Nhel/Notl雙酶切(泳道1) ， GeneRuler lkb DNA Ladder (MBI)(泳道2)， pIGPb用EcoRI 酶切(泳道3) 。 ( 10)是p3I-GFP用Sail酶切(泳道1 2) ， pIGPb不能為Sail所酶切 (泳道3 4) ， GeneRuler lkb DNA Ladder (MBI)(泳道5)。 ( 11)是GeneRuler lkb DNA Ladder (MBI)(泳道1)， p3I-GFP用Mlul酶切(泳道2)。箭頭A表示雙酶切質(zhì)粒后的 小片段DNA，箭頭B表示雙酶切質(zhì)粒后的大片段DNA。 (12)是p3I-GFPN用Sall/NotI 雙酶切(泳道l)， p3I-GFPN不能為Mlul所酶切(泳道2)， GeneRuler lkb DNA Ladder (MBI)(泳道3)。(13)是pT-7912(泳道l)， GeneRuler lkb DNA Ladder (泳道2)， pT-7912 用Not I酶切(泳道3)。 (14)是DNAMarkerIII (TIANGEN)(泳道1)， PCR產(chǎn)物CSN5， (泳道2 3)。箭頭A表示PCR產(chǎn)物。(15)是GeneRuler lkb DNA Ladder (泳道1)，用 Not I酶切自連的pGEM-Teasy載體(泳道2)， pT-CSN5，用Not I酶切(泳道3)。箭頭A 表示用Not I酶切自連的pGEM-T easy載體的產(chǎn)物，箭頭B表示用Not I酶切pT-CSN5' 的產(chǎn)物。(16)是GeneRuler lkb DNA Ladder (泳道1)， PCR產(chǎn)物溶菌酶基因(泳道 2)。箭頭A表示PCR產(chǎn)物。(17)是GeneRuler lkb DNA Ladder (泳道1)，以人基因 組為模板的PCR產(chǎn)物hIFA(泳道2 3)。箭頭A表示PCR產(chǎn)物。(18)是GeneRuler lkb
DNA Ladder (泳道1)，帶有BamHI酶切位點的PCR產(chǎn)物hIFA用BamHI酶切(泳道2 3)。箭頭A表示hIFA酶切產(chǎn)物。(19)是GeneRuler lkb DNA Ladder (泳道1)， pCMV-hLY-GFP用Nhel/Sall雙酶切(泳道2 3)。箭頭A表示雙酶切質(zhì)粒后的小片段 DNA，箭頭B表示雙酶切質(zhì)粒后的大片段DNA。 (20)是pCMV/CSN2-hLY-GFP用 Nhel/Mlul雙酶切(泳道1 2)， GeneRuler lkb DNA Ladder (泳道3)。箭頭A表示雙酶 切質(zhì)粒后的小片段DNA，箭頭B表示雙酶切質(zhì)粒后的大片段DNA。 (21)是 pCMV/CSN2-hLY-MFA不能為Smal所酶切(泳道1)， GeneRuler lkb DNA Ladder (泳道 2)， pCMV/CSN2-hLY-hlFA用BamHI酶切(泳道3)。箭頭A表示用BamHI酶切的 pCMV/CSN2-hLY-hlFA，箭頭B表示pCMV/CSN2-hLY-hlFA不能為Smal所酶切a
圖5是制作載體過程中所用細胞的照片和載體轉(zhuǎn)染細胞后的細胞熒光照片；其中，
(1)是山羊胎兒成纖維細胞；(2)是用質(zhì)粒pGFP轉(zhuǎn)染的山羊胎兒成纖維細胞顯示綠色 熒光；(3)是用質(zhì)粒pGFPB轉(zhuǎn)染的山羊胎兒成纖維細胞顯示綠色熒光(4A)是用質(zhì)粒 pIGD轉(zhuǎn)染的山羊胎兒成纖維細胞顯示綠色熒光；(4B)是用質(zhì)粒pIRES2-AcGFP-Nuc轉(zhuǎn) 染的山羊胎兒成纖維細胞顯示綠色熒光；(5)是用質(zhì)粒pIGPb轉(zhuǎn)染的山羊胎兒成纖維細 胞顯示綠色熒光；(6)是用質(zhì)粒p3I-GFP轉(zhuǎn)染的山羊胎兒成纖維細胞顯示綠色熒光；(7) 是用質(zhì)粒p3I-GFPN轉(zhuǎn)染的山羊胎兒成纖維細胞顯示綠色熒光；(8)是用質(zhì)粒pEGFP-Cl 轉(zhuǎn)染的山羊胎兒成纖維細胞顯示綠色熒光；(9)是乳腺細胞；(10)是用質(zhì)粒 pCMV/CSN2-hLY-hlFA轉(zhuǎn)染的山羊胎兒成纖維細胞用400昭/ml的Geneticin篩選；；(11) 是用質(zhì)粒pCMV-hLY-GFP轉(zhuǎn)染的山羊胎兒成纖維細胞顯示綠色熒光；(12)是用質(zhì)粒 pCMV-hLY-GFP轉(zhuǎn)染的乳腺細胞顯示綠色熒光蛋白；(13 )是用質(zhì)粒 pCMV/CSN2-hLY-GFP轉(zhuǎn)染的山羊胎兒成纖維細胞顯示綠色熒光；(14)是用質(zhì)粒 pCMV/CSN2-hLY-GFP轉(zhuǎn)染的乳腺細胞顯示綠色熒光蛋白；
圖6是制作載體過程中一些重要的DNA片段的測序圖譜。其中，圖6-1是質(zhì)粒pGFP 中的GFP基因的DNA測序圖譜；圖6-2是質(zhì)粒pGFPB中的GFP基因的DNA測序圖譜； 圖6-3是用T7 promoter對pT-7912進行的DNA測序圖譜；圖6-4是用SP6 promoter對 pT-7912的DNA測序圖譜；圖6-5是用T7 promoter對pT-hIFA中hIFA基因的DNA測 序的圖譜；圖6-6是hLY基因的測序圖譜；圖6-7 圖6-10是pCMV/CSN2-hLY-GFP 中CSN2的啟動子和到編碼信號肽DNA序列的DNA測序圖譜。
以下結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
具體實施例方式
1、試劑材料
pEGFP-Cl (clontech)、 pIRES-neo3 (clontech)、 pMD-hLY (何小寧，碩士畢業(yè)論文 《人溶菌酶基因乳腺特異性表達載體的構(gòu)建及其在小鼠乳腺癌細胞中的表達》)、山羊 胎兒成纖維細胞和乳腺細胞(劉鳳軍，碩士畢業(yè)論文《山羊體細胞核移植的研究》)由本 實驗室保存，人胎盤取自陜西醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，受孕薩能奶山羊血液采自中國克隆 羊基地，TIANamp Genomicjfe液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技 (北京)有限公司，Restriction enzymes、 DNA Taq polymerase禾Q Pfu DNA polymerase購 自MBI, dNTPs 、 T4 DNA Polymerase 、 T4DNAligase、 Klenow flagment、 Blood Genome DNA Extraction Kit、 TaKaRa LA PCRTM Kit Ver. 2.1購自寶生物公司，Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System 、 Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System和 pGEM-T easy vector購自Promega， pIRES (由于此載體中IRES序列中的堿基突變和插 入、CMV啟動子不能啟動等問題而不能用于真核表達)、pIRES2-AcGFP-Nuc購自 Clontech， IPTG購自MercK， DMEM、 DMEM/F-12、 LIPOFECTAMINE 2000、 epidermal growth factor (EGF)、 Hydrocortisone 、 trypsin禾卩Geneticin貝么J自Invitrogen, Nacl、 X-gal、 glutamine、 prolactin禾卩Insulin-transferrin-seuim貝勾自Sigma ， Tryptone、 Yeast extract敗J自 Oxoid， Agar購自Beyotime， Agrose購自Biowest， fetal bovine serum購自山東銀香偉 業(yè)集團，青霉素和鏈霉素購自哈藥總廠，PCR引物合成和測序由Invitrogen公司完成。 2、具體過程
2. 1通用型高效真核表達載體p3I-GFPN的構(gòu)建及細胞轉(zhuǎn)染
P3I-GFPN的制作流程見圖1。 2. 1. 1載體pGFP的構(gòu)建及細胞轉(zhuǎn)染
取2^1純化質(zhì)粒pEGFP-Cl(圖3-1 )為模板，以
，-CCGCTAGCGGTACCCGGGGCCACCATGGTGAGCAAG-3， (Nhe I /Kpn I /Sma I )
為上游引物，5，-GAGGATCCGCGGCCGCCTCGAGATCTGAGTCCGGAC-3， (BamH I
/Not I /Xho I )為下游引物，20nl的PCR反應(yīng)體系中各引物終濃度為0. 4pM、dNTPs 0. 4 mM、2U DNATaq polymerase; 60。C退火lmin， 72。C延伸lmin， 30個循環(huán)，擴增GFP gene, 產(chǎn)物命名為(GFP1)(圖4-1， lane2)。純化100^1的GFP1并定容到50W，取20^1的GFP1 和20pl的pEGFP-Cl分別用1.5nl的Nhel禾卩1.5pl的BamH I在37。C水浴中雙酶切24h， 電泳并膠回收pEGFP-Cl骨架載體G.9kb處)禾B GFP1 (0.78kb處)(圖4-2， lane2) 后純化定容到2(Hd，按h 7的比例混合骨架載體和目的片段后添加lpl的T4 DNA Ligase buffer和1^1的T4DNALigase，總體積為10pl， 4'C連接24h。將10|_il連接載體加入到 200^1的感受態(tài)DH5 a中，(TC冰浴30min、 42。C熱激90sec、再(TC冰浴2min，加入800plLB溶液后在37'C中孵育45min，平板培養(yǎng)、挑取單克隆擴大培養(yǎng)、質(zhì)粒提取后用Nhe 1/BamHl雙酶切(圖4-3，lane2)和測序鑒定(圖6-1 )，載體命名為pGFP (圖 3-4)。
山羊胎兒成纖維細胞(圖5-1)用含10%胎牛血清、2mM的谷氨酰胺、各100U/ml 的青霉素和鏈霉素、10ng/ml表皮生長因子的DMEM/F-12培養(yǎng)，當細胞皿底80%被鋪滿 后用0. 1°/。胰蛋白酶液消化傳代。細胞轉(zhuǎn)染前先將欲轉(zhuǎn)染的細胞消化后鋪于24孔板中， 用上述培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜，再用無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)6h。
以pEGFP-Cl為陽性對照、超純水為陰性對照，取純化的無蛋白無RNA污染的800ng pGFP質(zhì)粒與50jil的DMEM混合，取3jal LIPOFECTAMINE 2000與50^1的DMEM混 合，5min內(nèi)將上述兩種溶液混合，室溫下放置20min后加到無血清無抗生素的DMEM 液培養(yǎng)的細胞中混合，5h后替換成含血清和抗生素的細胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染24h后用熒光顯 微鏡檢測細胞表達的熒光蛋白(圖5-2)。 2.1. 2載體pGFPB的構(gòu)建及細胞轉(zhuǎn)染
取 2pl 純 化 質(zhì) 粒 pGFP 為 模 板 ， 以
5'-TACCCGGGATGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT-3， (Sraal) 為上游引物，以
5，-TTJGCGGCCGC|TCACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3， (Not I ) 為下游引物，PCR 反應(yīng)體系同上；6(TC退火lfflin， 72。C延伸lmin， 30個循環(huán)，擴增GFP gene，產(chǎn)物命名 為 (GFP2)(圖4-1， lane3)。純化100pl的GFP2并定容到50^1，取20pl的GFP2和 20^1的pGFP分別用1.5pl的Sma I和1.5^1的Not I先30。C雙酶切18h再37。C雙酶切 10h，電泳、膠回收pGFP骨架載體(3.9kb處)和GFP2 (0.75kb處)(圖4-2，lane3)、 純化并定容到20nl，按1:7的比例混合骨架載體和目的片段后添加1^1的T4 DNALigase buffer和1^1的T4 DNA Ligase，總體積lOjil， 4。C連接24h。 10pl連接載體熱激轉(zhuǎn)化感 受態(tài)DH5 a 、平板培養(yǎng)、挑取單克隆擴大培養(yǎng)，質(zhì)粒提取后用Sma I /Not I雙酶切(圖 4-3, lane3)和測序鑒定(圖6-2)，載體命名為pGFPB (圖3-5)。
pGFPB轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞(圖5-3)，并以pGFP為陽性對照，方法與pGFP 的細胞轉(zhuǎn)染相同。
2丄3載體pIGD的構(gòu)建及細胞轉(zhuǎn)染
取 2^1 純 化質(zhì) 粒 pIRES-neo3 為 模板， 以
;，-ATGCTAGCGGTACCACGCGTGAATTAATTCGCTGTCTG-3， (Nhe I /Kpn I /Mlu I )
為上游引物，以5，-AT|CCCGGG|TTGTGGCAAGCTTATCATCGTGTTTTTC-3, (Sma I ) 為下游引物，PCR反應(yīng)體系同上，62。C退火lmin， 72。C延伸lmin， 30個循環(huán)，擴增IVS
和IRES，產(chǎn)物命名為21。純化10(^1的21并定容到20^1，取3jal純化的PCR產(chǎn)物21進 行TA克隆、熱激轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a并用藍白斑篩選，挑取白斑進行單克隆擴大培養(yǎng)并 提取質(zhì)粒，用Nhe I /Sma I先30。C雙酶切14h再37°C 8h雙酶切并進行電泳分析(如圖 4-5， lanel 3)，質(zhì)粒命名為pT_2I (圖3-6)。取的pT-21和20pl的pGFPB分 別用1.5^1的Nhe I和1.5^1的Sma I先3(TC雙酶切18h再37。C雙酶切10h，電泳并膠 回收pGFPB骨架載體(4.7kb處)(圖4-4， lane2)和pT-2I中的目的條帶(0.9kb處)， 純化后各自定容到20pl， T4DNALigase連接骨架載體和目的片段，連接載體熱激轉(zhuǎn)化 感受態(tài)DH5a、平板培養(yǎng)、挑取單克隆擴大培養(yǎng)、質(zhì)粒提取后用Nhe I/Sma I雙酶切鑒 定(圖4-6， lane2 4)，載體命名為pIGD (圖3-7)。
pIGD轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞(圖5-4A)，以pGFPB、pIRES2-AcGFP-Nuc (圖5-4B) 為陽性對照，方法同上。
2丄4載體pIGPa和pIGPb的構(gòu)建及細胞轉(zhuǎn)染
取20pl的pIGD和20pl的pIRES (由于IRES處序列突變和插入、CMV啟動子無 法起到啟動作用而不能用于真核表達)分別用2^1的Mlu I和1. 5pl的Not I在37°。水 浴中雙酶切24h，電泳并膠回收pIRES骨架載體(5.5kb處)和21與GFP gene連接的片 段(1.7kb處)，純化后定容到20pl，用T4DNALigase連接骨架載體和目的片段，連接 載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 a 、平板培養(yǎng)、挑取單克隆擴大培養(yǎng)、質(zhì)粒提取后用Mlu I/Not I 雙酶切鑒定(圖4-7， lanel 4)，載體命名為pIGPa。取1. 5^1的Nhe I和1. 5^1的Not
I分別雙酶切的pIGPa和20^1的pIGD， 37'C酶切24h，電泳后膠回收pIGD骨架 載體(4.9kb處)和pIGPa中的目的片段(1.7kb處)(圖4-8， lane2 4)，純化并定容到 20^1，用T4 DNA Ligase連接骨架載體和目的片段，連接載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 a 、平板 培養(yǎng)、挑取單克隆擴大培養(yǎng)，質(zhì)粒提取后用Nhe I /Not I雙酶切(圖4-9， lanel)和EcoR
I單酶切鑒定(圖4-9， lane3)，載體命名為pIGPb (圖3-8)。
pIGPb轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞(圖5-5)，以pIGD、 pIRES2-AcGFP-Nuc為陽性對 照，方法同pGFP的細胞轉(zhuǎn)染。 2. 1. 5載體p3I-GFP的構(gòu)建及細胞轉(zhuǎn)染
取 2^1 純化質(zhì)粒 pIRES-neo3 為 模板， 以
;<formula>formula see original document page 15</formula>為下游引物，PCR反應(yīng)體系不變；64。C退火30sec， 72。C 延伸20sec， 30個循環(huán)，擴增長度為0. 3kb的IVS。純化100^1的IVS并定容到50pl。
各取1.5^1的Nhe I和Xho I雙酶切20pl的pIGPb和各取1.5pl的Xba I /Xho I雙酶切 20pl的IVS， 37。C酶切24h，電泳并膠回收pIGPb骨架載體(5.6kb處)和IVS (0.3kb 處)和純化成20^1， T4 DNALigase連接骨架載體和目的片段后熱激轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 a 、 平板培養(yǎng)、挑取單克隆擴大培養(yǎng)、質(zhì)粒提取后用Sal I酶切鑒定(圖4-10， lanel 2)， 載體命名為p3I-GFP (圖3-9)。
p3I-GFP轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞(圖5-6)，以pIGPb、 pIRES2-AcGFP-Nuc為陽 性對照，方法同pGFP的細胞轉(zhuǎn)染。 2.1.6載體p3I-GFPN的構(gòu)建及細胞轉(zhuǎn)染
取20|^1的p3I-GFP用2^1的Mlu I在37。C酶切36h，電泳并膠回收一條為4. 0kb的 骨架載體和一條為1.9kb的目的條帶(圖4-11， lane2)，各自純化并定容到20pl。各取 7^1的骨架載體和目的條帶并分別添加1^1的klenow flagment、 1^1的klenow flagment buffer和1^1的dNTP， 37。C反應(yīng)8h，取其中的骨架載體溶液l)il、目的片段7pl混合， 再添加的T4 DNALigase buffer和1^1的T4DNALigase，總體積為10pl。 4。C連接 24h后熱激轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a、平板培養(yǎng)、挑取單克隆擴大培養(yǎng)、質(zhì)粒提取后分別用 Mlul、 Sal I/Not I酶切鑒定(圖3-12)，載體命名為p3I-GFPN (圖3-10)。
p3I-GFPN轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞(圖5-7)，以p3I-GFP、 pIRES2-AcGFP-Nuc為 陽性對照，方法同pGFP的轉(zhuǎn)染。
2. 2抗乳腺炎轉(zhuǎn)基因載體pCMV/CSN2-hLY-WFA的構(gòu)建及細胞轉(zhuǎn)染
pCMV/CSN2-hLY-hlFA的制作流程見圖2。 2.2.1 e-酪蛋白啟動子區(qū)及其部分外顯子的克隆
根據(jù)血液基因組提取試劑盒說明書從新鮮的懷孕薩能奶山羊血液中提取基因組 DNA，電泳檢測后取2pl作為模板；根據(jù)GeneBank中山羊P -酪蛋白的序列號AF409096 設(shè)計上游引物5'-AGAGGTCAAGGATGCTGCTAAACATTCTACAACAC-3，和下游引物 5'-TTGCCAATAGTTACCAGTCAGTACATAGCCACATT-3，； 20^1的PCR反應(yīng)體系中引物 終濃度為0. 4pM、 dNTPs 0. 4 mM、 2U LA Taq polymerase; 56。C退火lmin， 72。C延伸 8min， 30個循環(huán)，擴增從289bp處到7912處長為7.6kb的5'端的山羊e -酪蛋白DNA序 列。100pl的PCR產(chǎn)物電泳并膠回收和純化成20^1，取純化的PCR產(chǎn)物3^1進行TA克隆、 熱激發(fā)轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a并用藍白斑篩選，挑取白斑進行單克隆擴大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒， 用Notl酶切并進行電泳分析(圖4-13， lane3)，對酶切后的DNA序列長度正確的載體 進行兩端測序鑒定(圖6-3 4)并命名為pT-7912 (圖3-13)。取2^1 pT-7912質(zhì)粒為 為模板，設(shè)計上游引物5'-TTGCTAGCTCAGCAGGGGTTGGTGGTGGACAGGAAAGC-3'
(Nhe I ) 和下游引物5'-TTACGCGTTGCAATGGCCAGAGCCACCAGACAGGC-3' (Mlul)，反應(yīng)體系同上；58。C退火lmin， 72。C延伸3min， 30個循環(huán)，擴增CSN2的 啟動子區(qū)及到編碼信號肽的DNA序列，即e -酪蛋白的3566bp處到6644bp處，擴增長度 為3kb (圖4-14)。純化100^1的PCR產(chǎn)物并定容到20pl，取3plPCR產(chǎn)物(CSN5')再 次TA克隆，經(jīng)一系列操作后提取質(zhì)粒，Notl酶切鑒定(圖4-15， lane3)，載體命名為 pT-CSN5，(圖3-14)。
2.2.2人溶菌酶基因和人干擾素-a基因的克隆
取2pl純化質(zhì)粒pMD-hLY (圖3-11)為模板，根據(jù)人溶菌酶基因的GeneBank中 序列號 NM000239 設(shè)計上游引 物
;'-TTGCTAGCACGCGTGTCAACATGAAGGCTCTCATTGTTC墨3， (Nhe I /Mlu I )禾口下
游引物S'-TTlGTCGAClTTACACTCCACAACCTTGAACATACTGACGG-S, (Sal I )， 20^1 的PCR反應(yīng)體系中各引物終濃度為0. 4pM、 dNTPs 0.4 mM、 2U DNATaq polymerase; 6(TC退火30sec，72。C延伸45sec，30個循環(huán)，擴增人溶菌酶基因的編碼框序列(圖4-16)。 10(^1的PCR產(chǎn)物純化成20pl的溶液，取3pl進行TA克隆、轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 a 、藍白斑 篩選和單克隆擴大培養(yǎng)，質(zhì)粒提取后用NheI和SalI進行酶切鑒定，載體命名為pT-hLY (圖3-12)。
用TIANamp Genomic—血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒從人胎盤組織中提 取基因組DNA，并取2pl作模板；根據(jù)人干擾素a在GeneBank中的序列號NM—024013 設(shè)計上游引物 5'-GCAATATCTACGATGGCCTC-3' 和下游引物 5'-TTACGCGGACCAGATGT TATTCCTTCCTC-3'， PCR反應(yīng)體系中同上；45。C退火30sec， 72。C延伸45sec， 30個循環(huán)，擴增人干擾素a基因的編碼框序列(圖4-17)。 10(^1的 PCR產(chǎn)物純化成2(^1的溶液，取3^1進行TA克隆后轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 a ,經(jīng)一系列操作后 用EcoR I進行酶切電泳和測序鑒定(圖6-5)，結(jié)果與預(yù)想一致，載體命名為pT-hIFA(圖 3-15)。再設(shè)計上游引物5'-ATGATGGCCTCGCCCTTTGCTTT-3'和下游引物
5'陽TTJGGATCClGATGTTATTCCTTCCTC CTT-3' (BamH I )進行PCR， 5(TC退火30sec， 72'C延伸45sec， 30個循環(huán)，以2^1的pT-WFA為模板擴增帶有BamH I酶切位點的人 干擾素a基因。100pl的PCR產(chǎn)物純化成50^1。 2. 2. 3 pCMV/CSN2-hLY-hlFA載體的構(gòu)建及細胞轉(zhuǎn)染
Nhe I /Sal I各1.5pl于37。C雙酶切20^1的p3I-GFPN和20pl的pT-hLY 24h，電泳 和膠純化p31-GFPN骨架載體(6.0kb)和溶菌酶基因(0.45kb)并各自定容到204。取1^1 純化的p31-GFPN骨架載體和7jxl純化的溶菌酶基因，添加lpl的T4 DNA Ligase buffer
和lpl的T4DNALigase， 4'C連接24h后熱激轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 a 、平板培養(yǎng)、單克隆擴 大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒后用Nhe I/Sal I雙酶切(圖4-19)和測序鑒定(圖6_6)，載體命名 為pCMV-hLY-GFP (圖3-16)。 各取1.5pl的Nhe I /Mul I在37。C雙酶切20)al的 pCMV-hLY-GFP和各取1.5pl的Nhe I /Mul I /EcoR I在37。C三酶切20^1的pT-CSN5'， 電泳膠回收和純化pCMV-hLY-GFP的載體骨架(6.4kb處)和pT-CSN5'的目的片斷(3.0kb 處)，用T4DNALigase連接骨架載體和目的片段。經(jīng)一系列操作后，質(zhì)粒提取并用Nhe I /Mul I雙酶切(圖4-20)和測序鑒定(圖6-7 10)，載體命名為pCMV/CSN2-hLY-GFP (圖3-17)。 各取1.5pl Sma I /BamH I雙酶切20^1的質(zhì)粒pCMV/CSN2-hLY-GFP和取 1.5pl的BamH I單酶切的帶有BamH I酶切位點的PCR擴增的hIFA基因，經(jīng)電 泳回收pCMV/CSN2-hLY-GFP的骨架載體(8.7kb處)和酶切后的hIFA (0.6kb處)(圖 4-18)， T4 DNALigase連接骨架載體和目的片段后經(jīng)一系列操作和質(zhì)粒提取，用Sma I 、 BamH I兩種單酶切鑒定重組(圖4-21 )，載體命名為pCMV/CSN2-hLY-hlFA (圖3-18)。 2. 2.4細胞轉(zhuǎn)染
乳腺細胞(圖5-9)用含10%胎牛血清、2mM的谷氨酰胺、各100U/ml的青霉素和 鏈霉素、10ng/ml表皮生長因子、10ng/ml氫化可的松、5ng/ml胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒鈉的 DMEM/F-12培養(yǎng)，當細胞成團鋪在皿底后用0. 1%胰蛋白酶液消化傳代。乳腺細胞轉(zhuǎn)染 與山羊胎兒成纖維細胞一致。
質(zhì)粒pCMV-hLY-GFP， pCMV/CSN-hLY-GFP轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞和乳腺細胞 (圖5-ll 圖5-14)。吸取3ml添加了 400ng/ml的促乳素的乳腺細胞培養(yǎng)液放入滅菌過 的5ml離心管中，用未高壓滅菌的干凈槍頭反復吹打5次，并在空氣中暴露1小時； pCMV/CSN2-hLY-hlFA轉(zhuǎn)染乳腺細胞，轉(zhuǎn)染6小時后用上述處理的培養(yǎng)液培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細胞， 并以未轉(zhuǎn)染的乳腺細胞和山羊胎兒成纖維細胞為對照；轉(zhuǎn)染72小時后在高倍顯微鏡下觀 察發(fā)現(xiàn)未轉(zhuǎn)染的乳腺細胞和山羊胎兒成纖維細胞培養(yǎng)孔中均有泳動的細菌，而轉(zhuǎn)染 pCMV/CSN2-hLY-hlFA的乳腺細胞培養(yǎng)孔中未見到細菌，證明該轉(zhuǎn)基因載體的確具有抗菌 溶菌的作用。pCMV/CSN2-hLY-hIFA轉(zhuǎn)染的山羊胎兒成纖維細胞用含400ug/ml的 Geneticin細胞培養(yǎng)液篩選，得到陽性抗性細胞(圖5_10)。
綜上所述，該載體的確可用于乳腺炎的基因防治。
體
核苷酸序列表
<110〉
西北農(nóng)林科技大學
〈120〉通用型高效真核表達載體p3I-GFPN及采用該載體構(gòu)建的抗乳腺炎的轉(zhuǎn)基因載
<160〉2
<210〉1
<211〉5934
〈212〉DNA
<213>人工序列
〈220>
<223〉
〈400〉1
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca
gacgtcaata atgggtggag aagtacgccc catgacctta catggtgatg atttccaagt ggactttcca acggtgggag taattcgctg gacttctgcg
CgCggtgETtg
gtcaagcttg cactttgcct aagtcgetctc tggggtgagt
tccatctggt atctggccat actcccaggt cccccccccc ccggtgtgcg ggcccggaaa caaaggaatg
gtgcctctgc gtgccacgtt caac鄉(xiāng)ggg tcggtgcaca ccacggggac atggtgagca ggcgacgtaa
tatttacggt aaactgccca cctattgacg tcaatgacgg tgggactttc ctacttggca cggttttggc agtacatcaa ctccacccca ttgacgtcaa aaatgtcgta acaactccgc gtctatataa gcagagctgg tctgcgaggg ccagctgttg ctaagattgt cagtttccaa cctttg鄉(xiāng)g tggccgcgtc aggtgtggca ggcttg卿t t.tctctccac aggtgtccac gagaattcac gcgcgcgtga
cttggcagta t助atggccc gtacatctac tgggcgtgga tgggagtttg cccattgacg tttagtgaac gggtgagtac aaacgaggag catctggtca ctggccatac tcccaggtcc
catcaagtgt gcctggcatt gtattagtca tagcggtttg ttttggcacc caaatgggcg cgtcagatcc tccctctcaa gatttgatat gaa^agacaEi acttgagtga aactgcaggt tgtctgcgag
atcatatgcc atgcccagta tcgctattac actcacgggg
gtaggcgtgt gctagagaat aagcgggcat tcacctggcc tctttttgtt caatgacatc cggctagctt ggccagctgt
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60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 ■ 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980
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2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740
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7920 7980 8040 8100 8160 8220 8280 8340 8400 8460 8520 8580 8640 8700 8760 8820 8880 8940 ■0 9060 9120 9180 9240 9300 931權(quán)利要求
1.一種通用型高效真核表達載體p3I-GFPN，其特征在于，其DNA序列如下TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGAGAATTAATTCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATGACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGCGGTGATGCCTTTGAGGGTGGCCGCGTCCATCTGGTCAGAAAAGACAATCTTTTTGTTGTCAAGCTTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGGTCGGCTAGCTTAAGTCGACTCGAGAATTCACGCGCGCGTGAATTAATTCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATGACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGCGGTGATGCCTTTGAGGGTGGCCGCGTCCATCTGGTCAGAAAAGACAATCTTTTTGTTGTCAAGCTTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGGTCGAGCATGCATCTAGGGCGGCCAATTCCGCCCCTCTCCCCCCCCCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAAGCTTGCCACAACCCGGGATGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGAGCGGCCGCGGATCCACCGGATCTAGATAACTGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAACGCGCGCGTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTCCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAGATCGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCTAGGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGTGTTGGGTCGTTTGTTCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATACCCCACCGAGACCCCAT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2. —種由權(quán)利要求1所述的通用型高效真核表達載體p3I-GFPN構(gòu)建的抗乳腺炎轉(zhuǎn) 基因載體pCMV/CSN2-hLY-hlFA,其特征在于，其DNA序列如下<formula>formula see original document page 3</formula><formula>formula see original document page 4</formula><formula>formula see original document page 5</formula><formula>formula see original document page 6</formula>
全文摘要
本發(fā)明公開了一種通用型高效真核表達載體p3I-GFPN及采用該載體構(gòu)建的抗乳腺炎的轉(zhuǎn)基因載體，本發(fā)明構(gòu)建的抗乳腺炎轉(zhuǎn)基因載體pCMV/CSN2-hLY-hIFA，在乳腺細胞中能高水平表達綠色熒光蛋白，在泌乳期的乳腺細胞中，由于CSN2的啟動子發(fā)揮了啟動作用，使轉(zhuǎn)pCMV/CSN2-hLY-hIFA的乳腺細胞分泌大量的人溶菌酶和人干擾素A，在通過乳汁分離獲得目的蛋白的同時又能較好的防治家畜乳腺炎。
文檔編號C12N15/79GK101186925SQ200710019050
公開日2008年5月28日 申請日期2007年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月12日
發(fā)明者劉鳳軍, 孫達權(quán), 東 張, 涌 張, 鷺 楊, 陳興啟 申請人:西北農(nóng)林科技大學