專利名稱：一種利用糖蜜原料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用糖蜜原料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的方法，屬生物制造技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
琥珀酸(succsinic acid)，又稱丁二酸，分子式為C4H6O4，分子量為118.09，是一種常見的天然有機酸，廣泛存在于人體、動物、植物和微生物中。
琥珀酸是工業(yè)上一種重要的四碳化合物，它作為有機合成原材料、中間產(chǎn)物或?qū)I(yè)化學(xué)制品廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、香料、油漆、塑料和材料工業(yè)。其最大的市場是用于表面活性劑、清潔劑、綠色溶劑、離子鰲合劑、生物可降解塑料等領(lǐng)域。其在食品行業(yè)中作為酸化劑、pH改良劑、風(fēng)味物質(zhì)和抗菌劑，以及作為原料或中間體用于醫(yī)藥、抗生素、氨基酸和維生素的生產(chǎn)(ApplMicrobiol Biotechnol，51545-552，1999)。目前，發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸和它大多數(shù)衍生物的合成還處在進(jìn)一步研究和開發(fā)階段。
目前已開發(fā)出多項技術(shù)將琥珀酸轉(zhuǎn)化為重要的工業(yè)化學(xué)品，包括N-甲基吡咯烷酮、1，4-丁二醇、四氫呋喃、γ-丁內(nèi)酯、PBT樹脂、己二酸等。其中許多化工產(chǎn)品目前都是以苯為原料合成的，苯是石油或煤化工產(chǎn)品，資源緊缺，不可再生?，F(xiàn)報道大約有250種以苯為原料的化工產(chǎn)品可以通過琥珀酸為原料來生產(chǎn)。因此，全球?qū)︾晁岬男枨蟛粩嘣黾印?br> 工業(yè)上琥珀酸的生產(chǎn)方法主要為化學(xué)方法，主要有石蠟氧化法、輕油氧化法、丁烷氧化法、丁二腈水解法、催化加氫法以及以乙烯和一氧化碳為原料的電解氧化法。目前，國內(nèi)外主要使用的是催化加氫法。以化學(xué)方法獲得琥珀酸，不可避免地要消耗大量不可再生的化石原料，還具有轉(zhuǎn)化率低，易污染環(huán)境等弊端。
琥珀酸的生產(chǎn)可通過發(fā)酵方法來進(jìn)行，由于化石原料的日趨減少，用微生物發(fā)酵碳水化合物生產(chǎn)琥珀酸的方法日益受到人們的重視。由于發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸是以可再生糖源(如葡萄糖)和二氧化碳作為主要原料，因此微生物發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸，具有成本低和擺脫對石化原料依賴的優(yōu)點，而且開辟了溫室氣體二氧化碳利用的新途徑，更加顯示了環(huán)境友好特征。
琥珀酸是繼檸檬酸后最具市場潛力的發(fā)酵有機酸產(chǎn)品之一，但目前都還是用化學(xué)方法生產(chǎn)。根據(jù)美國Michigan大學(xué)MBI研究所的估計，在未來幾年內(nèi)，琥珀酸的總需求將達(dá)到100萬噸的水平。
目前文獻(xiàn)報道的發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸研究用培養(yǎng)基原料多為葡萄糖，無論是牛瘤胃中分離的Actinobacillus succinogenes、基因工程構(gòu)建的大腸桿菌Escherichia coli生產(chǎn)琥珀酸的方法都是如此。使用價格低廉的碳源是降低發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸成本的一個關(guān)鍵因素。目前，已有一些利用不同原料發(fā)酵生成琥珀酸的報道，比如美國Argonne在網(wǎng)上報道了從玉米(淀粉水解液)生產(chǎn)化學(xué)品琥珀酸的消息(www.ipd.anl.gov/biotech/index.html)，日本三菱化學(xué)和味之素公司也聯(lián)合開發(fā)了采用以玉米淀粉為原料發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸(http://www.bio168.com，2005)，但還未查到相關(guān)的研究文獻(xiàn)。韓國Lee PC等與Kim DY等先后報道了Mannheimia succiniciproducens MBEL55E發(fā)酵乳清原料和發(fā)酵木漿水解液生產(chǎn)琥珀酸。發(fā)酵乳清原料產(chǎn)琥珀酸15.5g/L，對消耗糖產(chǎn)率和生產(chǎn)強度為93％和0.24g/L·h(Appl Microbiol Biotechnol 5423-27，2000)。用NaOH預(yù)處理過的木漿水解液培養(yǎng)基分批發(fā)酵積累琥珀酸11.73g/L，對消耗糖產(chǎn)率和生產(chǎn)強度分別為56％和1.17g/L·h(Enzyme and Microbial Technology，35648-653，2004)。本發(fā)明人從瘤胃中篩選的琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes CGMCC1593，它能發(fā)酵的糖質(zhì)原料包括葡萄糖，果糖，麥芽糖，D-木糖，蔗糖，乳糖，半乳糖，乳清，及木薯、玉米、甜菜或木質(zhì)纖維素的水解物或糖漿(中國專利CN200610038113.6)，后來研究發(fā)現(xiàn)它也很適宜于發(fā)酵糖蜜原料生產(chǎn)琥珀酸。
糖蜜是制糖工業(yè)的副產(chǎn)品，又被稱為廢糖蜜，包括甘蔗糖蜜與甜菜糖蜜，它含有大約40～50％總糖(主要成份是蔗糖、葡萄糖和果糖)，在發(fā)酵工業(yè)中作為較廉價的碳源原料。它與葡萄糖或淀粉水解液比較，價格低廉，已經(jīng)廣泛用于酵母、酒精、乳酸、檸檬酸、核黃素及多糖等產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)。到目前為止，工業(yè)上還沒有利用糖蜜原料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的實例。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用廉價糖蜜原料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的方法。
技術(shù)方案利用糖蜜原料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的方法，是用琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC1593在含有50～100g/L還原糖的糖蜜及其它營養(yǎng)物組成的培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸。
以下是本發(fā)明方法的詳細(xì)描述。
糖蜜原料的預(yù)處理將糖蜜(含量約400～600g/L總還原糖)稀釋到200～300g/L的糖濃度，然后采用硫酸、活性炭或離子交換樹脂等方法進(jìn)行處理。
預(yù)處理后的糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸菌株琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC1593。
種子培養(yǎng)基的組成為(每L)葡萄糖5～15g，酵母膏1～10g，K2HPO4·3H2O0.5～2.0g，NaH2PO4·2H2O 0.2～2.0g，混合維生素1～10ml，pH 6.0～7.0?；旌暇S生素組成為B12 5mg，B6100mg，葉酸20mg，核黃素20mg，硫胺素20mg，煙酸，20mg，泛酸50mg，對氨基苯甲酸50mg，1000ml水。維生素等熱敏性材料配制后用0.2μm微濾膜除菌，接種前加入。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為(每L)糖蜜(含總還原糖計)50～100g，酵母膏10～20g，玉米漿10～20g，MgCl20.1～0.5g，Na2HPO4·12H2O 1～5g，NaH2PO4·2H2O 1～5g，起始pH 5.5～7.5。
種子培養(yǎng)在150ml厭氧瓶中進(jìn)行，裝液20～80ml。發(fā)酵在150ml厭氧瓶或5L～25L攪拌發(fā)酵罐(New Brunswich 110，New Brunswick Scientific，Edison，NJ，USA)中進(jìn)行。種子和發(fā)酵培養(yǎng)基的滅菌溫度為115～121℃，15min。
將實驗菌株接種到種子培養(yǎng)基中，于30～40℃在充滿CO2的環(huán)境中靜止或震蕩培養(yǎng)16～40h。
按1％～10％的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在充滿CO2或N2氣體的環(huán)境下，30～40℃靜止或震蕩(或攪拌)厭氧發(fā)酵30～60h，并用氨水、碳酸鹽或堿溶液調(diào)節(jié)維持發(fā)酵液pH5.5～7.5。
所用糖蜜原料為制糖工業(yè)的廢糖蜜，包括甘蔗糖蜜及甜菜糖蜜。將原糖蜜稀釋到200～300g/L的糖濃度，然后用硫酸溶液調(diào)節(jié)pH2～4酸化處理，離心取上清液用NaOH調(diào)pH6.5；或采用離子交換樹脂處理加732型陽離子樹脂到200～300g/L糖濃度的稀釋糖蜜中，處理后過濾除去樹脂，再用NaOH調(diào)pH6.5。
分析方法將培養(yǎng)液離心，采用高效液相色譜法分析上清液中的琥珀酸等代謝產(chǎn)物及糖類物質(zhì)。采用美國Waters高效液相色譜儀，Waters RI檢測器，Breeze色譜工作站。其中，琥珀酸，乙酸，乳酸和甲酸等有機酸的測定使用Aminex HPX-87H離子色譜柱(300mm×7.8mm，9μm；Bio-Rad Chemical Division，Richmond，Calif.)，流動相8mM硫酸；柱溫55℃；流速0.5ml/min；進(jìn)樣量10μL。葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、乳糖和麥芽糖等糖類含量的測定采用Zobax NH2氨基柱(250mm×4.6mm，5μm；Agilent，USA)，流動相75％乙腈；流速1ml/min進(jìn)樣量10μL。
糖蜜總還原糖測定采用DNS法，測定時選用葡萄糖為還原糖標(biāo)準(zhǔn)物。
琥珀酸的對糖產(chǎn)率定義為每消耗1克還原糖所能產(chǎn)生的琥珀酸克數(shù)，并以百分?jǐn)?shù)表示。
糖利用率定義為消耗糖所占投入糖的百分比(對于糖蜜，所述的糖以總還原糖計算)。
有益效果
本發(fā)明利用從瘤胃中篩選的琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenesCGMCC1593，它也很適宜于發(fā)酵糖蜜原料，用其發(fā)酵糖蜜生產(chǎn)琥珀酸的產(chǎn)物濃度，對糖產(chǎn)率和生產(chǎn)強度分別達(dá)到30～60g/L，70％～84％和0.9～1.2/L·h，糖利用率90％～95％，很適用于低成本琥珀酸的工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明突出的優(yōu)點是利用廉價糖蜜原料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸，糖蜜作為一種價格低廉的粗原料可以替代純葡萄糖作為碳源用來發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸，是一種利用可再生原料的生產(chǎn)方法，可緩解化學(xué)合成琥珀酸的石化資源緊張問題，對環(huán)境友好。并且由于糖蜜中還含有一些可供微生物利用的氮源與其他營養(yǎng)成份，因而也能夠顯著減少發(fā)酵的培養(yǎng)基成本。
具體實施例方式
以下是琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC1593利用糖蜜原料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的實施例。但本發(fā)明并不限于所列出的幾個實例。
實施例1種子培養(yǎng)基(每L)葡萄糖5g，酵母膏5g，K2HPO4·3H2O 1.0g，NaH2PO4·2H2O1.0g，混合維生素1ml，pH7.0。37℃厭氧培養(yǎng)24h。
發(fā)酵培養(yǎng)基(每L)處理甘蔗糖蜜(總還原糖)65g，酵母膏15g，玉米漿20g，MgCl20.2g，Na2HPO4·12H2O 1.5g，NaH2PO4·2H2O 1.5g，pH 6.5。37℃厭氧培養(yǎng)48h。
糖蜜的處理方法如下首先，將原糖蜜(約510g/L還原糖)用自來水稀釋到300g/L的糖濃度(以下簡稱稀釋后的糖蜜)，然后分別采用以下方法進(jìn)行處理。
(1)硫酸處理稀釋后的糖蜜用1mol/L的硫酸溶液調(diào)節(jié)pH3.5，靜止6h，離心，取上清液用5mol/L的NaOH調(diào)pH6.5。
(2)亞鐵氰化鉀處理將0.1g亞鐵氰化鉀加入到100ml稀釋后的糖蜜中，用5mol/L的NaOH調(diào)pH6.5，煮沸30min，離心，取上清液待用。
(3)活性炭處理將5g顆?；钚蕴技尤氲?00ml稀釋后的糖蜜中，50℃處理15min，過濾除去活性炭，用5mol/L的NaOH調(diào)pH6.5。
(4)大孔吸附樹脂處理取處理后的大孔吸附樹脂(型號D4006)10g，加入到100ml稀釋后的糖蜜中，搖床振蕩6h(30℃，250rpm)，過濾除去樹脂，用5mol/L的NaOH調(diào)pH6.5。
(5)732強陽離子樹脂處理取處理后的732型陽離子樹脂10g，加入到100ml稀釋后的糖蜜中，搖床振蕩6h(30℃，250rpm)，過濾除去樹脂，用5mol/L的NaOH調(diào)pH6.5。
表1不同處理糖蜜方法對琥珀酸發(fā)酵的影響(在厭氧瓶中發(fā)酵)

比較以上五種處理方法，其中以硫酸處理和732陽離子樹脂處理兩種方法的處理效果較好，糖利用率有較大提高，而其它幾種方法處理效果不顯著。經(jīng)過硫酸處理后的甘蔗糖蜜，以65g/L的初糖濃度發(fā)酵48h，能夠產(chǎn)生50.1g/L的琥珀酸，對消耗糖產(chǎn)率81.6％，糖利用率達(dá)94.5％，生產(chǎn)強度1.04g/L·h，發(fā)酵產(chǎn)量比使用未處理甘蔗糖蜜提高13.3％。
實施例2按實施例1方法，在厭氧瓶發(fā)酵實驗中，使用硫酸處理甘蔗糖蜜，初始還原糖濃度為65g/L，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入不同的無機和有機氮源(其總含氮量基本相似)，其含量分別為(每L)NH4Cl 5.3g、KNO39.6g、蛋白胨12g、玉米漿(固形物≥55％)25g、酵母膏15g和干酵母粉12g。其各種氮源對發(fā)酵甘蔗糖蜜生產(chǎn)琥珀酸的影響見表2所示。
表2添加不同氮源對發(fā)酵甘蔗糖蜜生產(chǎn)琥珀酸的影響(在厭氧瓶中發(fā)酵)

比較以上幾種氮源，其中以酵母膏最好，當(dāng)酵母膏濃度為15g/L時，琥珀酸產(chǎn)量達(dá)到49.7g/L，對消耗糖產(chǎn)率81.2％，糖利用率達(dá)94.1％，生產(chǎn)強度1.03g/L·h。
實施例3按實施例1方法，在厭氧瓶發(fā)酵實驗中，使用硫酸處理甘蔗糖蜜，初始還原糖濃度分別為35，50，65，80，100g/L時，結(jié)果如表3所示表3不同初始還原糖濃度對發(fā)酵甘蔗糖蜜生產(chǎn)琥珀酸的影響(厭氧瓶發(fā)酵)

由上表可以看出，以初始還原糖濃度為65g/L時琥珀酸的產(chǎn)量為最高，達(dá)到50.6g/L，琥珀酸對消耗糖產(chǎn)率83.70％，糖利用率93.0％，生產(chǎn)強度1.05g/L·h。
實施例4按實施例1方法，使用硫酸處理甘蔗糖蜜，初始還原糖濃度為65g/L，在5L攪拌發(fā)酵罐(New Brunswich 110，New Brunswick Scientific，Edison，NJ，USA，使用兩組圓盤六平直葉渦輪攪拌漿)中進(jìn)行分批發(fā)酵。接種量5％，發(fā)酵溫度37℃，攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，通氣為100％CO2。實驗結(jié)果如表4所示表4 5L攪拌發(fā)酵罐分批發(fā)酵甘蔗糖蜜生產(chǎn)琥珀酸結(jié)果

實施例5
按實施例4方法，使用硫酸處理甜菜糖蜜，初始還原糖濃度為65g/L，在5L攪拌發(fā)酵罐中進(jìn)行分批發(fā)酵。實驗結(jié)果如表5所示實驗結(jié)果如表5所示表5 5L攪拌發(fā)酵罐分批發(fā)酵甜菜糖蜜生產(chǎn)琥珀酸結(jié)果

實施例6在5L攪拌罐中分別進(jìn)行處理甘蔗糖蜜的補料分批發(fā)酵，初始還原糖濃度為35g/L，當(dāng)發(fā)酵液殘?zhí)墙禐?0g/L時，用蠕動泵以一定速度流加總還原糖濃度為300g/L的糖蜜溶液將發(fā)酵液中的糖濃度控制在10～15g/L。實驗結(jié)果如表6所示表6 5L攪拌發(fā)酵罐補料分批發(fā)酵甘蔗糖蜜生產(chǎn)琥珀酸結(jié)果

補料分批發(fā)酵，48h總投入糖蜜還原糖濃度按最終體積計為86.1g/L，發(fā)酵剩余還原糖濃度為8.6g/L，產(chǎn)琥珀酸55.1g/L，對消耗糖產(chǎn)率71.10％，糖利用率90.0％，生產(chǎn)強度1.15g/L·h。
實施例7在25L規(guī)模的攪拌罐(鎮(zhèn)江東方生物工程公司發(fā)酵罐)上進(jìn)行補料分批發(fā)酵，發(fā)酵條件同實施例6。與實施例6不同的是，補料采用的是間歇補料，分別于發(fā)酵12、19、25、36小時分四次補入已滅菌的含糖300g/L補料培養(yǎng)液約600ml。實驗結(jié)果如表7所示表7 25L攪拌發(fā)酵罐補料分批發(fā)酵甘蔗糖蜜生產(chǎn)琥珀酸結(jié)果

總投入糖蜜還原糖濃度按最終體積計為68g/L，發(fā)酵48h，產(chǎn)丁二酸44.1g/L，生產(chǎn)強度0.92g/L·h，對消耗糖產(chǎn)率82.90％，糖利用率78.24％。延長發(fā)酵至60h時產(chǎn)丁二酸達(dá)到48.2g/L，對消耗糖產(chǎn)率83.68％，糖利用率84.71％。
實施例8按實施例6方法，發(fā)酵液含丁二酸55.1g/L，乙酸8.77g/L，甲酸2.68g/L。將發(fā)酵液加熱90℃以上30min，然后離心，去除菌體及蛋白，得到預(yù)處理液。取上述發(fā)酵預(yù)處理液1000ml(測定預(yù)處理后發(fā)酵液含丁二酸58.96g/L)，在不斷攪拌下，加40％CaCl2溶液，50～80℃下進(jìn)行鈣化2～5h，將濾餅丁二酸鈣配成濃度30％左右的溶液，在60～80℃下，緩慢滴加25％硫酸進(jìn)行酸解，過濾、并水洗濾餅硫酸鈣，酸解濾液用0.1％～2％的活性炭，70～80℃，脫色30～60min，過濾得脫色濾清液于70～80℃，0.08～0.1MPa真空下濃縮后，置冰箱中冷卻析出結(jié)晶，濾出濕晶于60～65℃烘箱干燥得到白色粗晶，干重40.15g，測其純度含丁二酸96.99％，計算總提取收率66.05％。樣品經(jīng)HPLC檢測為一單峰，證明無雜酸，紅外光譜與標(biāo)準(zhǔn)品一致。
權(quán)利要求
1.一種利用糖蜜原料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的方法，其特征是琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC1593在含有50～100g/L還原糖的糖蜜及其它營養(yǎng)物組成的培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所用糖蜜原料經(jīng)過簡單的硫酸酸化或離子交換樹脂預(yù)處理，能夠顯著提高發(fā)酵液中琥珀酸的產(chǎn)量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是發(fā)酵培養(yǎng)基組成以每L計為糖蜜以含總還原糖計50～100g，酵母膏10～20g，玉米漿10～20g，MgCl20.1～0.5g，Na2HPO4·12H2O 1～5g，NaH2PO4·2H2O 1～5g，培養(yǎng)基起始pH5.5～7.5，培養(yǎng)溫度30～40℃，厭氧發(fā)酵30～60h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是發(fā)酵在充滿CO2或N2的厭氧條件下進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是發(fā)酵過程中，用氨水、碳酸鹽或堿溶液調(diào)節(jié)，維持發(fā)酵液pH 5.5～7.5。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是糖蜜原料為制糖工業(yè)的廢糖蜜，包括甘蔗糖蜜以及甜菜糖蜜。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是糖蜜原料采用硫酸酸化處理將原糖蜜稀釋到糖濃度為200～300g/L，然后用硫酸溶液調(diào)節(jié)pH2～4，離心取上清液用NaOH調(diào)pH6.5；或采用離子交換樹脂處理將原糖蜜稀釋到糖濃度為200～300g/L，然后加732型陽離子樹脂處理，過濾除去樹脂，再用NaOH調(diào)pH6.5。
全文摘要
一種利用糖蜜原料發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的方法，屬生物制造技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明使用發(fā)明人從瘤胃中篩選得到的微生物琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC1593，在含CO
文檔編號C12R1/01GK101092638SQ20071001968
公開日2007年12月26日 申請日期2007年1月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月31日
發(fā)明者孫志浩, 鄭璞, 劉宇鵬 申請人:江南大學(xué)