專(zhuān)利名稱(chēng)：水稻hpfr基因、表達(dá)產(chǎn)物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水稻hpfr基因、表達(dá)產(chǎn)物及其用途，屬農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，用于防治植物病蟲(chóng)害、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和提高作物產(chǎn)量。
背景技術(shù)：
hrp基因是植物病原細(xì)菌中決定在非寄主植物上激發(fā)過(guò)敏反應(yīng)(hypersensitiveresponse，HR)和在寄主植物上致病性的基因[Lindgren P B，The role of hrp genes duringplant-bacterial interaction.Annu Rev Phytopathol，1997，35129～152]。過(guò)敏反應(yīng)是植物產(chǎn)生的一種局部的、快速的細(xì)胞編程死亡(programmed cell death，PCD)形式。PCD可以引發(fā)一種或多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑，賦予植物多種抗環(huán)境脅迫能力。
國(guó)內(nèi)外對(duì)植物病原細(xì)菌的hrp基因做了較詳細(xì)的研究。Wei等人首次發(fā)現(xiàn)梨火疫病菌Erwinia amylovora的hrpN基因編碼的一種新蛋白質(zhì)能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，并將其命名為Harpin。該蛋白質(zhì)的特點(diǎn)是富含甘氨酸和缺乏半胱氨酸，熱穩(wěn)定，具有誘導(dǎo)植物產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)、誘導(dǎo)抗病和促進(jìn)作物生長(zhǎng)等生物活性[Wei Z M，Laby R J，Zumoff C H，et al.Harpin，elicitor of the hypersensitive response produced by the plant pathogen Erwinia amylovora.Science，1992.25785～88]?，F(xiàn)已陸續(xù)從丁香假單胞菌Pseudomonas syringae和黃單胞菌Xanthomonasoryzae等多種植物病原細(xì)菌中鑒定出具有harpin活性的蛋白質(zhì)。它們是由相應(yīng)的植物病原細(xì)菌hrp基因簇中特定hrp基因編碼的。
聞偉剛等從水稻白葉枯病菌X.oryzae pv.oryzae中克隆了hrp基因，即hrfAXoo基因，該基因核苷酸序列大小為420bp，編碼產(chǎn)物harpinXoo分子量為15.6kD，該蛋白質(zhì)具有harpins的功能注射煙草可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)；在體外噴霧處理植物可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性和促進(jìn)作物生長(zhǎng)等[聞偉剛，邵敏，陳功友，王金生，水稻白葉枯病蛋白質(zhì)激發(fā)子誘導(dǎo)植物的防衛(wèi)反應(yīng).農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2003，11(2)192～197]。表達(dá)該蛋白質(zhì)的基因工程菌株已經(jīng)正在進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化研究與開(kāi)發(fā)，相關(guān)的研究已經(jīng)申請(qǐng)國(guó)家專(zhuān)利保護(hù)[專(zhuān)利號(hào)ZJ00135403.5]；將hrfAXoo基因轉(zhuǎn)化水稻，具有提高水稻對(duì)稻瘟病、白葉枯病的抗性[邵敏，王金生，轉(zhuǎn)hrfAXoo基因水稻對(duì)白葉枯病的抗性，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)2004，27(4)36-40]，相關(guān)研究已受?chē)?guó)家專(zhuān)利保護(hù)[專(zhuān)利號(hào)ZL 02157213.5.]。因此，植物病原細(xì)菌中的hrp基因及其應(yīng)用研究得較多，但植物中類(lèi)似于harpin編碼基因及其應(yīng)用研究至今尚未有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題 本發(fā)明的目的是提供水稻中的hpfr基因、表達(dá)產(chǎn)物及其用途。來(lái)自于水稻的hpfr基因的表達(dá)產(chǎn)物，防治植物病害、促進(jìn)作物生長(zhǎng)。
技術(shù)方案本發(fā)明所提供的基因具有以下特征
1.水稻hpfr基因來(lái)源設(shè)計(jì)引物5’-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3’和5’-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3’，用PCR方法從水稻中擴(kuò)增出該片段。該基因片段命名為hpfr基因(圖1)。以hpfr基因?yàn)樘结?，與水稻基因組總DNA雜交，雜交結(jié)果顯示，在水稻基因組中有雜交陽(yáng)性信號(hào)(圖2)。
2.水稻hpfr基因的核苷酸序列水稻hpfr基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.1(圖3)確定該基因大小為405bp，起始密碼子處存在EcoRI酶切位點(diǎn)GAATTC，編碼區(qū)域富含GGT或GGC示編碼甘氨酸(glycine，G)的密碼子(陰影區(qū))，有4個(gè)GGCGGC重復(fù)區(qū)域(方框區(qū))。ATG示起始密碼子，TAA示終止子。
3.水稻hpfr基因編碼的推導(dǎo)氨基酸序列水稻hpfr基因編碼的推導(dǎo)氨基酸序列為SEQ IDNO.2(圖4)，根據(jù)hpfr基因的核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列為134個(gè)氨基酸。富含甘氨酸(陰影區(qū))，不含半光氨酸。
4.水稻hpfr基因體外表達(dá)將水稻hpfr基因構(gòu)建于蛋白質(zhì)體外高效表達(dá)載體pET30a(+)形成重組質(zhì)粒pETR(圖5)，產(chǎn)生水稻hpfr基因的體外表達(dá)產(chǎn)物，命名為hpfr蛋白質(zhì)，其特征類(lèi)似于harpinxoo的功能能夠誘導(dǎo)非寄主植物煙草在24小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)(圖6)、親水性、對(duì)熱穩(wěn)定性、對(duì)蛋白酶敏感性，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳，確定該蛋白質(zhì)的分子量約為14.5kD(圖7)。
5.水稻hpfr蛋白質(zhì)的理化特性hpfr蛋白質(zhì)經(jīng)100℃水浴10min后，仍然能夠在24h內(nèi)激發(fā)煙草產(chǎn)生過(guò)敏性反應(yīng)，活性也沒(méi)有明顯的下降；用蛋白酶水解30min后則完全喪失了激發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的能力，這表明hpfr蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定，但對(duì)蛋白酶敏感。
6.水稻hpfr基因的表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用水稻hpfr基因的表達(dá)產(chǎn)物hpfr蛋白質(zhì)配制成適當(dāng)濃度，在作物的不同生長(zhǎng)季節(jié)用于作物葉面噴施，也可以用于作物移栽時(shí)浸根處理，防治植物病害、促進(jìn)作物生長(zhǎng)。
7.來(lái)源于植物的與上述水稻hpfr基因的同源序列hpfx基因，其特征在于，用水稻hpfr基因引物5’-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3’和5’-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3’，以植物的基因組DNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增出hpfx基因，PCR擴(kuò)增條件94℃/5min的1個(gè)循環(huán)，94℃/45sec+60℃/45sec+72℃/45sec的35個(gè)循環(huán)，72℃/7min的1個(gè)循環(huán)；hpfx基因編碼產(chǎn)物具有誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)反應(yīng)、激發(fā)植物產(chǎn)生抗性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能。hpfx基因所編碼的產(chǎn)物為hpfx蛋白質(zhì)。
8、來(lái)源于小麥的與水稻hpfr基因的同源序列hpfw基因，其序列為SEQ ID NO.3，其推導(dǎo)的氨基酸序列為SEQ ID NO.4，hpfw基因編碼產(chǎn)物hpfw蛋白質(zhì)具有誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)、激發(fā)植物產(chǎn)生抗性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能。
有益效果本發(fā)明人將hrfAXoo基因轉(zhuǎn)化水稻[邵敏，王金生，轉(zhuǎn)hrfAXoo基因水稻對(duì)白葉枯病的抗性，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27(4)36-40]，在轉(zhuǎn)基因水稻分子檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)水稻中存在與hrfAXoo基因同源序列，并將其克隆和在體外表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物具有誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)、激發(fā)植物產(chǎn)生抗性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)等功能，在植物中發(fā)現(xiàn)類(lèi)似于harpin編碼基因尚屬首次。
本發(fā)明為水稻中與水稻白葉枯病菌(X.oryzae pv.oryzae)的hrp基因同源序列、表達(dá)產(chǎn)物及其用途，來(lái)源于水稻的hrp基因同源序列表達(dá)產(chǎn)物與水稻黃單胞菌hrp基因的編碼產(chǎn)物harpinXoo有相似的功能，所以將該基因命名為hpfr(hrp-like function loci in rice)基因。該基因大小為405bp。
本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)hpfr基因在體外的表達(dá)產(chǎn)物與水稻黃單胞菌的hrp基因表達(dá)產(chǎn)物有相似的功能，即促進(jìn)植物生長(zhǎng)、誘導(dǎo)抗病蟲(chóng)性等，本發(fā)明已從水稻中克隆了hpfr基因，并構(gòu)建至表達(dá)載體中，獲得表達(dá)產(chǎn)物。
研究結(jié)果表明，hpfr蛋白質(zhì)處理煙草有明顯誘導(dǎo)煙草抗TMV的能力(圖8)。將hpfr蛋白質(zhì)處理的番茄、辣椒長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于未處理(圖9)，采摘期提前1周左右hpfr蛋白質(zhì)處理番茄產(chǎn)量比未處理提高40.3％，辣椒提高31.6％。番茄上病毒病害發(fā)生明顯減輕(圖10)。
用hpfw蛋白質(zhì)噴霧處理番茄，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能(圖14)，同時(shí)，明顯減少番茄早疫病的發(fā)生；用該蛋白質(zhì)噴霧處理黃瓜，對(duì)黃瓜霜霉病有較好的防治效果(表2)。
四

圖1水稻hpfr基因PCR擴(kuò)增電泳2水稻hpfr基因?yàn)樘结樑c水稻基因組總DNA雜交結(jié)果M-Marker，hplr-hplr基因陽(yáng)性對(duì)照，1、2、3-水稻基因組總DNA圖3水稻hpfr基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1圖4水稻hpfr基因推導(dǎo)氨基酸序列SEQ ID NO.2圖5水稻hpfr基因構(gòu)建于pET30a(+)上酶切電泳6水稻hpfr蛋白質(zhì)誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)A-BL21(DE3)/pETR的粗蛋白質(zhì)抽提物，B-BL21(DE3)/pET30(a)的粗蛋白質(zhì)抽提物C-H2O圖7水稻hpfr蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳圖M-Marker，1.BL21(DE3)/pETR提取的CFEP，2.純化的水稻hpfr蛋白質(zhì)圖8 BL21(DE3)/pETR表達(dá)水稻hpfr蛋白質(zhì)誘導(dǎo)煙草抗TMV圖9水稻hpfr蛋白質(zhì)葉面噴施番茄、辣椒促進(jìn)生長(zhǎng)圖10水稻hpfr蛋白質(zhì)葉面噴施番茄減輕病毒病害發(fā)生圖11小麥hpfw基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.3圖12小麥hpfw基因推導(dǎo)氨基酸序列SEQ ID NO.4圖13小麥hpfw蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳14小麥hpfw蛋白質(zhì)誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)A-BL21(DE3)/pETW的粗蛋白質(zhì)抽提物，B-BL21(DE3)/pET30(a)的粗蛋白質(zhì)抽提物C-H2O
圖15小麥hpfw蛋白質(zhì)葉面噴施番茄促進(jìn)生長(zhǎng)五具體實(shí)施方式
實(shí)施例11.水稻hpfr基因的發(fā)現(xiàn)與克隆根據(jù)水稻黃單胞菌白葉枯病致病變種hrfAXoo基因開(kāi)放閱讀框設(shè)計(jì)水稻hpfr基因引物5’-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3’和5’-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3’，用PCR方法從水稻中擴(kuò)增出來(lái)源于水稻中hpfr基因。PCR擴(kuò)增條件94℃/5min的1個(gè)循環(huán)，94℃/45sec+60℃/45sec+72℃/45sec的35個(gè)循環(huán)，72℃/7min的1個(gè)循環(huán)。將該基因片段命名為hpfr基因(圖1)。以水稻hpfr基因?yàn)樘结?，與水稻基因組總DNA雜交，雜交結(jié)果顯示，在水稻基因組中有雜交陽(yáng)性信號(hào)(圖2)。
2.水稻hpfr基因的體外表達(dá)PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)NdeI和BamHI酶切，連接于表達(dá)載體pET30a(+)上，獲得重組質(zhì)粒為pETR[pET30a(+)∷hpfr](圖5)。將pETR轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得重組微生物BLTR[BL21(DE3)/pET30a(+)∷hpfr]，在將重組微生物BLTR的單菌落接種20ml的LB+Km20μg/ml中37℃下振蕩培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接于20ml的LB+Km 20μg/ml中37℃下振蕩培養(yǎng)3h，將1M的IPTG(TaKaRa公司)加入其中，使其終濃度為1mM，繼續(xù)培養(yǎng)2h。離心(5000rpm，10min)收集菌體。菌體于100℃水浴煮沸10min，冷卻后離心(12000rpm，10min)，取上清(Cell-free ElicitorProtein，CFEP)，注射煙草葉片葉肉組織細(xì)胞中，24h內(nèi)產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)(圖6)。取上清液3μl進(jìn)行12％SDS-PAGE電泳，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分子量推算，水稻hpfr蛋白質(zhì)的分子量約為14.5kD(圖7)。
3.實(shí)驗(yàn)室小計(jì)量生產(chǎn)水稻hpfr蛋白質(zhì)將重組微生物BLTR9的單菌落接種20ml的LB+Km20μg/ml中37℃下振蕩培養(yǎng)12h，轉(zhuǎn)接于5L的玉米粉發(fā)酵培養(yǎng)基(味精1％，酵母膏1％，玉米粉3.5％)+Km 20μg/ml中37℃下發(fā)酵培養(yǎng)3h，加乳糖(終濃度為10mM)誘導(dǎo)培養(yǎng)2h。離心(5000rpm，10min)收集菌體。菌體于100℃水浴煮沸10min，冷卻后離心(12000rpm，10min)，取上清，即為水稻hpfr蛋白質(zhì)。1L玉米粉發(fā)酵培養(yǎng)基大約可以產(chǎn)生1.5g hpfr蛋白質(zhì)。
實(shí)施例2水稻hpfr基因表達(dá)產(chǎn)物hpfr蛋白質(zhì)的直接使用水稻hpfr基因的表達(dá)產(chǎn)物hpfr蛋白質(zhì)按15、30、60μg/ml的濃度對(duì)植物進(jìn)行葉面噴灑。
1.誘導(dǎo)Xanthi煙草對(duì)TMV的抗性表型將水稻hpfr和harpinXoo蛋白質(zhì)的CFEP母液分別稀釋至濃度為15、30、60μg/ml，用微型噴霧器噴施成株期珊西煙，每處理5個(gè)重復(fù)；16h后，用摩擦接種活化的TMV于煙草葉片上；4天后觀測(cè)結(jié)果，并統(tǒng)計(jì)病斑數(shù)。研究結(jié)果表明，水稻hpfr和harpinXoo處理煙草，都有明顯誘導(dǎo)煙草抗TMV的能力(枯斑數(shù)目上的減少)(圖8)。經(jīng)LSD法多重比較分析(F189.464)表明，BL21(DE3)/pETR和BL21(DE3)/pET30a(+)∷hrfAXoo的蛋白質(zhì)抽提物處理與pET30(a)/BL21(DE3)蛋白質(zhì)抽提物對(duì)照相比差異極顯著(表1)。在濃度為60uL/mL時(shí)誘導(dǎo)抗病性效果最顯著，水稻hpfr蛋白質(zhì)的防效為96.35％，與harpinXoo防效(95.9％)相近。
2.促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量將水稻hpfr蛋白質(zhì)CFEP母液稀釋至濃度為60μg/ml；在番茄、辣椒大棚，分別在苗期、花期和座果期噴施，研究結(jié)果表明，處理的番茄、辣椒長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于未處理(圖9)，采摘期提前1周左右水稻hpfr蛋白質(zhì)處理番茄產(chǎn)量比未處理提高40.3％，辣椒提高31.6％。番茄上病毒病害發(fā)生明顯減輕(圖10)。
表1 BL21(DE3)/DETR9表達(dá)水稻hpfr蛋白質(zhì)誘導(dǎo)煙草抗TMV的效果

*P＜0.01水平上的差異顯著性來(lái)源于植物的與上述水稻hpfr基因的同源序列統(tǒng)一命名為hpfx基因，其特征在于，用實(shí)施例1水稻hpfr基因引物，以植物的基因組DNA為模板，用PCR方法(方法同實(shí)施例1)擴(kuò)增出hpfx基因，其編碼產(chǎn)物具有誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)、激發(fā)植物產(chǎn)生抗性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能。hpfx基因所編碼的產(chǎn)物統(tǒng)一命名為hpfx蛋白質(zhì)。
下面實(shí)施例以小麥為例，從小麥中獲得與水稻hpfr基因同源的基因?yàn)閔pfw，表達(dá)產(chǎn)物為hpfw蛋白質(zhì)。
實(shí)施例3小麥中與水稻hpfr基因同源hpfw基因克隆與表達(dá)1.小麥hpfw基因克隆與核苷酸序列用設(shè)計(jì)引物5’-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3’和5’-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3’，用PCR方法(方法同實(shí)施例1)從小麥中擴(kuò)增與水稻hpfr基因同源基因，命名為hpfw基因。hpfw基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.3(圖11)，大小為414bp，與水稻hpfr基因的同源性為93％。hpfw基因推導(dǎo)氨基酸序列為SEQ ID NO.4(圖12)。
2.小麥hpfw基因的體外表達(dá)和小計(jì)量生產(chǎn)hpfw蛋白質(zhì)(方法同實(shí)施例1)將小麥hpfw基因連接于表達(dá)載體pET30a(+)上，獲得重組表達(dá)載體pETW9[pET30a(+)∷hpfw]，通過(guò)大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)的產(chǎn)物，命名為hpfw蛋白質(zhì)。該經(jīng)12％SDS-PAGE電泳，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的分子量推算，小麥hpfw蛋白質(zhì)的分子量約為14.8kD(圖12)。
3.小麥hpfw蛋白質(zhì)的生物活性小麥hpfw蛋白質(zhì)注射煙草葉片葉肉組織細(xì)胞中，24h內(nèi)激發(fā)煙草產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)(圖13)；用該蛋白質(zhì)噴霧處理番茄，結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能(圖14)，同時(shí)，明顯減少番茄早疫病的發(fā)生；用該蛋白質(zhì)噴霧處理黃瓜，對(duì)黃瓜霜霉病有較好的防治效果(表2)。
表2.小麥hpfw蛋白質(zhì)對(duì)作物病害的防治效果(相對(duì)防效，％)

序列表<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>水稻hpfr基因、表達(dá)產(chǎn)物及其應(yīng)用<130>說(shuō)明書(shū)<140>00<141>2007-02-05<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>405<212>DNA<213>Oryza sativa(水稻)<220>
<221>gene<222>(1)..(405)<223>
<400>1atgaattctt tgaacacaca attcggcggc agcacgtcca accttcaggt tggcccaagc60caggacacaa cgttcggttc gaaccagggc ggcaaccagg gcatctcgga aaagcaactg120gaccagttgc tgtgccagct catctcggcc ctgcttcagt cgagcaaaaa tgctgaggag180ggtaagggtc agggtggcga taatggcggt ggccagggcg gcaatcagca ggccgggaag240gagaatggcg cctcgccact cacccagatg ctgatgaata tcgtcggaga gattctccag300gcgcagaatg gtggtggtgc cggtggtgcc ggcggcagca gcggcggcga ctttggtggc360agtttcgcca gcagcttctc gaacgacagc gcatcaatgc agtaa405<210>2<211>134<212>PRT<213>Oryza sativa(水稻)<220>
<221>水稻hpfr基因表達(dá)的氨基酸序列<222>(1)..(134)<223>富含苷氨酸<400>2Met Asn Ser Leu Asn Thr Gln Phe Gly Gly Ser Thr Ser Asn Leu Gln1 5 10 15Val Gly Pro Ser Gln Asp Thr Thr Phe Gly Ser Asn Gln Gly Gly Asn20 25 30Gln Gly Ile Ser Glu Lys Gln Leu Asp Gln Leu Leu Cys Gln Leu Ile35 40 45Ser Ala Leu Leu Gln Ser Ser Lys Asn Ala Glu Glu Gly Lys Gly Gln50 55 60Gly Gly Asp Asn Gly Gly Gly Gln Gly Gly Asn Gln Gln Ala Gly Lys65 70 75 80Glu Asn Gly Ala Ser Pro Leu Thr Gln Met Leu Met Asn Ile Val Gly85 90 95Glu Ile Leu Gln Ala Gln Asn Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly100 105 110Ser Ser Gly Gly Asp Phe Gly Gly Ser Phe Ala Ser Ser Phe Ser Asn115 120 125
Asp Ser Ala Ser Met Gln130 134<210>3<211>414<212>DNA<213>小麥(Triticum aestivum)<220>
<221>小麥hpfw基因<222>(1)..(414)<223>
<400>3atgaactctt tgaacacaca attcggcggc agcgcgtcca acttccaggt tgaccaaagc60cagaacgcgc aatccgattc gagccagggc agcaatggca gccagggtat ctcggaaaag120caactggacc agttgctgtg ccagctcatc tcggccctgc ttcagtcgag caaaaatgct180gaggagggta agggtcagca gggtggcgag aatggcggtg gccagggcgg caatcagcag240gccgggaagg agaatggcgc ctcgccactc acccagatgc tgatgaatat cgtcggagag300attctccagg cgcagaatgg tggtggtgcc ggtggtgccg gcggcagcag cggcggcgac360tttggtggca gtttcgccag cagcttctcg aacggaagcg catcaatgca gtaa 414<210>4<211>137<212>PRT<213>小麥(Triticum aestivum)<220>
<221>小麥hpfw氨基酸<222>(1)..(137)<223>
<400>4Met Asn Ser Leu Asn Thr Gln Phe Gly Gly Ser Ala Ser Asn Phe Gln1 5 10 15Val Asp Gln Ser Gln Asn Ala Gln SerAsp Ser Ser Gln Gly Ser Asn20 25 30Gly Ser Gln Gly Ile Ser Glu Lys Gln Leu Asp Gln Leu Leu Cys Gln35 40 45Leu Ile Ser Ala Leu Leu Gln Ser Ser Lys Asn Ala Glu Glu Gly Lys50 55 60Gly Gln Gln Gly Gly Glu Asn Gly Gly Gly Gln Gly Gly Asn Gln Gln65 70 75 80Ala Gly Lys Glu Asn Gly Ala Ser Pro Leu Thr Gln Met Leu Met Asn85 90 95Ile Val Gly Glu Ile Leu Gln Ala Gln Asn Gly Gly Gly Ala Gly Gly100 105 110Ala Gly Gly Ser Ser Gly Gly Asp Phe Gly Gly Ser Phe Ala Ser Ser115 120 125Phe Ser Asn Gly SerAla Ser Met Gln130135 137<210>5<211>33<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>水稻hpfr基因引物左序列
<222>(1)..(33)<223>
<400>5ggaattccat atgaactctt tgaacacaca att 33<210>6<211>31<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>水稻hpfr基因引物右序列<222>(1)..(31)<223>
<400>6cgggatccta ttactgcatt gatgcgcttc c 3權(quán)利要求
1.水稻hpfr基因，其序列為SEQ ID NO.1。
2.權(quán)利要求1所述水稻hpfr基因編碼的推導(dǎo)氨基酸序列為SEQ ID NO.2。
3.權(quán)利要求1所述水稻hpfr基因的表達(dá)產(chǎn)物，命名為hpfr蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的分子量為14.5kDa。
4.權(quán)利要求3所述水稻hpfr基因的表達(dá)產(chǎn)物在防治植物病害、促進(jìn)作物生長(zhǎng)方面的應(yīng)用。
5.來(lái)源于植物的與權(quán)利要求1所述水稻hpfr基因同源的序列hpfx基因，其特征在于，用水稻hpfr基因引物5’-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3’和5’-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3’，以植物的基因組DNA為模板，用PCR方法擴(kuò)增出hpfx基因，PCR擴(kuò)增條件94℃/5min的1個(gè)循環(huán)，94℃/45sec+60℃/45sec+72℃/45sec的35個(gè)循環(huán)，72℃/7min的1個(gè)循環(huán)；hpfx基因編碼產(chǎn)物具有誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)、激發(fā)植物產(chǎn)生抗性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能。
6.權(quán)利要求5所述hpfx基因所編碼的產(chǎn)物hpfx蛋白質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的hpfx基因，其特征在于，來(lái)源于小麥的與權(quán)利要求1所述水稻hpfr基因的同源序列hpfw基因，其序列為SEQ ID NO.3，推導(dǎo)的氨基酸序列為SEQ IDNO.4，小麥hpfw基因編碼產(chǎn)物hpfw蛋白質(zhì)具有誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)、激發(fā)植物產(chǎn)生抗性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能。
全文摘要
本發(fā)明涉及水稻hpfr基因、表達(dá)產(chǎn)物及其用途，屬農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，用于防治植物病蟲(chóng)害、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和提高作物產(chǎn)量。本發(fā)明為水稻hpfr基因，是首次從植物中發(fā)現(xiàn)具有類(lèi)似植物病原細(xì)菌hrp基因功能的基因序列，編碼產(chǎn)物具有激發(fā)子的功能，在煙草上產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和提高農(nóng)作物產(chǎn)量等，由于hpfr基因來(lái)源于植物，表達(dá)產(chǎn)物hpfr蛋白質(zhì)通過(guò)高效表達(dá)載體與微生物發(fā)酵產(chǎn)生，是經(jīng)濟(jì)環(huán)保的生物農(nóng)藥，可以用于大田和保護(hù)地植物病蟲(chóng)害防治和提高產(chǎn)量。本發(fā)明還提供了小麥hpfw基因，其表達(dá)產(chǎn)物hpfw蛋白質(zhì)具有誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)、激發(fā)植物產(chǎn)生抗性和促進(jìn)植物生長(zhǎng)功能。
文檔編號(hào)C12N15/82GK101037697SQ20071002034
公開(kāi)日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2007年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月14日
發(fā)明者邵敏, 高學(xué)文, 黃萬(wàn)春, 郭玲, 王金生 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)