專利名稱：鎂離子調控的新型表達載體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體是涉及一種受鎂離子調控的表達載體。
背景技術：
大腸桿菌的原核表達系統(tǒng)是目前基因工程研究中應用最為廣泛的一種蛋白表達手段，它具有基因操作簡單，宿主菌株和質粒選擇面廣，細菌易于生長和控制等特點。pET系列是常用的一種原核表達系統(tǒng)，它通過調節(jié)T7RNA聚合酶的表達來控制T7啟動子的活性，該系統(tǒng)轉錄功能強大，但同時存在需外源添加誘導劑，短時間內高效表達易形成包涵體的缺點。該問題也在其它原核表達系統(tǒng)中存在。因此，一種能自我誘導表達目的基因的原核載體有待研究和開發(fā)。

發(fā)明內容
為了解決pET系列原核表達系統(tǒng)存在需外源添加誘導劑，短時間內高效表達易形成包涵體的不足，本發(fā)明的目的是提供一種能自我誘導表達目的基因的原核載體。
本發(fā)明的目的通過以下技術方案得以實現一種鎂離子調控的表達載體，其特征在于，該載體為pYS，它含有鎂離子(Mg2+)運輸蛋白基因mgtC/B的啟動子序列(Pmgt)。
一種受鎂離子調控的重組質粒載體，其特征在于，待表達的基因被整合進上述受鎂離子調控的表達載體pYS中。
本發(fā)明的表達載體經實驗驗證利用紅色熒光蛋白(DsRed-Express)基因作為報告分子，結果發(fā)現在大腸桿菌中Pmgt僅在培養(yǎng)基中Mg2+耗盡后開始啟動報告基因的表達，而外源添加Mg2+后Pmgt的啟動子活性則被有效抑制。這說明通過改變培養(yǎng)基中Mg2+的濃度來控制目的基因的表達成為可能，利用培養(yǎng)基中Mg2+自然耗盡的情況下自動誘導表達目的基因將會在一定程度上簡化原核表達的操作。在Mg2+自然耗盡的情況下Pmgt的活性漸進式提高，目的產物也是逐步積累(圖2a)，這將有助于避免表達產物在短時間內迅速聚集形成包涵體。
本發(fā)明的有益效果體現在將鼠傷寒沙門氏菌Mg2+運輸蛋白基因mgtC/B的啟動子Pmgt應用于大腸桿菌原核表達系統(tǒng)的優(yōu)化，構建了一種受培養(yǎng)基中Mg2+濃度調控的，無需外源添加誘導劑的通用型原核表達質粒pYS，為大腸桿菌原核表達系統(tǒng)的改進和發(fā)展提供了新的方法。


下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明。
圖1是本發(fā)明的鎂離子調控型原核表達質粒圖譜；圖2是鼠傷寒沙門氏菌Pmgt在大腸桿菌中的誘導活性；具體實施方式
在本發(fā)明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。
下面結合具體的實施例，并參照數據進一步詳細地描述本發(fā)明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現時標明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均與首次標明的內容相同。
質粒和菌株質粒pDsRed-Express購自美國BD Biosciences Clontech公司，pET-30a(+)和pGEM-T載體分別購自Novagen和Promega公司。鼠傷寒沙門氏菌X4550(Cya-Crp-Asd-R+M+)為美國Washington大學Dr.Roy Curtiss惠贈，本室保存，并向公眾發(fā)布20年。大腸桿菌DH5α購自深圳晶美生物公司。
試劑和儀器Pfu DNA聚合酶，dNTP，卡那霉素(美國Promega公司)；T4 DNA連接酶和凝膠DNA回收試劑盒(美國Roche公司)，Wizard Plus DNA抽提試劑盒(美國Promega公司)。用超純水配制成LB液體培養(yǎng)基(每升含tryptone 10g，yeast extract 5g，NaCl 10g，pH7.2)。AAS 300原子吸收光譜分析儀(美國Perkin Elmer公司)，UV240型紫外可見分光光度計(日本島津公司)，流式細胞儀FACSCalibur(美國Becton-Dickson公司)。
實施例1鼠傷寒沙門氏菌Pmgt的克隆及其在大腸桿菌中的誘導活性質粒的構建采用引物P1、P2從鼠傷寒沙門氏菌X4550基因組中擴增出長約600bp的片段，連入pGEM-T載體，測序證實與GenBank中鼠傷寒沙門氏菌的Pmgt[序列號M57715]完全相同。然后用限制性內切酶Bst1107 I和Xba I切下Pmgt裝入相同酶切的pET-30a(+)載體，新質粒命名為pYS，它去除了原先載體中的lac I基因和T7啟動子序列。用Nco I和EcoR I切下質粒pDsRed-Express上的DsRed基因裝入pYS的相應位點構建pYS-DsRed(圖1)。(P15’-GTATACTCCGGAGCAAACGCCTGAACTCCC-3’[Bst1107 I]，P25’-AGATCTGGAAGAATAAGTACGTGCTATATTTAG-3’[Xba I])Pmgt誘導活性測定試驗將pYS-DsRed轉化進大腸桿菌DH5α。將重組菌單菌落接種5ml LB液體培養(yǎng)基(含50μg/mL卡那霉素，添加或不添加鎂離子)，37℃220r/min震搖培養(yǎng)，在不同時間段測定600nm波長處菌液的吸光度和原子吸收光譜測定Mg2+的濃度，并同時吸取100μl樣品，PBS洗滌兩次后，用流式細胞儀測定細菌的熒光強度(FL-2 channel)。
結果顯示在LB液體培養(yǎng)基中，DH5α(pYS-DsRed)進入對數期(1-2小時)后開始表達紅色熒光蛋白，并隨著培養(yǎng)時間的延長表達量增大，在重組菌進入對數后期(＞8小時)后達到最大(圖2a)。同步進行的Mg2+濃度監(jiān)測顯示紅色熒光蛋白的表達與培養(yǎng)基中Mg2+的耗盡相一致(圖2a)，這提示Mg2+的缺乏誘發(fā)了Pmgt的啟動。
為進一步證實Mg2+在Pmgt調控中的作用，我們測試Pmgt的活性能否被外源Mg2+抑制。圖2b顯示在添加10mmol/L的MgCl2LB液體培養(yǎng)基中，紅色熒光蛋白的表達被完全抑制。
以上結果說明鼠傷寒沙門氏菌Mg2+運輸蛋白基因mgtC/B的啟動子Pmgt的活性在大腸桿菌中受外源Mg2+濃度的調控，與在鼠傷寒沙門氏菌中的結果一致。
本發(fā)明不限于這些公開的實施方案，本發(fā)明將覆蓋在專利書中所描述的范圍，以及權利要求范圍的各種變型和等效變化。
權利要求
1.一種鎂離子調控的表達載體，其特征是，該載體為pYS，它含有鎂離子運輸蛋白基因mgtC/B的啟動子序列。
2.一種重組質粒載體，其特征在于，待表達的基因被整合進權利要求1所說的鎂離子調控的表達載體中。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體是涉及一種受鎂離子調控的新型表達載體。所說的鎂離子調控的表達載體，其特征在于，該載體為pYS，它含有鎂離子運輸蛋白基因mgtC/B的啟動子序列Pmgt。本發(fā)明構建的表達載體受培養(yǎng)基中Mg
文檔編號C12N15/70GK101045934SQ20071002057
公開日2007年10月3日 申請日期2007年3月13日 優(yōu)先權日2007年3月13日
發(fā)明者焦新安, 張曉明, 潘志明, 黃金林, 孫林, 殷月蘭, 唐麗華, 劉秀梵 申請人:揚州大學