專利名稱：利用費氏丙酸桿菌nx－4制備丙酸及聯(lián)產(chǎn)維生素b的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種高產(chǎn)丙酸(Propionic Acid)的微生物菌株費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)NX-4，以及將它用于丙酸及聯(lián)產(chǎn)維生素B12的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
丙酸是一種重要精細(xì)化工產(chǎn)品和基本化工原料，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、橡膠、塑料、油漆、涂料、香料、醫(yī)藥、農(nóng)藥、印刷等領(lǐng)域。
目前丙酸的工業(yè)化生產(chǎn)方法采用的是化學(xué)合成法。近年來，石油資源日趨緊張，價格不斷上揚，化學(xué)合成法生產(chǎn)丙酸的成本上升，同時化學(xué)合成法本身操作條件苛刻，加上消費者對天然有機產(chǎn)品的青睞，生物法合成丙酸的研究重新活躍起來。美國、德國、法國、印度、墨西哥等國有大量有關(guān)微生物生產(chǎn)丙酸的論文和專利，2000年至今檢索到的論文達50多篇。國內(nèi)對丙酸的研究也有一些，但菌株產(chǎn)量普遍不高，其中最高發(fā)酵水平為天津科技大學(xué)的梁惠珍等人用菌株P(guān)ropionic bacterium sp TQ-10發(fā)酵生產(chǎn)丙酸得24g/L。
維生素B12(氰鈷胺)是一種含鈷的水溶性維生素，為深紅色結(jié)晶或結(jié)晶粉末。維生素B12具有廣泛的生理作用，它參與體內(nèi)甲基轉(zhuǎn)換及葉酸代謝，促進神經(jīng)髓鞘中脂蛋白的形成，保持中樞神經(jīng)和外周有髓鞘神經(jīng)纖維的功能完整，參與廣泛的蛋白質(zhì)及脂肪代謝等。近年來，國內(nèi)外市場對維生素B12的需求日益增長，我國生產(chǎn)和出口連年大幅增加。維生素B12及其衍生物的市場前景十分廣闊。人們在丙酸生產(chǎn)研究時往往忽略了這一有價值副產(chǎn)物，只有德國Scharif等人考慮丙酸和維生素B12的耦聯(lián)生產(chǎn)，令人遺憾的是丙酸產(chǎn)量和VB12產(chǎn)量均不高，分別為17.7g/l和49mg/L(EP 0668359)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高產(chǎn)丙酸的微生物新菌株，將其用于制備丙酸及聯(lián)產(chǎn)維生素B12。
本發(fā)明人實驗室選育并保藏的微生物菌株費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)NX-4，目前該菌株保藏于武漢中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，登記入冊的編號是CCTCC No.M 207015，保藏日期是2007年2月7日。以此菌作為生產(chǎn)菌株。
CCTCC No.M 207015菌株具有下述性質(zhì)1、菌落形態(tài)學(xué)特征在營養(yǎng)瓊脂上，33℃培養(yǎng)48h出現(xiàn)黃色小菌落(＝0.8～1mm)，菌落呈圓形，表面光滑，粘狀，中央凸起，不透明。適當(dāng)延長培養(yǎng)，菌落增大，細(xì)胞的尺寸和形狀變化很小。
2、生理與生化特性a.培養(yǎng)溫度28～37℃，最適溫度為33℃；b.在pH5.5～7.2范圍內(nèi)生長；c.色素產(chǎn)生產(chǎn)黃色素；d.耐NaCl濃度在5％濃度可以生長。
3、16S rDNA序列分析測得16S rDNA大部分序列976bp，具體如下5′-CAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGCGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCGCTTTCATCCATGACGAAGCGCAAGTGACGGTAGTGGGAGAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTGATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTTGTAGGCGGTTGATCACGTCGGAAGTGAAATTCCAGGGCTTAACTCTGGGCTTGCTTTCGATACGGGTTGACTTGAGGAATGTAGGGGAGAATGGAACTCTCGGTGGAGCGGTGGAATGCGCAGATATCGGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGTTCTCTGGACATTTCCTGACGCTGAGAAGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGCTTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTCCCTTCCACGGGGTCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGTACCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGCCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTG
ACATGTACTGGAAGCGTTCAGAGATGGGCGTGCCTTTTTGGCTGGTACACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTCCAATGTTGCCAGCAGTTCGGCTGGGGACTCATTGGAGACCGCCGGGGCCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGAGGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAAAGAGTTGCGAGCCTGTGAGGGTGAGCGAATCTCAGAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGT-3′將所測序列從GeneBank數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)種進行比較，構(gòu)建16S rDNA全序列為基礎(chǔ)的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明菌株NX-4與費氏丙酸桿菌達到99.9％同源。所以認(rèn)定本發(fā)明使用的是費氏丙酸桿菌，具體為費氏丙酸桿菌NX-4(CCTCC No.M 207015)。
4、營養(yǎng)特征費氏丙酸桿菌NX-4的培養(yǎng)基中不需要添加生長因子，可以利用多種化合物作為碳源，這些物質(zhì)既可以單獨使用，也可以適當(dāng)?shù)谋壤龔?fù)配充當(dāng)碳源。有機氮或無機氮都可以作為氮源使用。培養(yǎng)基中各組分用量配比按各組分與培養(yǎng)基重量體積百分比計為碳源用量為培養(yǎng)基的2～10％，氮源用量為培養(yǎng)基的2～4％，無機鹽用量為培養(yǎng)基的0.01～1％，其余為水。碳源一般采用葡萄糖、木糖、果糖、乳酸或甘油等，氮源可采用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、豆餅粉、棉子餅粉、尿素以及(NH4)2SO4、NH4Cl等，培養(yǎng)基中還包括鉀鹽、鈷鹽、鈉鹽、磷酸鹽、磷酸二氫鹽、鹽酸鹽等常用的無機鹽類。
利用費氏丙酸桿菌制備丙酸的方法，該方法的步驟為將保藏號為CCTCC M 207015的菌株接種于含碳源、氮源、無機鹽和水的無菌培養(yǎng)基中，在合適生長的條件下靜止培養(yǎng)，能夠生成丙酸及聯(lián)產(chǎn)維生素B12。
所述的方法，其中培養(yǎng)基的碳源用量為培養(yǎng)基總重量的2～10％，氮源用量為培養(yǎng)基總重量的2～4％，無機鹽用量為培養(yǎng)基總重量的0.01～1％，其余為水。
所述的方法，其中培養(yǎng)基的碳源為葡萄糖、木糖、果糖、乳酸或甘油中的一種或多種；氮源為牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米漿、豆餅粉、棉籽餅粉、尿素、(NH4)2SO4或NH4Cl中的一種或多種；無機鹽為鉀鹽、鈷鹽、鈉鹽、磷酸鹽、磷酸二氫鹽或鹽酸鹽中的一種或多種。
所述的方法，其中合適生長的條件是初始pH為6.0～7.0、培養(yǎng)溫度為28～37℃、培養(yǎng)時間為48～150小時。
所述的方法，其中發(fā)酵液中的菌體破碎可提取維生素B12；除去菌體后的發(fā)酵液可提取丙酸。
優(yōu)選的制備丙酸及聯(lián)產(chǎn)維生素B12的方法將保藏號CCTCC No.M 207015的費氏丙酸桿菌NX-4菌株斜面活化一天后(斜面培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)，在含有碳源、氮源和無機鹽的培養(yǎng)基上培養(yǎng)48～150小時，可以生成10～53.5g/L丙酸，通常發(fā)酵條件還包括培養(yǎng)基為葡萄糖或乳酸2～10％，玉米漿2～4％，(NH4)2SO40.01～0.5％，K2HPO40.01～0.5％，各組分的含量均為重量體積百分比，即g/100ml，以下同。發(fā)酵溫度28～37℃，較佳的為32～35℃；培養(yǎng)基的初始pH范圍為6.0～7.0，較佳的為6.8～7.0；靜止培養(yǎng)。
本發(fā)明的有益效果(1)本發(fā)明篩選到一株丙酸生產(chǎn)菌，該菌能利用多種碳源和氮源發(fā)酵生產(chǎn)丙酸，操作方便簡單，培養(yǎng)條件十分粗放。
(2)可以使用纖維素水解糖液(替代葡萄糖或木糖)和豆餅粉(替代酵母膏或蛋白胨)作為丙酸發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源和氮源，使發(fā)酵原料成本大幅下降。
(3)本發(fā)明篩選到的丙酸生產(chǎn)菌還能副產(chǎn)高價值的維生素B12，提高了產(chǎn)品生產(chǎn)利率。
具體實施例方式
實施例1斜面培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L，瓊脂20g/L，pH6.9。
種子培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，NaCl5g/L，pH6.9。
發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖50g/L，玉米漿20g/L，(NH4)2SO42g/L，K2HPO45g/L，NaCl1g/L，pH6.9；25×200mm試管中裝發(fā)酵培養(yǎng)液(即發(fā)酵培養(yǎng)基)30ml，CaCO30.5g/試管，121℃滅菌15分鐘。
將保藏號為CCTCC No.M 207015的費氏丙酸桿菌NX-4接兩環(huán)于種子培養(yǎng)基中，33℃培養(yǎng)36h得種子液，將種子液按發(fā)酵液體積10％的接種量接入冷卻后的發(fā)酵液中，35℃培養(yǎng)42h后，加入1g二甲基苯并咪唑，繼續(xù)培養(yǎng)60h，最后得到的發(fā)酵液中丙酸的含量為25.3g/L；發(fā)酵菌體中含維生素B1222mg/L。
實施例2發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖60g/L，玉米漿20g/L，(NH4)2SO42g/L，K2HPO45g/L，NaCl1g/L，pH6.9；500ml容積的三角瓶中裝發(fā)酵培養(yǎng)液300ml，CaCO35g/三角瓶，121℃滅菌15分鐘。
配制種子培養(yǎng)基，配方與培養(yǎng)方法同實施例1，將種子液按發(fā)酵液體積10％的接種量接入冷卻后的發(fā)酵液中，35℃培養(yǎng)48h后，加入1g二甲基苯并咪唑，繼續(xù)培養(yǎng)68h，最后得到的發(fā)酵液中丙酸的含量為28.8g/L；發(fā)酵菌體中含維生素B1231mg/L。
實施例3發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，乳酸80g/L，玉米漿40g/L，(NH4)2SO42g/L，K2HPO45g/L，NaCl1g/L，pH6.9。25×200mm試管中裝發(fā)酵培養(yǎng)液30ml、CaCO31g/試管，121℃滅菌15分鐘。
配制種子培養(yǎng)基，配方與培養(yǎng)方法同實施例1，將種子液按發(fā)酵液體積10％的接種量接入冷卻后的發(fā)酵液中，35℃培養(yǎng)140小時，發(fā)酵液中含丙酸38.5g/L。
實施例4發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，乳酸120g/L，玉米漿40g/L，(NH4)2SO42g/L，K2HPO45g/L，NaCl1g/L，pH6.9。250ml容積的三角瓶中裝發(fā)酵培養(yǎng)液140ml、CaCO36g/三角瓶，121℃滅菌15分鐘。
配制種子培養(yǎng)基，配方與培養(yǎng)方法同實施例1，將種子液按發(fā)酵液體積10％的接種量接入冷卻后的發(fā)酵液中，35℃培養(yǎng)150小時，發(fā)酵液中含丙酸53.5g/L。
實施例5發(fā)酵培養(yǎng)基甘油80g/L，玉米漿40g/L，(NH4)2SO42g/L，K2HPO45g/L，NaCl1g/L，pH6.9。250ml容積的三角瓶中裝發(fā)酵培養(yǎng)液140ml、CaCO33.5g/三角瓶，121℃滅菌15分鐘。
配制種子培養(yǎng)基，配方與培養(yǎng)方法同實施例1，將種子液按發(fā)酵液體積10％的接種量接入冷卻后的發(fā)酵液中，35℃培養(yǎng)80小時，發(fā)酵液中含丙酸38.5g/L。
實施例6發(fā)酵培養(yǎng)基木糖20g/L，玉米漿20g/L，(NH4)2SO42g/L，K2HPO45g/L，NaCl1g/L，pH6.9；25×200mm試管中裝發(fā)酵培養(yǎng)液30ml、CaCO31g/試管，121℃滅菌15分鐘。
配制種子培養(yǎng)基，配方與培養(yǎng)方法同實施例1，將種子液按發(fā)酵液體積10％的接種量接入冷卻后的發(fā)酵液中，35℃培養(yǎng)72h，最后得到的發(fā)酵液中丙酸的含量為10.8g/L。
<110>南京工業(yè)大學(xué)<120>利用費氏丙酸桿菌NX-4制備丙酸及聯(lián)產(chǎn)維生素B12的方法<160>1<210>1<211>976<212>DNA<213>費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)<400>1cagcagtggg gaatattgca caatgggcgc aagcctgatg cagcaacgcc gcgtgcggga 60tgacggcctt cgggttgtaa accgctttca tccatgacga agcgcaagtg acggtagtgg 120gagaagaagc accggctaac tacgtgccag cagccgcggt gatacgtagg gtgcgagcgt 180tgtccggaat tattgggcgt aaagagcttg taggcggttg atcacgtcgg aagtgaaatt 240ccagggctta actctgggct tgctttcgat acgggttgac ttgaggaatg taggggagaa 300tggaactctc ggtggagcgg tggaatgcgc agatatcggg aagaacacca gtggcgaagg 360cggttctctg gacatttcct gacgctgaga agcgaaagcg tggggagcaa acaggcttag 420ataccctggt agtccacgcc gtaaacggtg ggtactaggt gtgggtccct tccacggggt 480ccgtgccgta gctaacgcat taagtacccc gcctggggag tacggccgca aggctaaaac 540tcaaaggaat tgacggggcc ccgcacaagc ggcggagcat gcggattaat tcgatgcaac 600gcgaagaacc ttacctgggt ttgacatgta ctggaagcgt tcagagatgg gcgtgccttt 660ttggctggta cacaggtggt gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 720agtcccgcaa cgagcgcaac cctcgtccaa tgttgccagc agttcggctg gggactcatt 780ggagaccgcc ggggccaact cggaggaagg tggggatgag gtcaagtcat catgcccctt 840atgtccaggg cttcacgcat gctacaatgg ccggtacaaa gagttgcgag cctgtgaggg 900tgagcgaatc tcagaaagcc ggtctcagtt cggattgggg tctgcaactc gaccccatga 960agtcggagtc gctagt 97權(quán)利要求
1.一種費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)NX-4，其在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號是CCTCC No.M 207015。
2.利用費氏丙酸桿菌NX-4制備丙酸及聯(lián)產(chǎn)維生素B12的方法，其特征在于將保藏號為CCTCC M 207015的菌株接種于含碳源、氮源、無機鹽和水的培養(yǎng)基中，進行靜態(tài)培養(yǎng)，可制得丙酸或聯(lián)產(chǎn)丙酸與維生素B12。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基中，各組分用量按重量體積百分比計為碳源用量為培養(yǎng)基的2～10％，氮源用量為培養(yǎng)基的2～4％，無機鹽用量為培養(yǎng)基的0.01～1％，其余為水。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基中，碳源為葡萄糖、木糖、果糖、乳酸或甘油中的一種或多種，氮源為牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米漿、豆餅粉、棉籽餅粉、尿素、(NH4)2SO4或NH4Cl中的一種或多種，無機鹽為鉀鹽、鈷鹽、鈉鹽、磷酸鹽、磷酸二氫鹽或鹽酸鹽中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于靜態(tài)培養(yǎng)的條件為初始pH為6.0～7.0，培養(yǎng)溫度為28～37℃，培養(yǎng)時間為48～150小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種費氏丙酸桿菌NX－4及利用該菌生產(chǎn)丙酸和維生素B
文檔編號C12P19/42GK101045910SQ200710020579
公開日2007年10月3日 申請日期2007年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月13日
發(fā)明者徐虹, 洪厚勝, 李莎, 楊麗, 熊強, 歐陽平凱 申請人:南京工業(yè)大學(xué)