專利名稱：一種產(chǎn)酸克雷伯氏菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種產(chǎn)酸克雷伯氏菌，利用該產(chǎn)酸克雷伯氏菌生物合成2，3-丁二醇并降低該過程中副產(chǎn)物有機(jī)酸產(chǎn)量的方法，以及該產(chǎn)酸克雷伯氏菌在2，3-丁二醇生物合成過程中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
2，3-丁二醇廣泛應(yīng)用于化工、食品、燃料以及航空航天等多個領(lǐng)域(Syu M J.ApplMicrobiol Biotechnol，2001，55(1)10-18)。其脫水產(chǎn)物甲乙酮是一種低沸點的溶劑，可應(yīng)用于涂料、粘結(jié)劑、潤滑劑、染料、油墨等行業(yè)，同時又能用作有機(jī)合成香料、抗氧劑等的中間體；酯化后的脫水產(chǎn)物1，3-丁二烯是一種重要的石油化工基礎(chǔ)有機(jī)原料和合成橡膠單體；同甲乙酮濃縮脫氫后形成的辛烷異構(gòu)體，可用來生產(chǎn)高級航空用油；其高價值的衍生物3-羥基丁酮(乙偶姻)和丁二酮廣泛應(yīng)用于食品、香料以及化妝品等行業(yè)；同時因其熱值較高(27,200kJ/kg)，同乙醇(29,100kJ/kg)相當(dāng)，可作為燃料添加劑使用。手性2，3-丁二醇除了以上用途外，還可用作為藥物的手性載體和液晶材料的手性添加劑(Garg S，Jain A.Bioresour Technol，1995，51(2)103-109)。
目前化學(xué)法生產(chǎn)2，3-丁二醇，主要是以石油裂解時產(chǎn)生的四碳類的碳?xì)浠衔?主要成分是77％的丁烯和23％的丁烷和異丁烷的混合物)為原料，混合物中的丁烯經(jīng)過HClO的氧化及NaOH的作用后，在高溫高壓下水解得到幾種不同種類的丁二醇(2，3-丁二醇和1，2-丁二醇等)，然后再通過減壓分餾的方法分離獲得。而自然界中的某些細(xì)菌具有產(chǎn)2，3-丁二醇的能力，主要包括克雷伯氏菌屬(Klebisella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)等(Afschar A S，Vaz Rossell C E，Jonas R，et al.J Biotechnol，1993，27(3)317-329)。在這些細(xì)菌中，克雷伯氏菌屬的產(chǎn)酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca和芽孢桿菌屬的多粘芽孢桿菌Bacillus polymyxa顯示出較高的生產(chǎn)2，3-丁二醇的潛力，尤其是前者，因為具有寬廣的底物范圍以及對培養(yǎng)條件具有很好的適應(yīng)能力等優(yōu)點，所以經(jīng)常用于生物合成2，3-丁二醇的研究(Jansen N B，F(xiàn)lickinger M C，Tsao G T.BiotechnolBioeng，1984，26(4)362-369)。而后者雖然產(chǎn)2，3-丁二醇的能力不及前者，但其能夠分泌淀粉酶，因而可以直接利用淀粉類物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)2，3-丁二醇；而且該菌株產(chǎn)生的2，3-丁二醇中，主要是D型的2，3-丁二醇(Mas C D，Jansen N B，Tsao G T.Biotechnol Bioeng，1988，31(3)366-377)，常用于制備手性2，3-丁二醇，因而也是微生物發(fā)酵法生產(chǎn)2，3-丁二醇的熱門菌株之一。2，3-丁二醇發(fā)酵的主要特點有2，3-丁二醇對菌株的毒性小，從而可以在發(fā)酵罐中進(jìn)行高濃度的發(fā)酵生產(chǎn)；以Klebsiella oxytoca為代表的2，3-丁二醇的生產(chǎn)菌株的不僅可以利用各種主要的糖類(己糖、戊糖和一些二糖等)，還可以利用纖維素和半纖維素水解所產(chǎn)生的糖醛酸，底物譜十分寬廣。2，3-丁二醇的化學(xué)合成方法的成本同生物法相比要高得多，而且同生物法相比，化學(xué)法過程繁瑣，不易操作，所以一直很難實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，其用途也沒有得到充分的開發(fā)。用生物法來制備2，3-丁二醇既符合綠色化工的要求，又可以克服化學(xué)法生產(chǎn)的困難，同時可以實現(xiàn)人類社會生產(chǎn)由傳統(tǒng)的以不可再生化石資源為原料的石油煉制向以可再生生物質(zhì)資源為原料的生物煉制轉(zhuǎn)型(Ragauskas A J，Williams C K，Davison B H，et al.Science，2006，311(5760)484-498)，逐漸減少對日益枯竭的石油資源的依賴。近年來，隨著石油價格的日益攀升，用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)2，3-丁二醇，并對其系列衍生物進(jìn)行開發(fā)應(yīng)用逐漸引起了人們的關(guān)注(Syu M J.Appl Microbiol Biotechnol，2001，55(1)10-18)。
Klebsiella oxytoca作為2，3-丁二醇的最佳生產(chǎn)菌株之一，在生物合成2，3-丁二醇過程中經(jīng)由一種混合酸代謝途徑，發(fā)酵的終產(chǎn)物除了2，3-丁二醇外，還有一定量的副產(chǎn)物有機(jī)酸(乙酸、乳酸、甲酸等)產(chǎn)生(Jansen N B，Tsao G T.Adv Biochem Eng Biotechnol，1983，2785-99)。這些有機(jī)酸的產(chǎn)生，不僅降低了底物的轉(zhuǎn)化率，而且會造成發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH值下降，不利于微生物的生長，影響菌體細(xì)胞的代謝，從而不利于2，3-丁二醇的生物合成。因此，降低Klebsiella oxytoca生物合成2，3-丁二醇過程中副產(chǎn)物有機(jī)酸的含量有助于提高底物的利用率和2，3-丁二醇的產(chǎn)率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種合成2，3-丁二醇的產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。
本發(fā)明的另一個目的是提供利用上述產(chǎn)酸克雷伯氏菌合成2，3-丁二醇并降低副產(chǎn)物有機(jī)酸產(chǎn)量的方法。
本發(fā)明還有一個目的是提供上述產(chǎn)酸克雷伯氏菌在減少副產(chǎn)物有機(jī)酸產(chǎn)量的2，3-丁二醇生物合成中的應(yīng)用。
本發(fā)明使用菌株Klebsiella oxytoca ME-303(CCTCC NOM 207023)生物合成2，3-丁二醇，該菌株在生物合成2，3-丁二醇過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物種類較現(xiàn)有技術(shù)公開的其他產(chǎn)酸克雷伯氏菌的副產(chǎn)物種類少，主要產(chǎn)生兩種酸性副產(chǎn)物乳酸和乙酸，且產(chǎn)酸量也較其他產(chǎn)酸克雷伯氏菌的產(chǎn)酸量少。由于酸性副產(chǎn)物造成發(fā)酵過程中發(fā)酵液的pH值不斷下降，影響菌株細(xì)胞內(nèi)與目標(biāo)產(chǎn)物2，3-丁二醇生物合成相關(guān)酶系的活性，從而不利于2，3-丁二醇的生物合成，而且這些有機(jī)酸副產(chǎn)物的產(chǎn)生還降低了底物轉(zhuǎn)化到目標(biāo)產(chǎn)物2，3-丁二醇的轉(zhuǎn)化率。針對以上存在的問題，本發(fā)明利用紫外線和硫酸二乙酯(DES)對菌株CCTCC NOM 207023進(jìn)行復(fù)合處理后應(yīng)用設(shè)計的含溴化鈉和溴酸鈉的選擇性固體培養(yǎng)基快速定向地降低該菌株生物合成2，3-丁二醇過程中兩種有機(jī)酸副產(chǎn)物。
本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)措施實現(xiàn)的一種產(chǎn)酸克雷伯氏菌，其分類命名為產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ME-303，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號是CCTCC NOM 207023。
利用所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌CCTCC NOM 207023生物合成2，3-丁二醇，并降低該過程中副產(chǎn)物有機(jī)酸產(chǎn)量的方法，其特征在于采用紫外線和硫酸二乙酯(DES)復(fù)合處理菌株CCTCC NOM 207023，然后將處理后的菌株接種到含溴化鈉和溴酸鈉的選擇性固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)遺傳穩(wěn)定性考察后，挑取單菌落進(jìn)行發(fā)酵，制備2，3-丁二醇。
所述的方法中采用紫外線和硫酸二乙酯(DES)復(fù)合處理菌株是采用強(qiáng)度為15～30w的紫外線照射2～5min后再采用按質(zhì)量百分比計終濃度為0.5％～2％的DES處理20～50min。
所述的方法中含溴化鈉和溴酸鈉的選擇性固體培養(yǎng)基是在普通LB固體培養(yǎng)基中添加一定量的葡萄糖、溴化鈉和溴酸鈉混合物，其中溴化鈉和溴酸鈉的摩爾比為1∶1～5∶1。
所述的方法中選擇性固體培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度為10～100g/L，溴化鈉的濃度為200～900mmol/L，溴酸鈉的濃度為50～225mmol/L。
所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌在減少副產(chǎn)物有機(jī)酸產(chǎn)量的2，3-丁二醇生物合成中的應(yīng)用。
以下是本發(fā)明技術(shù)方案的詳細(xì)描述本發(fā)明采用在生物合成2，3-丁二醇過程中副產(chǎn)物種類少的產(chǎn)酸克雷伯氏菌CCTCCNOM 207023，并將菌株CCTCC NOM 207023菌懸液經(jīng)紫外線和硫酸二乙酯復(fù)合處理后，在選擇性固體培養(yǎng)基中涂布培養(yǎng)，能存活下來的菌落即產(chǎn)有機(jī)酸較少或不產(chǎn)有機(jī)酸。
一、選擇性固體培養(yǎng)基的設(shè)計在本發(fā)明中，設(shè)計了一種選擇性固體培養(yǎng)基，在LB固體培養(yǎng)基中添加一定量的葡萄糖和溴化鈉-溴酸鈉混合物(溴化鈉與溴酸鈉的摩爾比為1∶1～5∶1)，優(yōu)選葡萄糖的濃度為10～100g/L，溴化鈉的濃度為200～900mmol/L，溴酸鈉的濃度為50～225mmol/L。菌株CCTCC NOM 207023在選擇性固體培養(yǎng)基中生長時，利用其中的葡萄糖作為碳源生成有機(jī)酸，有機(jī)酸解離出的質(zhì)子(H+)與選擇性固體培養(yǎng)基中的溴酸根離子(BrO3-)和溴離子(Br-)發(fā)生如式(1)和式(2)所示的化學(xué)反應(yīng)，生成對微生物菌株具有致命毒害作用的單質(zhì)溴；利用這種方法(產(chǎn)酸較多的菌株自身產(chǎn)生的質(zhì)子參與式(1)和式(2)所示的化學(xué)反應(yīng)生成單質(zhì)溴“殺”死自身)。
(1)BrO3-+2Br-+H+→Br2+BrO2-+H2O(2)BrO2-+2Br-+H+→Br2+BrO-+H2O二、紫外線和硫酸二乙酯復(fù)合處理具體操作步驟是取培養(yǎng)10～20h生長豐滿的菌株CCTCC NOM 207023斜面4支，用10mL無菌生理鹽水將菌苔洗下，倒入一支無菌大試管。將試管在振蕩混合器上振蕩20～50s打散菌塊，8000r/min離心10～20min，棄上清，制成菌懸液，用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1～5×108個/mL，作為待處理菌液，取2～8mL加到直徑為6cm的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，并放入無菌磁力攪拌器，在距離為10～40cm功率為15～30w紫外燈下攪拌照射2～5min，取該菌懸液3～10mL接種到裝有50mL LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶內(nèi)，37℃避光培養(yǎng)10～20h后，取10mL培養(yǎng)液8000r/min離心10～20min，棄上清，以20mL 0.1mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液洗滌兩次，最后用原體積的磷酸緩沖液制成菌懸液，吸取5mL菌懸液至50mL三角瓶內(nèi)，并加入15mL 0.1mol/LpH 7.0的磷酸緩沖液制成約為108個/mL的菌懸液，再加0.2～0.8mL DES乙醇溶液(0.5g/mL)，使DES在菌懸液中的終濃度為0.5％～2％(質(zhì)量百分比)，震蕩處理20～50min后立即加入0.2～0.8mL 25％的硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)，然后以10倍稀釋法作一系列稀釋至10-5，取0.5mL涂于選擇性固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10～20h后，收集單菌落，繼續(xù)在同樣的選擇性固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)5～10代以考察存活菌落的遺傳穩(wěn)定性，挑選遺傳穩(wěn)定的存活菌落備用。
三、發(fā)酵驗證挑取經(jīng)紫外線和硫酸二乙酯復(fù)合處理后能夠在選擇性平板上存活且經(jīng)驗證遺傳較穩(wěn)定的菌落進(jìn)行分批發(fā)酵驗證，并采用未經(jīng)處理的CCTCC NOM 207023作對照，在一定的發(fā)酵條件下發(fā)酵36～54h，用HPLC法測定發(fā)酵終止時發(fā)酵液中目標(biāo)產(chǎn)物2，3-丁二醇和兩種酸性副產(chǎn)物乳酸和乙酸的產(chǎn)量，進(jìn)行比較分析。
本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明操作簡單且工作量少，不涉及基因操作，成本較低，效率高且周期短，能夠快速定向地降低菌株CCTCC NOM 207023生物合成2，3-丁二醇過程中的副產(chǎn)物乳酸和乙酸的產(chǎn)量，提高底物的利用率及2，3-丁二醇的得率，進(jìn)一步降低生物法制備2，3-丁二醇的成本。
生物材料保藏信息產(chǎn)酸克雷伯氏菌，其分類命名為產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ME-303，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏(簡稱CCTCC，地址中國.武漢.武漢大學(xué))，保藏日期2007年3月16日，保藏編號為CCTCC NOM 207023。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。
一般性說明LB液體培養(yǎng)基(g/L)蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，pH 7.0～7.2。
LB固體培養(yǎng)基(g/L)蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，瓊脂15，pH 7.0～7.2。
選擇性固體培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖10-100，蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10，瓊脂15，溴化鈉+溴酸鈉(摩爾比為1∶1～5∶1，溴化鈉的濃度為200～900mmol/L，溴酸鈉的濃度為50～225mmol/L)。
發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖100，MgSO4·7H2O 0.25，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，ZnSO4·7H2O0.001，MnSO4·H2O 0.001，CaCl20.01，K2HPO4·3H2O 13.7，KH2PO42.0，(NH4)2HPO43.3，(NH4)2SO46.6以上各種培養(yǎng)基均在115～121℃下滅菌15～20min(其中在配制選擇性固體培養(yǎng)基時，溴酸鈉溶液單獨配制，滅菌后再加入，混勻倒平板)。
發(fā)酵條件發(fā)酵過程在5L全自動發(fā)酵罐(NBS，New Brunswick，USA)中進(jìn)行，裝液量3L，接種量5％(即每3L發(fā)酵液接種150mL種子液，接種時的種子液總是取對數(shù)生長期(培養(yǎng)時間約為12h)的種子液，其濃度是一定的)，發(fā)酵溫度37℃，轉(zhuǎn)速為200r/min，供氧速率0.7vvm。
底物、產(chǎn)物及副產(chǎn)物含量的HPLC測定方法發(fā)酵液中殘留底物葡萄糖、產(chǎn)物2，3-丁二醇和各種酸性副產(chǎn)物如乳酸和乙酸等采用DIONEX summit P680高效液相色譜儀測定。色譜柱為Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad)，柱溫為60℃，檢測器為SHODEX RI-101折光示差檢測器，流動相為0.005mol/L H2SO4，流速為0.2mL/min，進(jìn)樣量為20μL。
菌落的遺傳穩(wěn)定性測定方法將菌落在選擇性固體培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)5～10代，觀察其生長情況，仍然能夠生長者即為遺傳穩(wěn)定。
實施例1步驟一紫外線與硫酸二乙酯(DES)復(fù)合處理菌株CCTCC NOM 207023。
取培養(yǎng)12h生長豐滿的Klebsiella oxytoca CCTCC NOM 207023斜面(斜面培養(yǎng)基即為LB固體培養(yǎng)基)4支，用10mL無菌生理鹽水將菌苔洗下，倒入一支無菌大試管。將試管在振蕩混合器上振蕩30s打散菌塊，8000r/min離心15min，棄上清，制成菌懸液，用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為108個/mL，作為待處理菌液，取5mL待處理菌液加到直徑為6cm的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，并放入無菌磁力攪拌器，在距離為30cm功率為15w紫外燈下攪拌照射2min，取該菌懸液5mL接種到裝有50mL LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶內(nèi)，37℃避光培養(yǎng)12h后，取10mL培養(yǎng)液8000r/min離心15min，棄上清，以20mL 0.1mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液洗滌兩次，最后用原體積(20mL)的磷酸緩沖液制成菌懸液，吸取5mL菌懸液至50mL三角瓶內(nèi)，并加入15mL 0.1mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液制成約為108個/mL的菌懸液，再加0.4mLDES乙醇溶液(0.5g/mL)，使DES在菌懸液中的濃度為1％，震蕩處理30min后立即加入0.5mL 25％的硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)，然后以10倍稀釋法作一系列稀釋至10-5，取0.5mL涂布于選擇性固體培養(yǎng)基(向LB固體培養(yǎng)基添加的葡萄糖濃度為50g/L；溴化鈉和溴酸鈉的摩爾比為4∶1，濃度分別為500mmol/L和125mmol/L)進(jìn)行培養(yǎng)。
步驟二發(fā)酵驗證挑取在選擇性固體培養(yǎng)基中存活的一個單菌落，繼續(xù)在同樣的選擇性固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)5代經(jīng)考察遺傳穩(wěn)定性后，挑取單菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵(發(fā)酵條件見一般性說明)，發(fā)酵54小時，取5mL發(fā)酵液8000r/min離心15min后，用HPLC分析上清中2，3-丁二醇以及副產(chǎn)物乙酸和乳酸的濃度，與處理前結(jié)果比較，結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明在相同的發(fā)酵條件下菌株CCTCC NOM 207023經(jīng)處理后2，3-丁二醇產(chǎn)量高達(dá)41.7g/L，比處理前增加了7.89％，而相應(yīng)的副產(chǎn)物有機(jī)酸乳酸和乙酸的產(chǎn)量分別下降了89.09％和92.24％。
表1


實施例2步驟一同實施例1步驟二發(fā)酵驗證挑取在選擇性固體培養(yǎng)基中存活的一個單菌落，繼續(xù)在同樣的選擇性固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)5代經(jīng)考察遺傳穩(wěn)定性后，挑取單菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵(發(fā)酵條件見一般性說明)，發(fā)酵54小時，取5mL發(fā)酵液8000r/min離心15min后，用HPLC分析上清中2，3-丁二醇以及副產(chǎn)物乙酸和乳酸的濃度，與處理前結(jié)果比較，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明在相同的發(fā)酵條件下菌株CCTCC M 207023經(jīng)處理后2，3-丁二醇產(chǎn)量高達(dá)40.53g/L，比處理前增加了4.86％，而相應(yīng)的副產(chǎn)物有機(jī)酸乳酸和乙酸的產(chǎn)量分別下降了67.88％和72.41％。
表2

實施例3步驟一同實施例1步驟二發(fā)酵驗證挑取在選擇性固體培養(yǎng)基中存活的一個單菌落，繼續(xù)在同樣的選擇性固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)5代經(jīng)考察遺傳穩(wěn)定性后，挑取單菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵(發(fā)酵條件見一般性說明)，發(fā)酵54小時，取5mL發(fā)酵液8000r/min離心15min后，用HPLC分析上清中2，3-丁二醇以及副產(chǎn)物乙酸和乳酸的濃度，與處理前結(jié)果比較，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明在相同的發(fā)酵條件下菌株CCTCC M 207023經(jīng)處理后2，3-丁二醇產(chǎn)量高達(dá)40.8g/L，比處理前增加了5.56％，而相應(yīng)的副產(chǎn)物有機(jī)酸乳酸和乙酸的產(chǎn)量分別下降了61.82％和79.31％。
表3

實施例4步驟一同實施例1步驟二發(fā)酵驗證挑取在選擇性固體培養(yǎng)基中存活的一個單菌落，繼續(xù)在同樣的選擇性固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)5代經(jīng)考察遺傳穩(wěn)定性后，挑取單菌落接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵(發(fā)酵條件見一般性說明)，發(fā)酵54小時，取5mL發(fā)酵液8000r/min離心15min后，用HPLC分析上清中2，3-丁二醇以及副產(chǎn)物乙酸和乳酸的濃度，與處理前結(jié)果比較，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明在相同的發(fā)酵條件下菌株CCTCC M 207023經(jīng)處理后2，3-丁二醇產(chǎn)量高達(dá)40g/L，比處理前增加了3.49％，而相應(yīng)的副產(chǎn)物有機(jī)酸乳酸和乙酸的產(chǎn)量分別下降了66.67％和62.07％。
表4

權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)酸克雷伯氏菌，其分類命名為產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ME-303，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏編號是CCTCC NOM 207023。
2.利用權(quán)利要求1所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌生物合成2，3-丁二醇并降低該過程中副產(chǎn)物有機(jī)酸產(chǎn)量的方法，其特征在于采用紫外線和硫酸二乙酯復(fù)合處理菌株CCTCC NOM 207023，然后將處理后的菌株接種到含溴化鈉和溴酸鈉的選擇性固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)遺傳穩(wěn)定性考察后，挑取單菌落進(jìn)行發(fā)酵，制備2，3-丁二醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于采用紫外線和硫酸二乙酯復(fù)合處理菌株是采用強(qiáng)度為15～30w的紫外線照射2～5min后再采用按質(zhì)量百分比計終濃度為0.5％～2％的硫酸二乙酯處理20～50min。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于含溴化鈉和溴酸鈉的選擇性固體培養(yǎng)基是在普通LB固體培養(yǎng)基中添加適量的葡萄糖、溴化鈉和溴酸鈉混合物，其中溴化鈉和溴酸鈉的摩爾比為1∶1～5∶1。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于選擇性固體培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度為10～100g/L，溴化鈉的濃度為200～900mmol/L，溴酸鈉的濃度為50～225mmol/L。
6.權(quán)利要求1所述產(chǎn)酸克雷伯氏菌在減少副產(chǎn)物有機(jī)酸產(chǎn)量的2，3-丁二醇生物合成中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)酸克雷伯氏菌及其應(yīng)用。該產(chǎn)酸克雷伯氏菌保藏號為CCTCC NOM 207023，利用該產(chǎn)酸克雷伯氏菌生物合成2，3－丁二醇并降低該過程中副產(chǎn)物有機(jī)酸產(chǎn)量的方法是采用紫外線和硫酸二乙酯復(fù)合處理菌株CCTCC NOM 207023，然后將處理后的菌株接種到含溴化鈉和溴酸鈉的選擇性固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)遺傳穩(wěn)定性考察后，挑取單菌落進(jìn)行發(fā)酵制備2，3－丁二醇。本發(fā)明操作簡單且工作量少，不涉及基因操作，成本較低，效率高且周期短，能夠快速定向地降低生物合成2，3－丁二醇過程中的副產(chǎn)物乳酸和乙酸的產(chǎn)量，提高底物的利用率及2，3－丁二醇的得率。
文檔編號C12R1/22GK101063095SQ20071002164
公開日2007年10月31日 申請日期2007年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月19日
發(fā)明者黃和, 紀(jì)曉俊, 李霜, 杜軍, 練敏, 高振, 胡南 申請人:南京工業(yè)大學(xué)