專利名稱：氨基酸診斷/測定試劑盒及氨基酸濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種氨基酸診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定氨基酸 濃度的方法，屬于醫(yī)學/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景氨基酸含量的測定在醫(yī)學/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境中都是比較重要的測定項 目?，F(xiàn)有的測定方法有色譜法、電化學法、儀器分析法(氨基酸分析儀)、分 光光度計等方法，這些方法或是操作方法較為繁雜、特異性差、或儀器設(shè)備 成本較高等缺點。氨基酸不是單純的一種物質(zhì)，用氨基酸分析儀可直接測定出17種氨基酸 (儀器價格昂貴，不能普遍使用)，對于醫(yī)學/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境中來說， 多數(shù)情況下，都是很多種氨基酸同時存在，所以需要測定總的氨基酸含量， 它們不能以氨基酸百分率來表示，只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸氮)的 百分率表示。 .大量食肉或饑餓時尿中氨基酸氮增加，孕婦及新生兒尿液氨基酸氮也增 加。氨基酸代謝異常，造成某些氨基酸在體內(nèi)積累過多，使尿中氨基酸氮增 高；急性肝萎縮、肝功能衰竭、Re y e綜合征、或某些因素造成蛋白質(zhì)分 解加速的疾病，遺傳性疾病所導(dǎo)致的代謝異常均可使尿中氨基酸氮增加。酶法測定血、尿、體液、食品、土壤、工業(yè)產(chǎn)品中氨基酸氮含量具有特 異性高、方法簡便、成本低的特點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計量通過酶聯(lián)反應(yīng) 生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)所導(dǎo)致 在400—700nm波長處吸光度的上升，得以測定氨基酸濃度的方法，同時， 本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的氨基酸診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅 可以在可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行氨基酸濃度測定，而且 測定速度快、靈敏度大、準確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明氨基酸濃度測定方法原理如下-
氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨離子+
過氧化氫
過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶噴嗒胺色原或
醌亞胺色原+水
這個方法應(yīng)用氨基酸氧化酶(amino acid oxidase; EC 1.4.3.2; EC 1.4.3.3) 偶聯(lián)過氧化物酶(peroxidase ; EC 1.11丄7)酶促反應(yīng)終點/速率比色法。氨 基酸氧化酶酶解氨基酸反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫，再通過(偶)聯(lián)合過氧化物酶的 作用，最后生成的過氧化氫在過氧化物酶的作用下，將無色的還原型色原體 組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400—700nm(根 據(jù)還原型色原體組合的不同而定)波長處，測定染料一噴嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye) —含量高低的光吸收大?。煌ㄟ^測 量400—700nm (根據(jù)還原型色原體組合的不同而定)處吸光度上升的程度/ 速度，得出氨基酸濃度大小測定結(jié)果。實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮， 如下成分關(guān)系的本發(fā)明氨基酸診斷/測定試劑盒較為理想緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 rmnol/L氨基酸氧化酶過氧化物酶還原型色原體組合10000U/L30000U/L0.1--20 mmol/L所述還原型色原體組合(Chromogen)可以是下列28個組合中的任何一個配對組合3_甲基_2_苯噻唑酮腙石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基一N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-雙乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2.4- 雙氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3.5- 雙氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙雙甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻哇酮腙2,2，-AZINO-雙G-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒N-乙基^"N' (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N，N-雙乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2，4-雙氯石碳酸4-氨基抗砒2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸4-氨基抗砒 3,5-雙氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽4-氨基抗砒 仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒雙甲基苯胺 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺本發(fā)明的氨基酸診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合。試劑盒 可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化物酶、還原型色原體組合、氨基酸氧化酶。 過氧化物酶、還原型色原體組合、氨基酸氧化酶在試劑1或試劑2中的 位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以 配制成液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合。試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合。
試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化物酶、氨基酸氧化酶。 過氧化物酶、還原型色原體組合、氨基酸氧化酶在試劑1、試劑2或試劑 3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的氨基酸診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
氨基酸氧化酶 10000 U/L
過氧化物酶 30000 U/L
4-氨基抗砒 2 mmol/L
石碳酸 10 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用 前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時間10分鐘，測試主波 長505nm,測試副波長600mn，被測氨基酸樣品與試劑的體積比例為1/25， 反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，檢測方法為終點/速率法，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析
儀下，檢測主波長505nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出氨基酸的濃
度大小。
實施例二
本實施例的氨基酸診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸
10Ommol/L 0.2 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
氨基酸氧化酶
10000U/L
過氧化物酶 30000 U/L
4-氨基抗砒 0.6 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時間10分鐘，測試主波長 546nm，測試副波長600nm，被測氨基酸樣品與試劑的體積比例為1/20，反 應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，檢測方法為終點/速率法，延遲時間大約0分 鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測主波長546nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出氨基酸的濃度大小。 實施例三本實施例的氨基酸診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L3-甲基-2-苯噻唑酮腙0.6 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L雙甲基苯胺2 mmol/L試劑3三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑氨基酸氧化E過氧化物酶500 mmol/L畫00U/L30000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37T:，反應(yīng)時間IO分鐘，測試主波長578nm，測試副波長660nm，被測氨基酸樣品與試劑的體積比例為1/30，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，檢測方法為終點/速率法，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長578nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出氨基酸的濃度大小。申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色原 體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不 另一一例舉?？傊瑢嶒炞C明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過可見光分析儀器 得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源物質(zhì)量污染。
權(quán)利要求
1.一種酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨基酸濃度測定方法，其方法原理如下氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨離子+ 過氧化氫過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或 醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于可見光分析儀下，檢測400-700nm處直接反映吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收速度/程度，得出氨基酸濃度大小測定結(jié)果。
2. —種氨基酸診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——4000 mmol/L還原型色原體組合 0.1——20 mmol/L氨基酸氧化酶 1000——80000 U/L過氧化物酶 500——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成 單劑試劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合組成；試劑2， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成。 過氧化物酶、還原型色原體組合、氨基酸氧化酶在試劑1或試劑2中的位 置可以不限。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組 成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、原型色原體組合組成；試劑2，由緩沖 液、還原型色原體組合組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨基酸氧化酶、 過氧化物酶組成。過氧化物酶、還原型色原體組合氨基酸氧化酶在試劑1、 試劑2或試劑3中的位置可以不限。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定 劑14000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述氨基酸診斷/測定試劑盒，其特征在于所述還原型色原體組合可以是下列28個組合中的任一個配對組合3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基^N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-雙乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4-雙氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙雙甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2,2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒石碳酸4-氨基抗砒N-乙基^N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N,N-雙乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2,4-雙氯石碳酸4-氨基抗砒2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸4-氨基抗砒 3,5-雙氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽4-氨基抗砒 仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒雙甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的氨基酸診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定氨基酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/食品/工業(yè)/農(nóng)業(yè)/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、氨基酸氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合及穩(wěn)定劑；通過一系列的酶促反應(yīng)，最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400-700nm波長處，測定染料含量的高低，進而直接反映出氨基酸濃度的大小。
文檔編號C12Q1/00GK101324588SQ20071002336
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司