專利名稱：半乳糖診斷/測定試劑盒及半乳糖濃度測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種半乳糖診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定半 乳糖濃度的方法，屬于醫(yī)學/食品檢驗測定技術領域。
技術背景牛奶在營養(yǎng)界素有"液體黃金"的美稱，我國早在1992年由七部位聯(lián)合 提出"一杯牛奶強壯一個民族"的口號。奶類除不含纖維素外，幾乎含有人體所需要的各種營養(yǎng)素。牛奶中的乳糖進入人體后，經(jīng)小腸乳糖酶作用 分解成葡萄糖和半乳糖。半乳糖是嬰兒大腦發(fā)育的必需物質，與嬰兒大腦 的迅速成長有密切關系。牛奶雖好但并不是所有的人都能享受，有些人由于乳糖酶的缺乏，人 體不能很好的消化吸收牛奶中的營養(yǎng)素，還會造成鈣、磷、鉀、鐵等元素 的吸收障礙，影響嬰幼兒的體格和智力發(fā)育，在老年人中，乳糖酶缺乏是 造成骨質疏松的重要原因。中國成年人飲用牛乳后乳糖吸收不良的發(fā)病率高達86.7%，不耐受指數(shù)為0.9。為了避免不適當飲奶對健康造成的損害，因此最好在飲奶前檢查自己 是否耐受乳糖，在飲用牛奶后，測試尿液中半乳糖的濃度，這是目前國外 最常用的一種方法，更為簡便、經(jīng)濟、可靠。 發(fā)明內容本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶聯(lián)法(Couple Reaction)技術，計量通過酶聯(lián) 反應生成吲嗒胺色原(Indaminedye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye) 所導致在400—700nm波長處吸光度的上升，得以測定半乳糖濃度的方 法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的半乳糖診斷/測定試劑盒， 采用該試劑不僅可以在可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行半乳 糖濃度測定，而且測定速度快、靈敏度大、準確度高，因而可以得到切實 的推廣應用。本發(fā)明半乳糖濃度測定方法原理如下-半乳糖+氧 半乳糖氧化酶 半乳糖hexodialdose +過氧化氫 過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶tl引嗒胺色原或醌亞胺色原+水 這個方法應用半乳糖氧化酶(galactose oxidase; EC U.3.9)偶聯(lián)過氧 化物酶(peroxidase ; EC 1.11丄7)酶促反應終點/速率比色法。半乳糖氧 化酶酶解半乳糖反應產生過氧化氫，再通過偶聯(lián)過氧化物酶的作用，，將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀 器，在400""700nm (根據(jù)還原型色原體組合的不同而定)波長處，測定 染料一吲嗒胺色原(Indaminedye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)— 含量高低的光吸收大??；通過測量400—700nm (根據(jù)還原型色原體組合 的不同而定)處吸光度上升的程度/速度，得出半乳糖濃度大小測定結果。 實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮， 如下成分關系的本發(fā)明半乳糖診斷/測定試劑盒較為理想緩沖液畫mmol/L穩(wěn)定劑500 mmol/L過氧化物酶30000 U/L半乳糖氧化酶12000 U/L還原型色原體組合20 mmol/L所述還原型色原體組合(Chromogen)可以是下列28個組合中的任何一個配對組合3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基—N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-雙乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2.4- 雙氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3.5- 雙氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻哞酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 雙甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒N-乙基^N- (3-硫丙基)-m-噻淀胺4-氨基抗砒 N，N-雙乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒2.4- 雙氯石碳酸4-氨基抗砒2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸4-氨基抗砒 3，5-雙氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3.5- 雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒雙甲基苯胺4-氨基抗砒 .N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺2，2'-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺本發(fā)明的半乳糖診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、半乳糖氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合。試劑 盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑， 直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化物酶、還原型色原體組合、半乳糖氧化酶。 過氧化物酶、還原型色原體組合、半乳糖氧化酶在試劑1或試劑2中 的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合。試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化物酶、半乳糖氧化酶。 過氧化物酶、還原型色原體組合、半乳糖氧化酶在試劑l、試劑2或 試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后 使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
具體實施方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一本實施例的半乳糖診斷/測定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L過氧化物酶 30000 U/L半乳糖氧化酶 12000 U/L4-氨基抗砒 2 mmol/L石碳酸 10mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使 用前，加入純凈水，復溶后使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間10分鐘，測試主 波長505nm，測試副波長600nm，被測半乳糖樣品與試劑的體積比例為 1/25，反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為終點/速率法，延遲時 間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長505nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出半乳考的濃度大小。實施例二本實施例的半乳糖診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L穩(wěn)定劑2，4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸50 mmol/L0.2 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 過氧化物酶 半乳糖氧化f 4-氨基抗砒500 mmol/L30000 U/L12000U/L0.6 mmol/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，測試主波長546nm，測試副波長600nm，被測半乳糖樣品與試劑的體積比例為1/20，反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為終點/速率法，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長546nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出半乳糖的濃度大小。12實施例三
本實施例的半乳糖診斷/測定試劑為三試劑，包括:
試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
廳mmol/L 50 mmol/L 0.6 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
雙甲基苯胺
2 mmol/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
過氧化物酶
半乳糖氧化酶
500 mmol/L
30000 U/L
12000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間10分鐘，測試主
波長578nm，測試副波長660nm，被測半乳糖樣品與試劑的體積比例為
1/30，反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為終點/速率法，延遲時
間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分
析儀下，檢測主波長578nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出半乳糖的濃度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類 同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過可見光分析儀 器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，不受內外源物質量污 染。
權利要求
1.一種酶比色法及酶聯(lián)法技術的半乳糖濃度測定方法，其方法原理如下半乳糖+氧半乳糖氧化酶半乳糖hexodialdose+過氧化氫過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或 醌亞胺色原+水將最終反應物置于可見光分析儀下，檢測400-700nm處直接反映吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收速度/程度，得出半乳糖濃度大小測定結果。
2. —種半乳糖診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20-500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——4000mmol/L半乳糖氧化酶 1000——80000 U/L過氧化物酶 500——80000 U/L還原型色原體組合 0.1——20 mmol/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。3. 根據(jù)權利要求2所述半乳糖診斷/測定試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、半乳糖氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合 組成單劑試劑。4. 根據(jù)權利要求2所述半乳糖診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、半乳糖氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合 組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合組成；試劑2,由緩沖液、穩(wěn)定劑、半乳糖氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成。過氧化物酶、還原型色原體組合、半乳糖氧化酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。5. 根據(jù)權利要求2所述半乳糖診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、半乳糖氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合組成; 試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合組成；試劑3，由緩沖 液、穩(wěn)定劑、半乳糖氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成。 過氧化物酶、還原型色原體組合半乳糖氧化酶在試劑1、試劑2或試 劑3中的位置可以不限。6. 根據(jù)權利要求2所述半乳糖診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括 穩(wěn)定劑l"4000mmol/L或0.P/。-100。/。體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。7. 根據(jù)權利要求2所述半乳糖診斷/測定試劑盒，其特征在于所述還原型色原體組合可以是下列28個組合中的任一個配對組合3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙^[-乙基__^ (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-雙乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-雙氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙雙甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2，2'-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒N-乙基一-N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N,N-雙乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2，4-雙氯石碳酸4-氨基抗砒2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸4-氨基抗砒 3，5-雙氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒 雙甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2,2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的半乳糖診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定半乳糖濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/食品檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、半乳糖氧化酶、過氧化物酶、還原型色原體組合及穩(wěn)定劑；通過一系列的酶促反應，最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400-700nm波長處，測定染料含量的高低，進而直接反映出半乳糖濃度的大小。
文檔編號C12Q1/00GK101324581SQ20071002338
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司