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甲酸診斷/測定試劑盒及甲酸濃度測定方法

文檔序號:590763閱讀:252來源:國知局
專利名稱:甲酸診斷/測定試劑盒及甲酸濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種甲酸診斷/測定試劑盒,同時本發(fā)明還涉及測定甲酸濃 度的方法,屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境/工業(yè)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景甲酸(HCOOH)在室溫下有自然分解的特性,同時,測試過程中不可 避免地有一部分水分混入甲酸,甲酸是無色透明和發(fā)煙的液體.有濃烈的 刺激性酸味。 一般在工業(yè)及環(huán)境監(jiān)測中使用氣相色譜法;在醫(yī)藥及農(nóng)業(yè)上使用酶法分析,酶法分析已被多個國際權(quán)威組織或機構(gòu)采納如IFU (國 際果汁生產(chǎn)者協(xié)會),AIJN (歐盟果蔬汁及飲料生產(chǎn)者聯(lián)盟),及MEBAK, OICC, VDLUFA等組織廣為推崇,并確定為標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù),監(jiān)測還原 型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化,得以測定甲 酸濃度的方法,同時,本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的甲酸診斷/測定試 劑盒,采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀 上進行甲酸濃度測定,而且測定速度快、準(zhǔn)確度高,因而可以得到切實的 推廣應(yīng)用。本發(fā)明甲酸濃度測定方法原理如下4甲酸+高鐵細胞色素 甲酸脫氫酶 二氧化碳+亞鐵細胞色素 二氧化碳+丙酮酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶(脫羧化)L-蘋果酸+輔酶這種方法應(yīng)用甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase; EC 1.2.2.1; EC 1.2.2.3)偶聯(lián)蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase; EC 1.1.1.38; EC 1.1.1.39; EC 1丄1.40; EC 1丄1.83)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法/終點比色法。甲酸脫氫酶 酶解甲酸反應(yīng)產(chǎn)生二氧化碳,再通過偶聯(lián)蘋果酸脫氫酶的作用,最終將還 原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰), 從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度/速度,通過測量 340nm處吸光度下降的程度/速度,可以測算甲酸的濃度大小。實驗表明,從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮, 無論是單劑、雙劑還是三劑,如下成分關(guān)系的本發(fā)明甲酸診斷/測定試劑盒 較為理想緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L高鐵細胞色素 10 mmol/L丙酮酸 30 mmol/L甲酸脫氫酶 10000 U/L蘋果酸脫氫酶 16000 U/L酶、蘋果酸脫氫酶。試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也可以配制成液體 試劑,直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、高鐵細胞色素、丙酮酸。試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、甲酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶。 還原型輔酶、高鐵細胞色素、丙酮酸、甲酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水 溶解后使用;也可以配制成液體試劑,直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑l緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、高鐵細胞色素、丙酮酸。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、蘋果酸脫氫酶。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、甲酸脫氫酶。還原型輔酶、高鐵細胞色素、丙酮酸、甲酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶在試 劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使 用前加水溶解后使用;也可以配制成液體試劑,直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑,本發(fā)明測定甲酸濃度的方法,其還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一本實施例的甲酸診斷/測定試劑為單試劑,包括100mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 30 mmol/L三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 高鐵細胞色素 丙酮酸甲酸脫氫酶 10000 U/L蘋果酸脫氫酶 16000 U/L試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,進行冷凍干燥,制成干粉試劑;使用 前,加入純凈水,復(fù)溶后使用。在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37"C,反應(yīng)時間10分鐘,起始吸光 度1.8±0.7,測試主波長340nm,測試副波長405nm,被測甲酸樣品與試 劑的體積比例為1/25,反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng)),延遲時間大約0 分鐘左右,檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應(yīng),最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下,檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度,從而測算出甲酸的濃度 大小。 實施例二本實施例的甲酸診斷/測定試劑為雙試劑,包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L高鐵細胞色素丙酮I10 mmol/L30 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑甲酸脫氫酶蘋果酸脫氫酶100 mmol/L500 mmol/L10000 U/L16000 U/L試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,制成液體雙試劑,可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C,反應(yīng)時間10分鐘,起始吸光度1.8±0.7,測試主波長340nm,測試副波長405nm,被測甲酸樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5,反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng)),延遲時間大約0分鐘左右,檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應(yīng),最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下,檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度,從而測算出甲酸的濃度大小。實施例三本實施例的甲酸診斷/測定試劑為三試劑,包括試劑1三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶高鐵細胞色素丙酮酸試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 10 mmol/L 30 mmol/L蘋果酸脫氫 100 mmol/L 500 mmol/L 16000 U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑甲酸脫氫酶廳mmol/L500 mmol/L10000U/L試劑全部溶解配好后,分裝入瓶,制成液體三試劑,可以直接使用。測定甲酸濃度時,在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C,反應(yīng)時間10分鐘,起始吸光度1.8±0.7,測試主波長340nm,測試副波長405nm, 被測甲酸樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5,反應(yīng)方向 為負反應(yīng)(下降反應(yīng)),延遲時間大約0分鐘左右,檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后,使之混合并發(fā)生反應(yīng),最終辨反應(yīng)物置于生化分析 儀下,檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度,從而測算出甲酸的濃度 大小。申請人經(jīng)過實驗驗證,釆用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達到本發(fā)明的目的,鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同,不另一一例舉??傊瑢嶒炞C明,采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結(jié)果,并且靈敏度高、精確度好,便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的甲酸濃度測定方法,其方法原理如下甲酸+高鐵細胞色素甲酸脫氫酶二氧化碳+亞鐵細胞色素二氧化碳+丙酮酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶(脫羧化) L-蘋果酸+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下,檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度,測算出甲酸的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種甲酸診斷/測定試劑盒,主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——4000 mmol/L還原型輔酶 0.1——0.35 mmol/L高鐵細胞色素 1——50 mmol/L丙酮酸 1——50mmol/L甲酸脫氫酶 . 1000——80000 U/L蘋果酸脫氫酶 1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài),在使用前加水溶解后使用;也可 以配制成液體試劑,直接使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述甲酸診斷/測定試劑盒,其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、高鐵細胞色素、丙酮酸、甲酸脫氫酶、 蘋果酸脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述甲酸診斷/測定試劑盒,其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、高鐵細胞色素、丙酮酸、甲酸脫氫酶、 蘋果酸脫氫酶組成雙劑試劑;試劑1,由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、 高鐵細胞色素、丙酮酸組成;試劑2,由緩沖液、穩(wěn)定劑、甲酸脫氫酶、 蘋果酸脫氫酶組成。還原型輔酶、高鐵細胞色素、丙酮酸、甲酸脫氫酶、 蘋果酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述甲酸診斷/測定試劑盒,其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、高鐵細胞色素、丙酮酸、甲酸脫氫酶、 蘋果酸脫氫酶組成多劑試劑;試劑l,由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、 高鐵細胞色素、丙酮酸組成;試劑2,由緩沖液、穩(wěn)定劑、蘋果酸脫氫 酶組成;試劑3,由緩沖液、穩(wěn)定劑、甲酸脫氫酶組成。還原型輔酶、 高鐵細胞色素、丙酮酸、甲酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶在試劑l、試劑2 或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述甲酸診斷/測定試劑盒,其特征在于還包括穩(wěn)定 劑l一OOO mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的甲酸診斷/測定試劑盒,同時本發(fā)明還涉及測定甲酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分,屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境/工業(yè)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、高鐵細胞色素、丙酮酸、甲酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶及穩(wěn)定劑;通過將樣品與試劑按一定的體積比混合,使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng),再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下,檢測主波長340nm處吸光度下降的程度/速度,從而測算出甲酸的濃度大小。
文檔編號C12Q1/26GK101324516SQ200710023388
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司
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