專利名稱：谷氨酸診斷/測定試劑盒及谷氨酸濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種谷氨酸診斷/測定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定谷氨 酸濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB5009-2003味精衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分析方法有1. 旋光計(jì)法2.甲醛滴定法3.凱氏定氮法。味精系指以糧食及制品為原料經(jīng)發(fā) 酵提純的谷氨酸鈉。酶法分析是國際上公認(rèn)的谷氨酸鹽的分析方法，已被多個(gè)國際權(quán)威組織 或機(jī)構(gòu)采納如IFU (國際果汁生產(chǎn)者協(xié)會(huì))，AIJN (歐盟果蔬汁及飲料生 產(chǎn)者聯(lián)盟)，及MEBAK，OICC，VDLUFA等組織廣為推崇，并確定為標(biāo)準(zhǔn) 檢測方法。已被寫入澳大利亞，荷蘭，德國，瑞士等多個(gè)國家的食品法。 國內(nèi)也有數(shù)家果汁、酒類加工企業(yè)使用酶法試劑盒作為檢測標(biāo)準(zhǔn)。生物體內(nèi)存在分解骨質(zhì)的破骨細(xì)胞和形成骨骼的成骨細(xì)胞，正常情況下 兩種細(xì)胞的作用保持著良好的平衡。如果平衡被打破、破骨細(xì)胞過于活躍， 就會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。破骨細(xì)胞中含有谷氨酸，而一種名為"谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體" 的蛋白可以將谷氨酸排出破骨細(xì)胞，被"釋放"的谷氨酸會(huì)和細(xì)胞表面的受 體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的酶，抑制破骨細(xì)胞分解骨質(zhì)的作用。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測還原 型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定谷 氨酸濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的谷氨酸診斷/測 定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分 析儀上進(jìn)行谷氨酸濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到 切實(shí)的推廣應(yīng)用。本發(fā)明谷氨酸濃度測定方法原理如下L-谷氨酸+氧+水谷氨酸氧化酶氨離子+ 2-酮戊二酸酯+過氧化氫過氧化氫+還原型輔酶NADH過氧化物酶輔酶+ 2水 這種方法應(yīng)用谷氨酸氧化酶(glutamate oxidase; EC 1.4.3.7; EC 1.4.3.11) 偶聯(lián)NADH過氧化物酶(NADHperoxidase; ECl.ll丄l; EC 1.11.1.2)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法/終點(diǎn)比色法。谷氨酸氧化酶酶解谷氨酸反應(yīng)產(chǎn)生過氧化 氫，再通過(偶)聯(lián)合NADH過氧化物酶的作用，最終將還原型輔酶(在 340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以 測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度/速度，通過測量340nm處 吸光度下降的程度'/速度，可以測算谷氨酸的濃度大小。實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明谷氨酸診斷/測定試劑 盒較為理想緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L谷氨酸氧化酶 10000 U/LNADH過氧化物酶 16000 U/L本發(fā)明的谷氨酸診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酸氧化酶、NADH過氧化物酶。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑-試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶、NADH過氧化物酶。 還原型輔酶、谷氨酸氧化酶、NADH過氧化物酶在試劑1或試劑2中的 位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、NADH過氧化物酶。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶。還原型輔酶、谷氨酸氧化酶、NADH過氧化物酶在試劑1、試劑2或試 劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使 用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定谷氨酸濃度的方法，其還原型 輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一本實(shí)施例的谷氨酸診斷/測定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L谷氨酸氧化酶 10000U/L NADH過氧化物酶 16000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用 前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37。C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光 度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測谷氨酸樣品與 試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約O 分鐘左右，檢測時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出谷氨酸的濃度大小。 實(shí)施例二本實(shí)施例的谷氨酸診斷/測定試劑為雙試劑，包括:試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑谷氨酸氧化酶畫mmol/L500 mmol/L10000 U/LNADH過氧化物酶 16000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測谷氨酸樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約O分鐘左右，檢測時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出谷氨酸的濃度大小。實(shí)施例三本實(shí)施例的谷氨酸診斷/測定試劑為三試劑，包括:試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑NADH過氧化物酶 試劑3三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L歸mmol/L500 mmol/L16000U/L100腿ol/L500 mmol/L10000 U/L:試劑，可以直接使用谷氨酸氧化酶 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體測定谷氨酸濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時(shí) 間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測谷氨酸樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方 向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，從而測算出谷氨酸的濃 度大小。申請人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的谷氨酸濃度測定方法，其方法原理如下L-谷氨酸+氧+水谷氨酸氧化酶氨離子+2-酮戊二酸酯+過氧化氫過氧化氫+還原型輔酶NADH過氧化物酶輔酶+2水將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度/速度，測算出谷氨酸的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種谷氨酸診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——4000 mmol/L還原型輔酶 0.1——0.35 mmol/L谷氨酸氧化酶 1000——80000 U/LNADH過氧化物酶 1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述谷氨酸診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酸氧化酶、NADH過氧化物酶組 成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述谷氨酸診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酸氧化酶、NADH過氧化物酶成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶組成；試劑2， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、谷氨酸氧化酶、NADH過氧化物酶組成。還原型輔 酶、谷氨酸氧化酶、NADH過氧化物酶在試劑1或試劑2中的位置可以 不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述谷氨酸診斷/測定試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、谷氨酸氧化酶、NADH過氧化物酶組 成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶組成；試劑2， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、NADH過氧化物酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定 劑、谷氨酸氧化酶組成。還原型輔酶、谷氨酸氧化酶、NADH過氧化物 酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述谷氨酸診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn) 定劑l"000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的谷氨酸診斷/測定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定谷氨酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、谷氨酸氧化酶、NADH過氧化物酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度/速度，從而測算出谷氨酸的濃度大小。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK101324569SQ20071002339
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司