專利名稱：錳離子診斷/測定試劑盒及錳離子濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種錳離子診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定 錳離子濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景錳作為一種微量元素在人體中是不可或缺的必需成分，同時也是對 人體有毒的物質(zhì)。在自然狀態(tài)下，以兩價、三價和四價的形式存在， 氧化程度越低，毒性越高。通常錳有八種不同的氧化狀態(tài)。錳的生物 學(xué)意義是作為人體中輔助因子有多種多樣的功能。然而，在許多酶激活反應(yīng)中，Mn"和Mg^可互相替代。常用石墨爐原子吸收分光光度測定法、原子發(fā)射ICP-OES。中子激 發(fā)分析(NAA)是最好的方法，但僅能在一些條件好的實驗室才能測 定。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶循環(huán)擴增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色》去(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測還原型煙酰 胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定錳離 子濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的錳離子診斷/ 測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行錳離子濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因 而可以得到切實的推廣應(yīng)用。本發(fā)明錳離子濃度測定方法原理如下-草酰乙酸草酰乙酸脫羧酶/Mi^丙酮酸+ 二氧化碳 丙酮酸+氨離子+還原型輔酶 丙氨酸脫氫酶 L-丙氨酸+水+輔酶丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨離子+丙酮酸+過氧化氫這種方法應(yīng)用需要錳離子激活的草酰乙酸脫羧酶(oxaloacetate decarboxylase ; EC 4.L1.3 )酶(偶)聯(lián)丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase ; EC 1.4.1.1)、甘氣酸氧4t醇(glycine oxidase ; EC 1.4.3.19)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法。草酰乙酸脫羧酶作為作用酶，在錳離 子的激活下，功能為將草酰乙酸酶解產(chǎn)生丙酮酸。丙氨酸脫氫酶也作 為作用酶，它的酶促作用使丙酮酸變成丙氨酸。甘氨酸氧化酶作為循 環(huán)酶將丙氨酸再次變回丙酮酸，使草酰乙酸脫羧酶酶解草酰乙酸產(chǎn)生 的丙酮酸不斷地被重復(fù)循環(huán)利用。丙氨酸脫氫酶同時作為顯色酶，將 還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為氧化型輔酶(在340nm 處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的 速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算錳離子的濃度 大小。實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明錳離子診斷/測定試劑盒較為理想 緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 氨離子 草酰乙酸 草酰乙酸脫羧酶100mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 2 mmol/L 20 mmol/L 10000U/L 10000 U/L甘氨酸氧化酶 10000 U/L本發(fā)明的錳離子診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、氨離子、草酰乙酸 脫羧酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、氨離子。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、草酰乙酸脫羧酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸 氧化酶。還原型輔酶、草酰乙酸、氨離子、草酰乙酸脫羧酶、丙氨酸脫氫酶、 甘氨酸氧化酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使 用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑試劑l- 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、氨離子。試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、草酰乙酸脫羧酶。 還原型輔酶、草酰乙酸、氨離子、草酰乙酸脫羧酶、丙氨酸脫氫酶、 甘氨酸氧化酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒 可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑， 直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定錳離子濃度的方法，其還 原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一本實施例的錳離子診斷/測定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/氨離子 2 mmol/L草酰乙酸 20mmol/L 草酰乙酸脫羧酶 10000 U/L丙氨酸脫氫酶 10000 U/L甘氨酸氧化酶 10000 U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測錳離子樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約2分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出錳離子的濃度大小。實施例二本實施例的錳離子診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 2 mmol/L 20 mmol/L草酰乙酸試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L草酰乙酸脫羧酶 10000 U/L丙氨酸脫氫酶 10000 U/L甘氨酸氧化酶 10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm,測試副波長405nm，被測錳離 子樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下 降反應(yīng))，延遲時間大約2分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出錳離子 的濃度大小。 實施例三本實施例的錳離子診斷/測定試劑為三試劑，包括試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶草酰乙酸10Ommol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 2 mmol/L 20 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑甘氨酸氧化 100mmol/L 500 mmol/L10000U/L10000U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑100mmol/L500 mmol/L草酰乙酸脫羧酶 10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定錳離子濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反 應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度1.8土0.7，測試主波長340nm，測試副波 長405nm，被測錳離子樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為 4/40/5/5，反應(yīng)方向為負反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時間大約2分鐘左右， 檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出錳離子 的濃度大小。申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉?？傊瑢嶒炞C明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用o
權(quán)利要求
1.一種利用酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的錳離子濃度測定方法，其方法原理如下草酰乙酸草酰乙酸脫羧酶/Mn2+丙酮酸+二氧化碳丙酮酸+氨離子+還原型輔酶丙氨酸脫氫酶L-丙氨酸+水+輔酶丙氨酸+水+氧甘氨酸氧化酶氨離子+丙酮酸+ 過氧化氫將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出錳離子的濃度大小。
2. —種錳離子診斷/測定試劑盒，主要成分包括: 緩沖液20-500 mmol/L穩(wěn)定劑1— 4000mmol/L還原型輔酶0.1-0.35 mmol/L草酰乙酸—50 mmol/L草酰乙酸脫羧酶1000—80000 U/L丙氨酸膠氫酶1000—80000 U/L甘氨酸氧化酶1000—80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用: 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、氨離子、草酰乙酸脫 羧酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、氨離子、草酰乙酸脫 羧酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶組成雙劑試劑；試劑l,由緩 沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、氨離子組成；試劑2，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、草酰乙酸脫羧酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶 組成。還原型輔酶、草酰乙酸、氨離子、草酰乙酸脫羧酶、丙氨酸 脫氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、氨離子、草酰乙酸脫 羧酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶組成多劑試劑；試劑l，由緩 沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、氨離子組成；試劑2，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、丙氮酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶組成；試劑3，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、草酰乙酸脫羧酶組成。還原型輔酶、草酰乙酸、 氨離子、草酰乙酸脫羧酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶在試劑1、 試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測定試劑盒，其特征在于還包 括穩(wěn)定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的錳離子診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定錳離子濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、草酰乙酸、氨離子、草酰乙酸脫羧酶、丙氨酸脫氫酶、甘氨酸氧化酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出錳離子濃度的大小。
文檔編號C12Q1/26GK101324624SQ20071002339
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司