專(zhuān)利名稱(chēng)：蔗糖測(cè)定試劑盒及蔗糖濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蔗糖測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定蔗糖濃度的 方法，屬于食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景當(dāng)前，蜂蜜摻假的現(xiàn)象嚴(yán)重，據(jù)調(diào)查，在基層收購(gòu)的蜂蜜中，出現(xiàn)的摻假的樣品中，蔗糖的含量多在10-28%之間，有的甚至高達(dá)50%以上。另外， 在中、低檔茶葉加工時(shí)摻糖，以增加重量謀取不法利益的現(xiàn)象也比較普遍。 無(wú)糖食品查出含有蔗糖的問(wèn)題，也時(shí)有所聞，對(duì)糖尿病患者造成危害。申請(qǐng)專(zhuān)利號(hào)200510099310.4的一種甘蔗汁中蔗糖含量的檢測(cè)方法，公 開(kāi)一種蔗糖的測(cè)定方法，其方法包括蔗糖的水解，還原糖與鐵氰化鉀的反 應(yīng)，亞鐵氰化鉀的電位滴定等步驟。由于用常規(guī)的滴定法測(cè)定蔗糖含量過(guò)程繁瑣，準(zhǔn)確性差，也有利用高效 液相色譜儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.8-85公布了食品中蔗糖的測(cè)定方 法，其原理為樣品經(jīng)除去蛋白質(zhì)后，其中蔗糖經(jīng)鹽酸水解轉(zhuǎn)化為還原糖， 再按還原糖測(cè)定。水解前后還原糖的差值為蔗糖含量。本國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó) 衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)委員會(huì)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分委員會(huì)提出，由衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督 檢驗(yàn)所歸口。本國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)由衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗(yàn)所負(fù)責(zé)起草。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶(偶)聯(lián)法(CoupleReaction)技術(shù)，監(jiān)測(cè)還原 型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定蔗 糖濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的蔗糖測(cè)定試劑盒， 采用該試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行 蔗糖濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng) 用。本發(fā)明蔗糖濃度測(cè)定方法原理如下蔗糖蔗糖酶D-葡萄糖+ D-果糖D-果糖+還原型輔酶甘露醇脫氫酶甘露醇+輔酶這種方法應(yīng)用蔗糖酶(sucrase; EC 3.2丄48)偶聯(lián)甘露醇脫氫酶(Mannito1 dehydrogenase; EC 1丄1.138; EC LU.67)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法/終點(diǎn)比色 法。蔗糖酶酶解蔗糖反應(yīng)產(chǎn)生果糖，再通過(guò)偶聯(lián)甘露醇脫氫酶的作用，最 終將還原型輔酶(在340nrn處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒(méi)有 吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度/速度， 通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度下降的程度/速度，可以測(cè)算蔗糖的濃度大小。實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性?xún)煞矫婢C合考慮， 無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明蔗糖測(cè)定試劑盒較為 理想緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L蔗糖酶 10000 U/L甘露醇脫氫酶 12000 U/L本發(fā)明的蔗糖測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、蔗糖酶、甘露醇脫氫酶。 試劑盒可以是千粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑-試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、蔗糖酶、甘露醇脫氫酶。 還原型輔酶、蔗糖酶、甘露醇脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不 限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、甘露醇脫氫酶。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、蔗糖酶。 還原型輔酶、蔗糖酶、甘露醇脫氫酶在試劑l、試劑2或試劑3中的位500 mmol/L 0.25 mmol/L置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以 配制成液體試劑，直接使用。無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定蔗糖濃度的方法，其還原型輔 酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。本實(shí)施例的蔗糖測(cè)定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 還原型輔酶蔗糖酶 10000 U/L甘露醇脫氫酶 12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉^;劑；使用 前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光 度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)蔗糖樣品與試 劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0 分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出蔗糖的濃度 大小。實(shí)施例二本實(shí)施例的蔗糖測(cè)定試劑為雙試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶100mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100 mmol/L穩(wěn)定劑甘露醇脫氫酶500 mmol/L10000U/L12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)蔗糖樣品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出蔗糖的濃度大小。實(shí)施例三 ， 本實(shí)施例的蔗糖測(cè)定試劑為三試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L還原型輔酶0.25 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩; 穩(wěn)定劑甘露醇脫氫酶100 mmol/L 500 mmol/L 12000 U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100 mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L蔗$10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定蔗糖濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時(shí)間 10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nrn， 被測(cè)蔗糖樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向 為負(fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析 儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出蔗糖的濃度 大小。申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類(lèi)同， 不另一一例舉。總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析儀 器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的蔗糖濃度測(cè)定方法，其方法原理如下蔗糖 蔗糖酶 D-葡萄糖+D-果糖D-果糖+還原型輔酶 甘露醇脫氫酶 甘露醇+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，測(cè)算出蔗糖的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種蔗糖測(cè)定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20——50Ommol/L穩(wěn)定劑 1——4000 mmol/L還原型輔酶 0.1——0.35 mmol/L蔗糖酶 1000——80000 U/L甘露醇脫氫酶 1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述蔗糖測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、蔗糖酶、甘露醇脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述蔗糖測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、蔗糖酶、甘露醇脫氫酶組成雙劑試劑; 試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn) 定劑、蔗糖酶、甘露醇脫氫酶組成。還原型輔酶、蔗糖酶、甘露醇脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述蔗糖測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、蔗糖酶、甘露醇脫氫酶組成多劑試劑; 試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn) 定劑、甘露醇脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、蔗糖酶組成。 還原型輔酶、蔗糖酶、甘露醇脫氫酶在試劑l、試劑2或試劑3中的位 置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述蔗糖測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 1~4000 mmol/L或0.1%-100°/。體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol),丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的蔗糖測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定蔗糖濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于食品檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、蔗糖酶、甘露醇脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出蔗糖的濃度大小。
文檔編號(hào)C12Q1/26GK101329267SQ20071002473
公開(kāi)日2008年12月24日 申請(qǐng)日期2007年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月21日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司