專利名稱：：軟米水稻低直鏈淀粉含量基因位點的分子標記方法
技術領域：
：本發(fā)明提供了云南軟米水稻品種毫屁低直鏈淀粉含量基因位點的分子標記方法，屬于分子遺傳學領域，專用于水稻低直鏈淀粉含量的選育和種質(zhì)資源的利用。二
背景技術：
：近年來，隨著國民經(jīng)濟的迅速發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，對稻米品質(zhì)提出了越來越高的要求，加強優(yōu)質(zhì)稻米品質(zhì)形成的分子生物學研究、選育優(yōu)質(zhì)水稻品種至關重要。稻米胚乳的主要成分是淀粉，稻米胚乳淀粉可以分為直鏈淀粉和支鏈淀粉，研究表明直鏈淀粉含量及直鏈淀粉鏈長是稻米食味品質(zhì)的決定因素，同時也影響著米飯質(zhì)地。低直鏈淀粉含量米飯硬度小、粘度大、食味品質(zhì)好，是改良稻米直鏈淀粉含量和食味品質(zhì)的理想材料。云南軟米水稻品種毫屁具有米飯柔軟、富有彈性、有光澤、口感佳、硬度小、粘度大、食味品質(zhì)好的特點，是改良稻米直鏈淀粉含量和食味品質(zhì)的理想材料。將毫屁與高直鏈淀粉含量水稻品種南京11和糯稻品種驚人糯雜交，其^的直鏈淀粉含量均在雙親之間，并偏向于直鏈淀粉含量高的親本，F(xiàn)2和BdF的直鏈淀粉含量分別符合3:1和1:1的分離比例，進一步將毫屁與Wx基因突變體MilkyQueen雜交，F(xiàn)2種子的直鏈淀粉含量在雙親平均值附近呈單峰分布，表明毫屁低直鏈淀粉含量是Wx基因突變導致。三
發(fā)明內(nèi)容技術問題本發(fā)明的目的是提供云南軟米水稻品種毫屁低直鏈淀粉含量基因位點的分子標記方法，通過檢測該標記位點的分子標記，可以預測水稻植株的直鏈淀粉含量，加快低直鏈淀粉含量水稻的選擇進度。技術方案云南軟米水稻品種毫屁低直鏈淀粉含量基因位點的分子標記方法，其特征在于-用標記弓I物dCAPs-SalI-hp，左端弓1物序列5'-GTGGAGTCGACCGTGTGTTCGTCG-3'右端弓I物序歹U5'-CCCCAAACCTGAAATCACCAGTGGA-3'擴增毫屁基因組DNA，然后用Sail限制性內(nèi)切酶酶切，如果能得到151bp和145bp兩條片斷，則標志著云南軟米水稻品種低直鏈淀粉含量基因位點的存在。有益效果本發(fā)明所提供的云南軟米水稻品種毫屁低直鏈淀粉含量基因位點的分子標記方法，具有以下優(yōu)點(1)通過本發(fā)明分子標記可以獲得水稻低直鏈淀粉含量基因位點；(2)通過本發(fā)明分子標記標記選擇的低直鏈淀粉含量基因位點位置明確，鑒定方便。通過檢測該分子標記，即可以預測水稻植株的直鏈淀粉含量，用于水稻品種或品系的基因型檢測，以判斷該品種或品系是否具有低直鏈淀粉含量，進而快速篩選低直鏈淀粉含量的品種或品系用于水稻育種。該方法檢測方便快速，不受環(huán)境影響；(3)輔助育種選擇目標明確，節(jié)約成本。在傳統(tǒng)育種方法中，首先要收集具有低直鏈淀粉含量的親本與栽培品種進行一系列雜交，而且要對直鏈淀粉含量進行單株測定。因此低直鏈淀粉含量育種極其費時。通過檢測低直鏈淀粉含量基因位點，可以在苗期就鑒定出低直鏈淀粉含量的單株，淘汰其它植株，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高低直鏈淀粉水稻的選擇效率。四圖1dCAPs標記檢測毫屁、毫木細和毫安悶1、3、5、7和9分別為以毫屁、毫皮、毫木細、毫安悶和日本晴基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物Sail酶切前電泳條帶，2、4、6、8和10分別為以毫屁、毫皮、毫木細、毫安悶和日本晴基因組DNA為模板的PCR產(chǎn)物Sail酶切后的電泳條帶。圖2dCAPs標記檢測湖南、廣西、福建、江西、浙江、黑龍江和吉林品種資源五具體實施例方式遺傳分析和等位性測驗表明，毫屁低直鏈淀粉含量由Wx等位基因控制。根據(jù)水稻全基因組序列信息設計引物，利用overlappingPCR方法，并對PCR產(chǎn)物直接測序，獲得毫屁W;c約7kb的基因組序列，序列分析結(jié)果為在編碼區(qū)第四外顯子(+497個)處存在單堿基突變(堿基A突變?yōu)镚)，編碼子由GAC突變?yōu)镚GC,導致了天門冬氨酸突變?yōu)楦拾彼帷８鶕?jù)第四外顯子的單核苷酸突變位點設計dCAPs標記，在利用毫屁軟米開展低直鏈淀粉稻米分子育種時，可進行分子標記輔助選擇。(一)標記篩選(1)云南軟米水稻品種毫屁與高直鏈淀粉水稻品種南京11正反雜交，F(xiàn)i種子直鏈淀粉含量均偏向于南京U。F2和Bd^種子中，高直鏈淀粉含量與低直鏈淀粉含量種子數(shù)分別符合3:1和1:1分離比，表明其低直鏈淀粉由一對隱性核基因控制。(2)云南軟米品種毫屁與Wx基因糯性突變體驚人糯雜交，F(xiàn)!種子直鏈淀粉含量介于兩親之間，接近毫屁。F2和BQF^巾子中，低直鏈淀粉含量種子與糯性種子的分離分別符合3:1和1:1比例，進一步根據(jù)F2,3家系推知各F2中顯性純合雜合隱性純合個體的比例符合l:2:1，表明毫屁低直鏈淀粉基因與Wx等位。(3)進一步將毫屁與Wx基因突變體MilkyQueen雜交，F(xiàn)2種子直鏈淀粉含量在雙親平均值附近呈單峰分布，也表明毫屁低直鏈淀粉含量受Wx等位基因控制。(4)根據(jù)水稻全基因組序列信息設計引物，利用overlappingPCR方法(GenomeRes.1997,7:389-398)，并對PCR產(chǎn)物直接測序，獲得毫屁Wx約7kb的基因組序列，序列分析結(jié)果為編碼區(qū)在第四外顯子(+497個)處存在一個單堿基突變(堿基A突變?yōu)镚)，編碼子由GAC突變?yōu)镚GC，導致了天門冬氨酸突變?yōu)楦拾彼帷?5)根據(jù)第四外顯子的單核苷酸突變位點(+497處A突變?yōu)镚)設計dCAPs標記，dCAPs-Sall-hp引物序列為正義引物，5'-GTGGAGTCGACCGTGTGTTCGTCG-3'，反義引物，5'-CCCCAAACCTGAAATCACCAGTGGA-3'。表l.標記引物的序列及擴增片段大小標<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>反應體系包括DNA模板約10ng，10XLAbuffer1u1，LATaq(5u/u1)0.1U1，MgCl2(25mM)1li1，dNTPs(2.5mM)1u1,正義、反義引物(2mM)各1.5y1,然后加ddH20使體積到達lOjal，PCR程序為94°C4min;94。C30s，55。C30s，72°C3min，30個循環(huán)；72°C10min。酶切體系為，5WPCR擴增產(chǎn)物，2^110xbuffer，0.1|alSall限制性內(nèi)切酶，酶切總體積為20|al，酶切3h后在8免聚丙烯酰胺凝膠上電泳。(三)結(jié)果與分析以日本晴基因組DNA為模板擴增時，由于在正向引物中存在一個錯配，剛好和SNP位點形成一個Sail酶切位點，另外正向引物自身還存在另外一個Sail酶切位點，酶切后電泳分析可檢測到三條帶，大小分別為151bp、145bp、130bp。(圖1)而當以毫屁基因組DNA為模板時，只在正向引物中存在一個SalI酶切位點，酶切后電泳可檢測到兩條帶，大小分別為151bp和145bp(圖1)。利用該標記檢測另外101份云南品種資源，其中毫皮、毫木細和毫安悶Wx基因在標記位點同毫屁具有相同的基因型(圖l)。然后利用和毫屁相同的方法獲得這三個品種的W;c基因序列，序列分析表明這四個軟米具有序列完全一致的基因序列，驗證了dCAPs標記檢測結(jié)果的正確性。另外利用該標記分別檢測湖南、廣西、福建、江西、浙江、黑龍江和吉林品種資源各5份，結(jié)果表明，這些品種資源Wx基因在標記位點都和毫屁具有不同的基因型，毫屁低直鏈淀粉含量基因位點并不廣泛存在于各地品種中(圖2)。通過上述分子標記鑒定低直鏈淀粉含量基因位點來預測水稻品種低直鏈淀粉含量，預計可迅速提高我國水稻低直鏈淀粉含量品種的育種進程。本發(fā)明所涉及的材料均為公知公用材料云南軟米品種毫屁(中國農(nóng)業(yè)科學，2004，37(2):157-162)，高直鏈淀粉水稻品種南京ll(江蘇農(nóng)學院學報，1989，10(1):7-12)，Wx基因糯性突變體驚人糯(遺傳學報,2003,30(7):641-645)，Wx基因突變體MilkyQueen(BreedingScience,2002,52:131-135)，粳稻品種日本晴(作物學報，2007，33(6):979-986)。權利要求1、云南軟米水稻品種毫屁低直鏈淀粉含量基因位點的分子標記方法，其特征在于，用標記引物dCAPs-SalI-hp左端引物序列5’-GTGGAGTCGACCGTGTGTTCGTCG-3′右端引物序列5′-CCCCAAACCTGAAATCACCAGTGGA-3′擴增云南軟米水稻品種毫屁的DNA，然后用SalI限制性內(nèi)切酶酶切，如果能得到151bp和145bp兩條片斷，則標志著云南軟米水稻品種毫屁低直鏈淀粉含量基因位點的存在。全文摘要本發(fā)明提供了云南軟米水稻品種毫屁低直鏈淀粉含量基因位點的分子標記方法，屬于分子遺傳學領域。用標記引物dCAPs-SalI-hp擴增云南軟米水稻品種毫屁的DNA，然后用SalI限制性內(nèi)切酶酶切，如果能得到151bp和145bp兩條片斷，則標志著云南軟米水稻品種毫屁低直鏈淀粉含量基因位點的存在。通過低直鏈淀粉含量基因位點的分子標記來檢測毫屁及其衍生品種(系)中是否含有該基因位點，可預測其直鏈淀粉含量水平，大大提高了低直鏈淀粉含量水稻的選擇效率。文檔編號C12N15/11GK101113468SQ200710025249公開日2008年1月30日申請日期2007年7月20日優(yōu)先權日2007年7月20日發(fā)明者萬建民,喜劉,劉世家,劉玲瓏,張文偉,玲江,翟虎渠,陳亮明,馬曉東申請人:南京農(nóng)業(yè)大學