專利名稱：重組豌豆白蛋白亞組分PA1b基因的異源表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種重組豌豆白蛋白亞組分PA1b基因在大腸桿菌和畢赤酵母中的異源表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
儲糧害蟲的危害是世界上糧食儲藏中的一個重要問題，它們能夠嚴(yán)重降低儲糧的產(chǎn)量和質(zhì)量。我國每年糧食收獲后由于儲糧害蟲造成約3％～5％的損失。據(jù)國家糧食局相關(guān)統(tǒng)計數(shù)字表明2004年中國的糧食總產(chǎn)量約為4.5億噸，農(nóng)戶儲糧約為2.7億噸，若能將儲糧損失由10％減少到4％左右，就等于增產(chǎn)了1620萬噸糧食，這相當(dāng)于我國產(chǎn)糧大省山東一年的小麥產(chǎn)量(2004年，山東省小麥總產(chǎn)量約1700萬噸)。因此，儲糧害蟲的防治工作應(yīng)引起大家的高度重視。
經(jīng)多年來的研究成果表明將谷物與豌豆(Pisum sativum)混合儲藏時，米象(Sitophilus oryzae)、玉米象(Sitophilus zeamais)和谷象(Sitophilus granarius)等儲糧害蟲存活與繁殖現(xiàn)象明顯減少，其中，起關(guān)鍵作用的主要成分是豌豆白蛋白家族成分1的亞組分b(Pea Albumin 1b，PA1b)。這種組分的氨基酸序列與豆種子蛋白的超家族成員如凝集素、蛋白酶抑制劑、淀粉酶抑制劑和其它的一些低分子量白蛋白序列表現(xiàn)出一定的同源性。該組分由37個氨基酸構(gòu)成，其中富含6個半胱氨酸，構(gòu)成3個分子內(nèi)二硫鍵，空間結(jié)構(gòu)高度緊密、異常穩(wěn)定。在對米象、玉米象、谷象和蚜蟲等多種昆蟲的喂食實驗中，都表現(xiàn)出具有顯著的毒性作用，是自然界中高效的生物殺蟲劑，是未來安全性為首要特征的生物農(nóng)藥開發(fā)應(yīng)用的又一重要資源。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種重組豌豆白蛋白亞組分PA1b基因在大腸桿菌和畢赤酵母中的異源表達(dá)方法。本發(fā)明利用基因工程的技術(shù)手段，采用DNA體外重組的方法，構(gòu)建能夠表達(dá)活性多肽的基因工程菌(大腸桿菌和畢赤酵母)，實現(xiàn)目的基因的異源表達(dá)。通過液體深層發(fā)酵密集培養(yǎng)的方式來獲取PA1b，可實現(xiàn)資源的工業(yè)化生產(chǎn)。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種重組豌豆白蛋白亞組分PA1b基因的異源表達(dá)方法，包括如下步驟(1)目的基因PA1b的合成；雙酶切PA1b基因與載體，構(gòu)建重組的表達(dá)載體以豌豆cDNA文庫為模板，以上游引物、下游引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增獲得PA1b基因片段；擴(kuò)增PA1b基因片段用Mini-preperation Kit(Qiagen)純化，并用內(nèi)切酶Xho I和Not I雙酶切，酶切片段經(jīng)純化后，通過連接酶連接入pPICZαA載體上，構(gòu)建表達(dá)產(chǎn)物的重組質(zhì)粒pPICZαA-PA1b。
所述上游引物Xho I-PA-F5′-CTC TCG AGA AAA GAG AGG CTG CTTCTT GCA ACG GTG TTT G-3′；所述下劃線部分C TCG AG為內(nèi)切酶Xho I位點；該引物使PA1b蛋白上游融合α因子分泌信號肽和Glu-Lys-Arg識別序列，該序列能被氨基肽酶Kex2識別。
所述下游引物Not I-PA-R5′-GAT CTC AGT GGT GGT GGT GG-3′。
(2)重組質(zhì)粒pPICZαA-PA1b轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌E.coli Top 10；步驟(1)獲得的重組質(zhì)粒pPICZαA-PA1b采用電轉(zhuǎn)化的方式導(dǎo)入大腸桿菌E.coli Top 10中，菌體在含抗生素Zeocin的LB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化菌；再將陽性轉(zhuǎn)化菌株接種到含抗生素Zeocin的LB液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。過夜后離心收集細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒pPICZαA-PA1b以及產(chǎn)物測定。
(3)重組質(zhì)粒pPICZαA-PA1b轉(zhuǎn)化宿主菌畢赤酵母菌GS115，構(gòu)建表達(dá)PA1b的基因工程菌將步驟(2)獲得的表達(dá)重組蛋白基因的質(zhì)粒pPICZαA-PA1b先用Sal I處理成線狀后，采用電轉(zhuǎn)化的方法將其導(dǎo)入畢赤酵母細(xì)胞(P.pastoris strain GS115，his4)(Invitrogen)；然后涂布在含抗生素Zeocin的YPD培養(yǎng)基中，涂布量分別為10～200μl；或者采用快速直接篩選多拷貝數(shù)的重組體的方法將轉(zhuǎn)化子涂布在高Zeocin含量(通常為500～2000μg/ml)的YPD培養(yǎng)基中，篩選轉(zhuǎn)化菌。
(4)PA1b基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)第一步，富集菌體從步驟(3)獲得的Zeocin抗性菌落接種到MGYH培養(yǎng)基中，在25～30℃下，振動培養(yǎng)至A600約為2.6；室溫下，發(fā)酵液低速離心移去上清液，收集細(xì)胞。
第二步，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)將上一步收集的細(xì)胞用BMMH培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞至A600為0.1，進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)抗蟲蛋白表達(dá)；每24h添加100％甲醇至終濃度為0.5％，維持誘導(dǎo)壓力，促使重組蛋白表達(dá)。
(5)表達(dá)產(chǎn)物的分離純化經(jīng)甲醇誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)的發(fā)酵液離心除去細(xì)胞后，上清液采用Ultrafree-15超濾膜(10K，Millipore Co.)分離；濾液進(jìn)一步用HPLC(高效液相色譜法)分離，收集組分真空冷凍干燥，得到異源表達(dá)生產(chǎn)的豌豆白蛋白亞組分PA1b。
所述步驟(1)中RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)94℃5min，94℃60s，55℃50s，72℃50s，35個循環(huán)，72℃10min，反應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行反應(yīng)總體積50μl，50pmol引物，115mmol/L MgCl2，0.5mmol/L dNTP和2.5U Taq DNA聚合酶。
所述步驟(2)電轉(zhuǎn)化條件為電壓1.5kv，電容25μF，電阻200Ω，電擊時間4～10毫秒。
所述步驟(4)中MGYH培養(yǎng)基組成為1.34％YNB(Yeast Nitrogen Base，酵母氮源基料，Invitrogen公司的酵母培養(yǎng)基產(chǎn)品)，1％甘油，450μg/L生物素，0.004％組氨酸。
所述步驟(4)中BMMH培養(yǎng)基組成為100mmol/L磷酸鈉，pH6.0，1.34％YNB，450μg/L抗生素Zeocin，0.5％甲醇和0.004％組氨酸。
所述步驟(5)中HPLC分離條件分離柱為5μN(yùn)ucleosil-300 C18(Hypersil)，洗脫液采用線性梯度乙腈(20％～100％，V/V，內(nèi)含0.1％三氟乙酸)，流速1ml/min。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點和有益效果本發(fā)明采用DNA體外重組的方法，構(gòu)建出了能夠表達(dá)PA1b的基因工程菌(大腸桿菌和畢赤酵母)，實現(xiàn)了PA1b基因的異源表達(dá)，通過液體深層發(fā)酵密集培養(yǎng)的方式來批量獲得目的產(chǎn)物，首次實現(xiàn)了植物活性多肽豌豆PA1b資源的規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明工藝簡便，成本低，產(chǎn)量高，重組蛋白獲得率約為20mg/L。在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)上具有優(yōu)勢，適合大規(guī)模生產(chǎn)。


圖1為大腸桿菌轉(zhuǎn)化子中pPICZα-PA1b質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增片段圖。
圖2為畢赤酵母轉(zhuǎn)化子中染色體DNA的PCR擴(kuò)增片段圖。
圖3為畢赤酵母轉(zhuǎn)化子中PA1b mRNA的Northern雜交分析圖。
圖4為畢赤酵母轉(zhuǎn)化子中PA1b表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳分析圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
重組豌豆白蛋白亞組分PA1b基因在大腸桿菌和畢赤酵母中的異源表達(dá)方法，包括如下步驟(1)目的基因PA1b的合成；雙酶切PA1b基因與載體，構(gòu)建重組的表達(dá)載體；設(shè)計下述上游引物、下游引物用于PCR擴(kuò)增上游引物Xho I-PA-F5′-CTC TCG AGA AAA GAG AGG CTG CTT CTTGCA ACG GTG TTT G-3′；下劃線部分為內(nèi)切酶Xho I位點；上游引物Xho I-PA-F使PA1b蛋白上游融合α因子分泌信號肽和Glu-Lys-Arg識別序列，該序列能被氨基肽酶Kex2識別。
下游引物Not I-PA-R5′-GAT CTC AGT GGT GGT GGT GG-3′。
以豌豆cDNA文庫為模板，以上游引物、下游引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增獲得PA1b基因片段(94℃5min，94℃ 60s，55℃ 50s，72℃ 50s，35個循環(huán)，72℃10min)。反應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行反應(yīng)總體積50μl，50pmol引物，115mmol/LMgCl2，0.5mmol/L dNTP和2.5U Taq DNA聚合酶。
擴(kuò)增PAlb片段用Mini-preperation Kit(Qiagen)純化，并用內(nèi)切酶Xho I和Not I雙酶切，酶切片段經(jīng)常規(guī)方法純化后，通過T4連接酶連接入巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)載體pPICZαA上，構(gòu)建表達(dá)產(chǎn)物的重組質(zhì)粒pPICZαA-PA1b。
(2)轉(zhuǎn)化宿主菌，構(gòu)建表達(dá)PA1b的基因工程菌；所述宿主菌為大腸桿菌和畢赤酵母。
I、重組質(zhì)粒pPICZαA-PA1b轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli Top 10約50～100ng上述重組質(zhì)粒pPICZαA-PA1b采用電轉(zhuǎn)化的方式(電壓1.5kv，電容25μF，電阻200Ω，電擊時間4～10毫秒)導(dǎo)入大腸桿菌E.coli Top10，菌體在含25μg/ml Zeocin的LB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化菌，轉(zhuǎn)化子檢測如圖1所示，其中MDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、3空質(zhì)粒對照--pPICZα；2、4、5質(zhì)粒pPICZα-PA1b；分別使用引物組合α-factor/3PA1b-R(產(chǎn)物144bp)和α-factor/3AOX1(產(chǎn)物362bp)。再將轉(zhuǎn)化菌接種到3ml含25μg/ml Zeocin的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。
II、轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GS115約10μg含表達(dá)蛋白基因的重組質(zhì)粒pPICZαA-PA1b先用Sal I處理成線狀后，采用電轉(zhuǎn)化的方法將其導(dǎo)入畢赤酵母細(xì)胞(P.pastoris strain GS115，his4)(Invitrogen)。然后涂布在含100μg/ml Zeocin的YPD培養(yǎng)基中，涂布量分別為10、25、50、100和200μl。其中快速和直接篩選多拷貝數(shù)的重組體的方法是將轉(zhuǎn)化子涂布在高Zeocin含量(500、1000和2000μg/ml)的YPD培養(yǎng)基中，篩選轉(zhuǎn)化菌。轉(zhuǎn)化結(jié)果檢測如圖2所示，MDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2使用引物組合α-factor/3PA1b-R(產(chǎn)物144bp)；4、5使用引物組合α-factor/3AOX1(產(chǎn)物362bp)；3空質(zhì)粒對照。
(3)PA1b基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)；基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)方法是采用兩步培養(yǎng)法第一步，富集菌體。接種步驟(2)獲得的Zeocin抗性酵母菌株到含50mlMGYH培養(yǎng)基(1.34％YNB，Yeast Nitrogen Base，Invitrogen公司的酵母培養(yǎng)基產(chǎn)品)，1％甘油，450μg/L生物素，0.004％組氨酸)的250ml三角瓶中，在30℃下培養(yǎng)24h(A600約2.6)，搖床轉(zhuǎn)速約300r/min。室溫25～30℃下，發(fā)酵液在離心力3000×g下離心10min，移去上清液，收集細(xì)胞。
第二步，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。將上一步收集的細(xì)胞用約200ml BMMH培養(yǎng)基(100mmol/L磷酸鈉，pH6.0，1.34％YNB，450μg/L抗生素Zeocin，0.5％(V/V)甲醇和0.004％(W/V)組氨酸)重新懸浮細(xì)胞至A600為0.1，放入1L燒瓶中培養(yǎng)，誘導(dǎo)抗蟲蛋白表達(dá)。每隔24h補(bǔ)加100％甲醇至發(fā)酵液中，以保持發(fā)酵液中甲醇的濃度為0.5％(V/V)，維持誘導(dǎo)壓力，促使重組蛋白表達(dá)。采用Northern blot雜交法進(jìn)行mRNA水平檢測，結(jié)果如圖3所示，MRNA分子量標(biāo)記(0.24-9.5kb)；C對照(GS115)；2、5、8、9、22不同的轉(zhuǎn)化菌株；采用SDS-PAGE電泳法檢測重組蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖4所示，M蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；C對照(GS115)；PPA1b對照SRA1；G9—轉(zhuǎn)化菌株G9。
(4)表達(dá)產(chǎn)物的分離純化。
步驟(3)中第二步所獲得的發(fā)酵上清液在離心力3000×g下離心10min，除去細(xì)胞后，采用Ultrafree-15超濾膜(10K，Millipore Co.)分離。濾液進(jìn)一步用HPLC分離，分離柱為5μN(yùn)ucleosil-300 C18(Hypersil)，洗脫液采用線性梯度乙腈(20％～100％，V/V，內(nèi)含0.1％三氟乙酸)，流速1ml/min。收集組分真空冷凍干燥。獲得異源表達(dá)生產(chǎn)的豌豆白蛋白亞組分PA1b。豌豆白蛋白亞組分PA1b的氨基酸殘基序列為Ala Ser Cys Asn Gly Val Cys Ser Pro Phe GluMet Pro Pro Cys Gly Thr Ser Ala Cys Arg Cys Ile Pro Val Gly Leu Val Ile Gly TyrCys Arg Asn Pro Ser Gly。根據(jù)實際所得純化蛋白的重量計算，重組蛋白的產(chǎn)量約為20mg/L。
SEQUENCE LISTING<110>華南理工大學(xué)<120>重組豌豆白蛋白亞組分PA1b基因的異源表達(dá)方法<130>32<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>40<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>上游引物Xho I-PA-F<400>1ctctcgagaa aagagaggct gcttcttgca acggtgtttg40<210>2<211>20<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>下游引物Not I-PA-R<400>2gatctcagtg gtggtggtgg 20
權(quán)利要求
1.一種重組豌豆白蛋白亞組分PA1b基因的異源表達(dá)方法，其特征在于包括如下步驟(1)目的基因PA1b的合成；雙酶切PA1b基因與載體，構(gòu)建重組的表達(dá)載體以豌豆cDNA文庫為模板，以上游引物、下游引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增獲得PA1b基因片段；擴(kuò)增PA1b基因片段用Mini-preperation Kit純化，并用內(nèi)切酶Xho I和Not I雙酶切，酶切片段經(jīng)純化后，通過連接酶連接入pPICZαA載體上，構(gòu)建表達(dá)產(chǎn)物的重組質(zhì)粒pPICZαA-PA1b；所述上游引物Xho I-PA-F5′-CTC TCG AGA AAA GAG AGG CTG CTT CTTGCA ACG GTG TTTG-3′；所述下游引物Not I-PA-R5′-GAT CTC AGT GGT GGT GGT GG-3′；(2)重組質(zhì)粒pPICZαA-PA1b轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌E.coli Top 10；步驟(1)獲得的重組質(zhì)粒pPICZαA-PA1b采用電轉(zhuǎn)化的方式導(dǎo)入大腸桿菌E.coli Top 10中，菌體在含抗生素Zeocin的LB培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化菌；再將陽性轉(zhuǎn)化菌株接種到含抗生素Zeocin的LB液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；過夜后離心收集細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒pPICZαA-PA1b；(3)重組質(zhì)粒pPICZαA-PA1b轉(zhuǎn)化宿主菌畢赤酵母菌GS115，構(gòu)建表達(dá)PA1b的基因工程菌將步驟(2)獲得的表達(dá)重組蛋白基因的質(zhì)粒pPICZαA-PA1b先用Sal I處理成線狀后，采用電轉(zhuǎn)化的方法將其導(dǎo)入畢赤酵母細(xì)胞；然后涂布在含抗生素Zeocin的YPD培養(yǎng)基中，涂布量分別為10～200μl；或者采用快速直接篩選多拷貝數(shù)的重組體的方法將轉(zhuǎn)化子涂布在高Zeocin含量的YPD培養(yǎng)基中，篩選轉(zhuǎn)化菌；(4)PA1b基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)第一步，富集菌體從步驟(3)獲得的Zeocin抗性菌落接種到MGYH培養(yǎng)基中，在25～30℃下，振動培養(yǎng)至A600為2.6；室溫下，發(fā)酵液低速離心移去上清液，收集細(xì)胞；第二步，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)將上一步收集的細(xì)胞用BMMH培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞至A600為0.1，進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)抗蟲蛋白表達(dá)；每24h添加100％甲醇至終濃度為0.5％，維持誘導(dǎo)壓力，促使重組蛋白表達(dá)；(5)表達(dá)產(chǎn)物的分離純化經(jīng)甲醇誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)的發(fā)酵液離心除去細(xì)胞后，上清液采用Ultrafree-15超濾膜分離；濾液進(jìn)一步用HPLC分離，收集組分真空冷凍干燥，得到異源表達(dá)生產(chǎn)的豌豆白蛋白亞組分PA1b。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組豌豆白蛋白亞組分PA1b基因的異源表達(dá)方法，其特征在于所述步驟(1)中RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)94℃5min，94℃60s，55℃ 50s，72℃ 50s，35個循環(huán)，72℃ 10min，反應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行反應(yīng)總體積50μl，50pmol引物，115mmol/L MgCl2，0.5mmol/L dNTP和2.5UTaq DNA聚合酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組豌豆白蛋白亞組分PA1b基因的異源表達(dá)方法，其特征在于所述步驟(2)電轉(zhuǎn)化條件為電壓1.5kv，電容25μF，電阻200Ω，電擊時間4～10毫秒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組豌豆白蛋白亞組分PA1b基因的異源表達(dá)方法，其特征在于所述步驟(4)中MGYH培養(yǎng)基組成為1.34％YNB，1％甘油，450μg/L生物素，0.004％組氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組豌豆白蛋白亞組分PA1b基因的異源表達(dá)方法，其特征在于所述步驟(4)中BMMH培養(yǎng)基組成為100mmol/L磷酸鈉，pH6.0，1.34％YNB，450μg/L抗生素Zeocin，0.5％甲醇和0.004％組氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組豌豆白蛋白亞組分PA1b基因的異源表達(dá)方法，其特征在于所述步驟(5)中HPLC分離條件分離柱為5μN(yùn)ucleosil-300C18，洗脫液采用線性梯度乙腈，流速1ml/min。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組豌豆白蛋白亞組分PA1b基因的異源表達(dá)方法，該方法包括目的基因PA1b的合成重組質(zhì)粒pPICZαA－PA1b轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌；轉(zhuǎn)化宿主菌畢赤酵母菌GS115，構(gòu)建表達(dá)PA1b的基因工程菌；PA1b基因工程菌的發(fā)酵培養(yǎng)。本發(fā)明采用DNA體外重組的方法，構(gòu)建出了能夠表達(dá)PA1b的基因工程菌，實現(xiàn)了PA1b基因的異源表達(dá)，通過液體深層發(fā)酵密集培養(yǎng)的方式來批量獲得目的產(chǎn)物，首次實現(xiàn)了植物活性多肽豌豆PA1b資源的規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明工藝簡便，成本低，產(chǎn)量高，重組蛋白獲得率約為20mg/L。
文檔編號C12N15/29GK101082046SQ20071002655
公開日2007年12月5日 申請日期2007年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月26日
發(fā)明者張毅, 許喜林 申請人:華南理工大學(xué)