專利名稱：豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和生物殺蟲(chóng)劑的技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白及其制備方法和在制備防治儲(chǔ)糧害蟲(chóng)的生物殺蟲(chóng)劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
儲(chǔ)糧害蟲(chóng)的危害是世界上糧食儲(chǔ)藏中的一個(gè)重要問(wèn)題，它們能夠嚴(yán)重降低儲(chǔ)糧的產(chǎn)量和質(zhì)量。我國(guó)每年糧食收獲后由于儲(chǔ)糧害蟲(chóng)造成約3％～5％的損失。據(jù)國(guó)家糧食局相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)字表明2004年中國(guó)的糧食總產(chǎn)量約為4.5億噸，農(nóng)戶儲(chǔ)糧約為2.7億噸，若能將儲(chǔ)糧損失由10％減少到4％左右，就等于增產(chǎn)了1620萬(wàn)噸糧食，這相當(dāng)于我國(guó)產(chǎn)糧大省山東一年的小麥產(chǎn)量。因此，儲(chǔ)糧害蟲(chóng)的防治工作應(yīng)引起大家的高度重視。這在當(dāng)前我國(guó)人口不斷增加，耕地面積不斷減少，糧食產(chǎn)量逐年下降，糧食缺口日益增大的形勢(shì)下，減少已經(jīng)收獲糧食的損失，開(kāi)發(fā)“無(wú)形糧田”，有著特別重要的意義。
經(jīng)多年來(lái)的研究成果表明將谷物與豌豆(Pisum sativum)混合儲(chǔ)藏時(shí)，米象(Sitophilus oryzae)、玉米象(Sitophilus zeamais)和谷象(Sitophilus granarius)等儲(chǔ)糧害蟲(chóng)存活與繁殖現(xiàn)象明顯減少，其中，起關(guān)鍵作用的主要成分是豌豆白蛋白家族成分的亞組分1b(Pea Albumin 1b，PA1b)。這種組分的氨基酸序列與豆種子蛋白的超家族成員如凝集素、蛋白酶抑制劑、淀粉酶抑制劑和其它的一些低分子量白蛋白序列表現(xiàn)出一定的同源性。該組分由37個(gè)氨基酸構(gòu)成，其中富含6個(gè)半胱氨酸，構(gòu)成3個(gè)分子內(nèi)二硫鍵，空間結(jié)構(gòu)高度緊密、異常穩(wěn)定。與一般的蛋白相比，其生化性質(zhì)及其抗蟲(chóng)作用機(jī)理有著很大的不同。但在對(duì)米象、玉米象、谷象和蚜蟲(chóng)等多種昆蟲(chóng)的喂食實(shí)驗(yàn)中，都表現(xiàn)出具有顯著的毒性作用，是自然界中高效的生物殺蟲(chóng)劑，是未來(lái)安全性為首要特征的生物農(nóng)藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用的又一重要資源。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白。本發(fā)明采用DNA體外重組的方法，構(gòu)建出表達(dá)豌豆白蛋白亞組分PA1b的基因工程菌，通過(guò)液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的方式規(guī)?；@得重組蛋白，并以此為基料，配制針對(duì)儲(chǔ)糧害蟲(chóng)防治的生物殺蟲(chóng)劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白的制備方法。
本發(fā)明的再一目的在于提供上述豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白在防治儲(chǔ)糧害蟲(chóng)的生物殺蟲(chóng)劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白的制備方法，包括如下步驟(1)重組蛋白生產(chǎn)的基因工程菌構(gòu)建選擇分泌型的畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA/B/C(Invitrogen Co.)作為目的基因的表達(dá)載體，使目的蛋白上游與α因子分泌信號(hào)肽和Glu-Lys-Arg識(shí)別序列(該序列能被氨基肽酶Kex2識(shí)別)直接融合，從而使表達(dá)蛋白直接分泌在發(fā)酵培養(yǎng)基中，利于后面的分離、純化過(guò)程。
設(shè)計(jì)上游引物Xho I-PA-F5′-CTC TCG AGA AAA GAG AGG CTG CTTCTT GCA ACG GTG TTT G-3′，下游引物Not I-PA-R5′-GAT CTC AGT GGTGGT GGT GG-3′；以豌豆cDNA文庫(kù)為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段，目的基因片段與表達(dá)載體pPICZαA/B/C經(jīng)內(nèi)切酶Xho I和Not I雙酶切后連接，構(gòu)建表達(dá)產(chǎn)物的重組質(zhì)粒pPICZαA/B/C-1b；重組質(zhì)粒pPICZαA/B/C-1b經(jīng)Sal I處理成線狀后，采用電轉(zhuǎn)化的方法將其導(dǎo)入畢赤酵母細(xì)胞(Pichia pastoris strain GS115，his4)，在含Zeocin選擇壓力的YPD培養(yǎng)基中，篩選具有目的蛋白表達(dá)能力的基因工程轉(zhuǎn)化菌。
(2)重組蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)第一步，富集菌體基因工程轉(zhuǎn)化菌接種到MGYH液體培養(yǎng)基中，在25～30℃下培養(yǎng)至A600約為2.6。在室溫下，將發(fā)酵液進(jìn)行低速離心，收集細(xì)胞。
第二步，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)將上一步收集的細(xì)胞用BMMH液體培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞至A600為0.1，然后培養(yǎng)，誘導(dǎo)抗蟲(chóng)蛋白表達(dá)，每24h添加100％甲醇至甲醇濃度為0.5％，維持誘導(dǎo)壓力，促使重組蛋白表達(dá)。
(3)重組蛋白的分離純化經(jīng)甲醇誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)的發(fā)酵液離心除去細(xì)胞后，上清液采用Ultrafree-15超濾膜(10K，Millipore Co.)分離，濾液采用HPLC(高效液相色譜法)分離，收集滯留時(shí)間為28～30min的分部組分真空干燥，經(jīng)冷凍干燥獲得到由37個(gè)氨基酸殘基組成的豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白。
所述豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白的氨基酸殘基序列為Ala Ser CysAsn Gly Val Cys Ser Pro Phe Glu Met Pro Pro Cys Gly Thr Ser Ala Cys Arg CysIle Pro Val Gly Leu Val Ile Gly Tyr Cys Arg Asn Pro Ser Gly。
所述步驟(1)中RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)94℃5min，94℃60s，55℃50s，72℃50s，35個(gè)循環(huán)，72℃10min。
所述步驟(2)中MGYH培養(yǎng)基組成為1.34％YNB(Yeast Nitrogen Base，酵母氮源基料，Invitrogen公司的酵母培養(yǎng)基產(chǎn)品)，1％甘油，450μg/L生物素，0.004％組氨酸。
所述步驟(2)中BMMH培養(yǎng)基組成為100mmol/L磷酸鈉，pH6.0，1.34％YNB，450μg/L抗生素Zeocin，0.5％甲醇和0.004％組氨酸。
所述步驟(3)中HPLC分離條件分離柱為5μN(yùn)ucleosil-300C18(Hypersil)，洗脫液采用線性梯度乙腈(20～100％，v/v，內(nèi)含0.1％三氟乙酸)，流速1ml/min。
本發(fā)明的豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白就是通過(guò)上述方法制備而成。所述豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白的氨基酸殘基序列為Ala Ser Cys AsnGly Val Cys Ser Pro Phe Glu Met Pro Pro Cys Gly Thr Ser Ala Cys Arg Cys Ile ProVal Gly Leu Val Ile Gly Tyr Cys Arg Asn Pro Ser Gly。
上述豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白在制備防治儲(chǔ)糧害蟲(chóng)的生物殺蟲(chóng)劑中的應(yīng)用，將豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白100μg溶于167μl水中，然后將其與250mg小麥粉混合，制成小團(tuán)，干燥，即制得防治儲(chǔ)糧害蟲(chóng)的生物殺蟲(chóng)劑。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果本發(fā)明通過(guò)獨(dú)特的工藝，簡(jiǎn)便的方法，使豌豆白蛋白亞組分PA1b基因的規(guī)?；a(chǎn)成為現(xiàn)實(shí)。畢赤酵母表達(dá)PA1b的成本低，產(chǎn)量高，分離純化工藝簡(jiǎn)便，在資源的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。


圖1為構(gòu)建畢赤酵母基因工程菌的Northern blot分析圖。
圖2為0.5％甲醇誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析圖。
圖3為HPLC分離重組蛋白的分部收集示意圖。
圖4為重組蛋白分離純化SDS-PAGE分析圖。
圖5為表達(dá)蛋白對(duì)糧儲(chǔ)象蟲(chóng)的毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)比圖。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
實(shí)施例1(1)重組蛋白生產(chǎn)的基因工程菌構(gòu)建；選擇分泌型的畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA/B/C作為目的基因的表達(dá)載體，使目的蛋白上游與α因子分泌信號(hào)肽和Glu-Lys-Arg識(shí)別序列(該序列能被氨基肽酶Kex2識(shí)別)直接融合，從而使表達(dá)蛋白直接分泌在發(fā)酵培養(yǎng)基中，利于后面的分離、純化過(guò)程。
設(shè)計(jì)上游引物Xho I-PA-F5′-CTC TCG AGA AAA GAG AGG CTG CTTCTT GCA ACG GTG TTT G-3′，下游引物Not I-PA-R5′-GAT CTC AGT GGTGGT GGT GG-3′；以豌豆cDNA文庫(kù)為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段(94℃5min，94℃60s，55℃50s，72℃50s，35個(gè)循環(huán)，72℃10min)。目的基因片段與表達(dá)載體pPICZαA/B/C經(jīng)內(nèi)切酶Xho I和Not I雙酶切后連接，構(gòu)建表達(dá)產(chǎn)物的重組質(zhì)粒pPICZαA/B/C-1b。約10μg重組質(zhì)粒pPICZαA/B/C-1b經(jīng)Sal I處理成線狀后，采用電轉(zhuǎn)化的方法(電壓1.5kv，電容25μF，電阻200Ω，電擊時(shí)間4～10msec)將其導(dǎo)入畢赤酵母細(xì)胞(Pichiapastoris strain GS115，his4)。在含100μg/ml Zeocin選擇壓力的YPD培養(yǎng)基中，篩選具有目的蛋白表達(dá)能力的基因工程轉(zhuǎn)化菌。采用Northern blot雜交技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示部分轉(zhuǎn)化菌株中(如G9和G22)目的蛋白mRNA存在轉(zhuǎn)錄的情況，表明目的蛋白表達(dá)的基因工程轉(zhuǎn)化菌已成功構(gòu)建，如圖1所示，MRNA分子量標(biāo)記(0.24-9.5kb)；C對(duì)照(GS115)；2、5、8、9、22轉(zhuǎn)化子不同菌株。
(2)對(duì)菌體采用兩步培養(yǎng)法第一步，菌體在含有酵母膏和蛋白胨等豐富營(yíng)養(yǎng)成分的MGYH培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)后，離心收集細(xì)胞。第二步，細(xì)胞在含最低營(yíng)養(yǎng)成分的BMMH培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并添加甲醇，使0.5％甲醇誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，確定誘導(dǎo)時(shí)間。
第一步，富集菌體基因工程轉(zhuǎn)化菌接種到含50ml MGYH培養(yǎng)基(1.34％YNB，Yeast Nitrogen Base，Invitrogen公司的酵母培養(yǎng)基產(chǎn)品)，1％甘油，450μg/L生物素，0.004％組氨酸)的250ml三角瓶中，在30℃下培養(yǎng)24h(A600約2.6)，搖床轉(zhuǎn)速約300r/min。室溫(30℃)下，發(fā)酵液在離心力3000×g下離心10min，移去上清液，收集細(xì)胞。
第二步，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)將上一步收集的細(xì)胞用約200ml BMMH培養(yǎng)基(100mmol/L磷酸鈉，pH6.0，1.34％YNB，450μg/L抗生素Zeocin，0.5％甲醇(v/v)和0.004％組氨酸(w/v))，重新懸浮細(xì)胞至A600為0.1，放入1L燒瓶中培養(yǎng)，誘導(dǎo)抗蟲(chóng)蛋白表達(dá)。每24h添加100％甲醇至甲醇濃度為0.5％，維持誘導(dǎo)壓力，促使重組蛋白表達(dá)。表達(dá)的抗蟲(chóng)融合蛋白分子量約為4.5Kb。圖2表明不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白合成的影響，M蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；24、48、72、96、1200.5％甲醇的誘導(dǎo)時(shí)間。由圖2可知，0.5％的甲醇誘導(dǎo)72小時(shí)，融合蛋白開(kāi)始表達(dá)，到96小時(shí)開(kāi)始維持較高的表達(dá)量，120小時(shí)后開(kāi)始出現(xiàn)溶菌現(xiàn)象。
(3)重組蛋白的分離純化取200ml經(jīng)96小時(shí)誘導(dǎo)的發(fā)酵液，3000×g離心除菌后，上清液采用Ultrafree-15超濾膜(10K)分離。濾液進(jìn)一步用HPLC分離，分離柱為5μN(yùn)ucleosil-300 C18(Hypersil)，洗脫液采用線性梯度acetonitrile(20～100％，v/v，內(nèi)含0.1％trifluoroacetic acid)，流速1ml/min。收集滯留時(shí)間為28～30min的分部組分進(jìn)行真空干燥。由于重組蛋白分子量較小，通過(guò)超濾，已除去了大部分雜蛋白，再經(jīng)HPLC分離，蛋白得到了進(jìn)一步純化。經(jīng)冷凍干燥獲得由37個(gè)氨基酸殘基組成的豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白。重組蛋白的產(chǎn)量約為20mg/L，如圖3、圖4所示。圖3中，1原始菌株對(duì)照；2重組菌株分離蛋白。圖4中，M蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；1對(duì)照；2HPLC分離組分；3超濾分離組分。
(4)用重組蛋白喂食象鼻蟲(chóng)(Sitophilus oryzae)進(jìn)行毒性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室中，象鼻蟲(chóng)(Sitophilus oryzae)在27.5℃和70％的相對(duì)濕度下生長(zhǎng)，喂食小麥或豌豆。實(shí)驗(yàn)用象鼻蟲(chóng)約培養(yǎng)近30代。
將從發(fā)酵液中提取的重組蛋白100μg溶于167μl水中，然后將其與250mg小麥粉混合，制成小團(tuán)干燥后，分別給30個(gè)抗性和敏感性成蟲(chóng)喂食，每天觀察象鼻蟲(chóng)死亡個(gè)數(shù)，直到敏感性蟲(chóng)死亡率達(dá)到95％，利用軟件(StatViewprogram of SAS Institute Inc.)分析半致死劑量LC50。結(jié)果表明，重組蛋白對(duì)敏感型蟲(chóng)表現(xiàn)出很高的毒性，半致死劑量達(dá)到4.7，與來(lái)源于天然植物豌豆活性蛋白的毒性一致；而對(duì)抗性蟲(chóng)的毒性效果不明顯，如圖5所示，米象(Sitophilusoryzae)累積存活比例示意圖，實(shí)驗(yàn)樣品轉(zhuǎn)化菌株GS22表達(dá)的PA1b重組蛋白；實(shí)驗(yàn)材料敏感/抗性株系。
綜上所述，本發(fā)明通過(guò)獨(dú)特的工藝，簡(jiǎn)便的方法，是豌豆白蛋白亞組分PA1b基因的規(guī)?；a(chǎn)成為現(xiàn)實(shí)。畢赤酵母表達(dá)PA1b的成本低，產(chǎn)量高，分離純化工藝簡(jiǎn)便，在資源的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。
SEQUENCE LISTING<110>華南理工大學(xué)<120>豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用<130>30<160>3<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>40<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>上游引物Xho I-PA-F<400>1ctctcgagaa aagagaggct gcttcttgca acggtgtttg 40<210>2<211>20<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
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<223>豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白的氨基酸殘基序列
<400>3Ala Ser Cys Asn Gly Val Cys Ser Pro Phe Glu Met Pro Pro Cys Gly1 5 10 15Thr Ser Ala Cys Arg Cys Ile Pro Val Gly Leu Val Ile Gly Tyr Cys20 25 30Arg Asn Pro Ser Gly3權(quán)利要求
1.一種豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)重組蛋白生產(chǎn)的基因工程菌構(gòu)建設(shè)計(jì)上游引物Xho I-PA-F5′-CTC TCG AGA AAA GAG AGG CTG CTTCTT GCA ACG GTG TTT G-3′，下游引物Not I-PA-R5′-GAT CTC AGT GGTGGT GGT GG-3′；以豌豆cDNA文庫(kù)為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段，目的基因片段與表達(dá)載體pPICZαA/B/C經(jīng)內(nèi)切酶Xho I和Not I雙酶切后連接，構(gòu)建表達(dá)產(chǎn)物的重組質(zhì)粒pPICZαA/B/C-1b；重組質(zhì)粒pPICZαA/B/C-1b經(jīng)Sal I處理成線狀后，采用電轉(zhuǎn)化的方法將其導(dǎo)入畢赤酵母細(xì)胞，在含Zeocin選擇壓力的YPD培養(yǎng)基中，篩選具有目的蛋白表達(dá)能力的基因工程轉(zhuǎn)化菌；(2)重組蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)第一步，富集菌體基因工程轉(zhuǎn)化菌接種到MGYH液體培養(yǎng)基中，在25～30℃下培養(yǎng)至A600為2.6；在室溫下，將發(fā)酵液進(jìn)行低速離心，收集細(xì)胞；第二步，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)將上一步收集的細(xì)胞用BMMH液體培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞至A600為0.1，然后培養(yǎng)，誘導(dǎo)抗蟲(chóng)蛋白表達(dá)，每24h添加100％甲醇至甲醇濃度為0.5％，維持誘導(dǎo)壓力，促使重組蛋白表達(dá)；(3)重組蛋白的分離純化經(jīng)甲醇誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)的發(fā)酵液離心除去細(xì)胞后，上清液采用Ultrafree-15超濾膜分離，濾液采用HPLC分離，收集滯留時(shí)間為28～30min的分部組分真空干燥，經(jīng)冷凍干燥獲得豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)94℃ 5min，94℃ 60s，55℃ 50s，72℃ 50s，35個(gè)循環(huán)，72℃ 10min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中MGYH培養(yǎng)基組成為1.34％YNB，1％甘油，450μg/L生物素，0.004％組氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中BMMH培養(yǎng)基組成為100mmol/L磷酸鈉，pH6.0，1.34％YNB，450μg/L抗生素Zeocin，0.5％甲醇和0.004％組氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中HPLC分離條件分離柱為5μ Nucleosil-300 C18，洗脫液采用線性梯度乙腈，流速1ml/min。
6.一種豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白，其特征在于所述豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白的氨基酸殘基序列為Ala Ser Cys Asn Gly Val Cys Ser Pro PheGlu Met Pro Pro Cys Gly Thr Ser Ala Cys Arg Cys Ile Pro Val Gly Leu Val Ile GlyTyr Cys Arg Asn Pro Ser Gly。
7.權(quán)利要求6所述的豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白在制備防治儲(chǔ)糧害蟲(chóng)的生物殺蟲(chóng)劑中的應(yīng)用，其特征在于將豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白100μg溶于167μl水中，然后將其與250mg小麥粉混合，制成小團(tuán)，干燥，即制得防治儲(chǔ)糧害蟲(chóng)的生物殺蟲(chóng)劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程和生物殺蟲(chóng)劑的技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白及其制備方法，該方法包括重組蛋白生產(chǎn)的基因工程菌構(gòu)建；重組蛋白的發(fā)酵生產(chǎn)；重組蛋白的分離純化。本發(fā)明還提供了上述豌豆白蛋白亞組分PA1b重組蛋白在制備防治儲(chǔ)糧害蟲(chóng)的生物殺蟲(chóng)劑中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)獨(dú)特的工藝，簡(jiǎn)便的方法，使豌豆白蛋白亞組分PA1b基因的規(guī)模化生產(chǎn)成為現(xiàn)實(shí)。畢赤酵母表達(dá)PA1b的成本低，產(chǎn)量高，分離純化工藝簡(jiǎn)便。
文檔編號(hào)C12N1/19GK101033465SQ20071002655
公開(kāi)日2007年9月12日 申請(qǐng)日期2007年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月26日
發(fā)明者張毅, 許喜林 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)