專利名稱：應(yīng)用高倍率顯微儀檢查泌尿生殖道微生物感染的方法
所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及醫(yī)療診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種應(yīng)用高倍率顯微儀檢查泌尿生殖道微生物感染的方法。
背景技術(shù)：
眾所周知，怎樣確定感染人體的病原微生物，屬于醫(yī)學(xué)檢驗范疇。泌尿生殖道炎癥是臨床最為常見的病變，醫(yī)生們通常要采集被感染部位的標本，送交檢驗科進行鏡檢、培養(yǎng)、單克隆、DNA、核酸等檢查，為臨床診斷尋求實驗室佐證。但是，這樣便會帶來二個問題第一、醫(yī)生必須首先提出你所懷疑的病原微生物是哪一種或哪幾種？否則實驗室將要對泌尿生殖道常見的10多種微生物全部進行檢查，不但費時、費事，還給病人增加了不必要的高昂費用。同時這種“選擇”與醫(yī)生的經(jīng)驗、水平密切相關(guān)，隨機性很大，容易出現(xiàn)漏檢、錯檢和誤診。
第二、當化驗結(jié)果為陽性時，它只是表明送檢標本中含有這種或這些微生物，但并不確定這就是引起病變的病原微生物。也就是說，無論培養(yǎng)、單克隆、DNA、還是核酸技術(shù)都不能證明所提示的病原微生物是存在于細胞內(nèi)還是細胞外。因為，在多數(shù)情況下，臨床對泌尿生殖道感染的診斷依據(jù)是只有存在于細胞內(nèi)的微生物才能確定為病原微生物，才需要給予治療，不進入細胞內(nèi)的微生物通常不會產(chǎn)生病變，這正是診斷泌尿生殖道炎癥與診斷人體其它部位炎癥不同之處。
這所以不同，是緣于泌尿生殖道常見的病原微生物廣泛存在于自然界和人體體表，如支原體、衣原體、加德納桿菌、單純皰疹病毒、HPV等。不良衛(wèi)生習(xí)慣，不清潔用水，共用衛(wèi)生潔具等，有可能使少量的這些微生物進入泌尿生殖道，它們通?！凹木印痹谳^淺表部位，不一定會侵犯細胞造成病變。因此，送檢的標本中這些微生物都能使培養(yǎng)、DNA、單克隆、核酸反應(yīng)等呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。所以，上述檢查某一項或幾項呈獻陽性，并不表明所表示的微生物就是真正引起病變的病原微生物！診斷的標準是誰進入了細胞內(nèi)并導(dǎo)致了細胞的形態(tài)學(xué)改變，誰就是真正的病原微生物！這恰恰是培養(yǎng)和分子生物學(xué)技術(shù)不能回答的問題，一項或多項檢查出現(xiàn)陽性反應(yīng)，只表明標本中有這種或這幾種微生物存在，僅此而已。是否進入了細胞？則不得而知。
然而，臨床醫(yī)師希望實驗室提供確切的信息是哪種(或哪幾種)微生物侵入了泌尿生殖道細胞并引起了細胞的病理改變，從而導(dǎo)致臨床病征的產(chǎn)生。可是，這就超出了培養(yǎng)和分子生物學(xué)的技術(shù)范圍。
細胞病理學(xué)工作者通過回顧性研究與前瞻性研究，已經(jīng)能夠從細胞核和細胞漿的形態(tài)變化，準確地識別和鑒別眾多微生物對細胞的侵犯。特別是宮頸細胞微生物感染的觀察研究，進展尤為顯著，幾種常見的、危害嚴重的泌尿生殖道病原微生物，只要侵入細胞，造成了細胞損害，都能從細胞形態(tài)學(xué)上加以辨認和識別，為臨床醫(yī)師提供確切的病原微生物診斷依據(jù)。這些成就，被寫入全球百余名病理學(xué)專家、知名學(xué)者共同制定的“TBS診斷系統(tǒng)”(標準)中，在世界各國推廣應(yīng)用。
用觀察細胞形態(tài)學(xué)的方法來診斷宮頸與泌尿生殖道微生物感染，是20世紀細胞病理學(xué)的重大進展，它是近代培養(yǎng)技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)的補充與完善，其臨床意義非同一般，從此當病人出現(xiàn)宮頸或泌尿生殖道炎癥時，醫(yī)生們無須再去考慮是何種病原微生物引起？選擇哪種技術(shù)來尋找病原微生物？只需要將獲取的標本送交細胞病理室，病理醫(yī)師會逐一地進行細胞觀察分析，為臨床提供全面、準確的診斷信息。按照TBS系統(tǒng)要求，女性宮頸標本可能還將同時進行宮頸癌和癌前病變的篩查，給出規(guī)范的診斷報告。
在人們的傳統(tǒng)觀念中，細胞病理形態(tài)學(xué)用于查找癌細胞是無可置疑的，而作為細胞感染的微生物診斷方法，還是逐漸被接受和認可的。其實，細胞病理學(xué)者經(jīng)過長期觀察研究，早就發(fā)現(xiàn)泌尿生殖道病原微生物在侵入粘膜細胞之后，造成細胞的損害，往往使細胞核或細胞漿發(fā)生形態(tài)變異。不同的病原微生物只侵犯特定的細胞，所引起的細胞形變又各不相同且都有各自的形態(tài)特征。病理醫(yī)師就可以根據(jù)這些獨特的形態(tài)特征來發(fā)現(xiàn)和診斷造成感染的病原微生物。早些年，這種方法應(yīng)用還不夠普遍，逐步形成系統(tǒng)和規(guī)范則是近10年左右的事情。實踐證明其敏感性和特異性極高，得到了電鏡、分子生物學(xué)技術(shù)等證實，深受臨床的好評與歡迎。
例如衣原體感染，它侵犯的是柱狀上皮細胞，在細胞漿內(nèi)形成包涵體，形態(tài)特異、典型；支原體也感染柱狀上皮細胞，它是在細胞漿內(nèi)生長、繁殖，但絕不形成包涵體；又如，加德納桿菌，它只侵犯表層鱗狀上皮細胞，在其中大量密布，形如線索狀，通稱線索細胞；再如，單純皰疹病毒感染細胞后，它促使細胞融合，造成細胞核相互堆集在一起，形成多核細胞；還有，乳突瘤狀病毒感染，侵入鱗狀上皮細胞核，除核發(fā)生形變外，核周胞漿空化，這就是頗具特色的、提示乳突瘤狀病毒感染的挖空細胞；還有，巨細胞病毒感染出現(xiàn)的核周包涵體，稱之為“貓頭鷹眼”征；再有，臨床常見的淋病雙球菌，它只侵犯柱狀上皮細胞和白細胞，在其中成堆出現(xiàn)，等等。這些形態(tài)特征與所感染的病原微生物一一對應(yīng)，當發(fā)生多重感染時，各自的形態(tài)特征仍然保持不變。在感染得到控制后，細胞的形態(tài)改變便會漸行消失。這是繼宮頸癌之后，細胞病理學(xué)取得的又一重大進展。
目前臨床上普遍應(yīng)用的方法，仍然是首先在泌尿生殖道涂片，獲取表層鱗狀上皮細胞和柱狀上皮細胞，直接涂抹在玻片上(近年來薄層細胞制片機問世后，則采用自動化制片效果更好)。隨后即行固定、染色、干燥等步驟，最終由醫(yī)師在光學(xué)顯微鏡下進行觀察、查找。由于標本經(jīng)過染色處理，細胞及微生物都死的。加之普通光學(xué)顯微鏡放大倍率有限，有些細胞形態(tài)改變觀察不清，某些微生物發(fā)現(xiàn)不了。這就使得已經(jīng)成熟的采用細胞形態(tài)學(xué)來查找和診斷病原微生物的方法，在臨床受到了很大限制，未能普遍開展應(yīng)用。如何將光學(xué)顯微鏡的放大倍率進一步提高？如何保持標本中細胞及微生物的活性？成為用泌尿生殖道病原微生物形態(tài)學(xué)診斷中必須解決的兩項關(guān)鍵技術(shù)！對標本進行染色，至今仍然是顯微觀察中不可缺少的重要環(huán)節(jié)，泌尿生殖道細胞檢查也不例外，巴氏染色被推崇為最經(jīng)典的染色方法。其實，很早以前，人們就感到染色法也并非不無缺點，比如說它使生物的活動形態(tài)消失，有的染色步驟十分繁瑣(如巴氏染色)等。因此，在上世紀三十年代，國外科學(xué)家發(fā)明了相差技術(shù)，可以在無須染色的情況下，看到活動的細胞與微生物，因而獲得1953年度諾貝爾物理獎。接著，又有人在相差的基礎(chǔ)上，發(fā)明了微分干涉相差，使之物像反襯更強，呈現(xiàn)“逼真”的立體感，還可出現(xiàn)色彩。微分干涉既保持了細胞活性，又有三維效果與顏色，但它并沒有使用化學(xué)的或生物的染劑，而是利用了物理光學(xué)原理，被稱之為“光染色”。
相差和微分干涉發(fā)明數(shù)十年，并未在臨床廣泛推廣應(yīng)用，大多僅限于實驗研究，其原因有兩條1、價格昂貴，相當于一臺高擋顯微鏡，甚至超出一臺高擋顯微鏡的價格，尤其是微分干涉。2、操作繁瑣，費時、費事。
進入20世紀80年代，工業(yè)技術(shù)有了飛速進步，特別是數(shù)控機床加工和高品質(zhì)合金材料的采用，生產(chǎn)出了轉(zhuǎn)盤式顯微相差組件，原本復(fù)雜、繁瑣的調(diào)試頓時變得簡單、便捷。隨之而來的是視頻解碼技術(shù)、圖像采集技術(shù)和光學(xué)放大技術(shù)等相繼獲得進展，使拓寬顯微相差的應(yīng)用成為可能。九十年代初，美國斯坦福大學(xué)M.R Bradford教授推出了他潛心研制的一種高放大倍率、高清晰度顯微鏡(人稱布氏顯微鏡)，放大倍率可達15000倍。主要用來觀察新鮮血滴中的細胞形態(tài)和有形成份，從而對受檢者進行健康評估，即所謂的“亞健康檢查”。
這種顯微鏡的一個特點是標本無須染色，便能看清細胞內(nèi)的大體結(jié)構(gòu)和被感染細胞內(nèi)的微生物、寄生蟲等。由于沒有染色，所以看到的細胞和微生物都是活的，在鏡下或熒屏上呈現(xiàn)活動物像。布氏顯微鏡正是在相差技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合近代高新技術(shù)研制而成的，它是相差的一大進步。但它只應(yīng)用于血液的觀察，未能開展對泌尿生殖道病原微生物的研究。
96年，我國自行開發(fā)出布氏顯微鏡的同類產(chǎn)品一高倍率顯微鏡。我們便將泌尿生殖道微生物檢查移植到高倍率顯微鏡下進行，在全國數(shù)十家醫(yī)療單位的推廣應(yīng)用中，受得充分肯定和普遍歡迎。近年，我們又根據(jù)宮頸細胞病理學(xué)的進展與要求，研制出活細胞制片機，與高倍率顯微鏡組合，成為一種有別于傳統(tǒng)方法的全新細胞病理學(xué)儀器—宮頸活細胞檢查儀。該儀器在廣東省婦幼保健院與美國新柏氏TCT制片，巴氏染色進行臨床對照100多例，得到細胞病理專家們認可，經(jīng)廣東省食品藥品監(jiān)督管理局批準注冊生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明系采用高倍率顯微儀對泌尿生殖道病原微生物感染進行檢查的一種新方法。它與以往醫(yī)學(xué)上其它任何檢查方法不同，其特點是1、用棉拭子或?qū)m頸惻從尿道、陰道或?qū)m頸獲取含有粘膜表層細胞的標本，涮洗于標本瓶內(nèi)的細胞保存液中。經(jīng)活細胞制片機制成濕片，無須固定、染色等步驟，以蓋玻片復(fù)蓋，即可直接在高倍率顯微儀下觀察。高倍率顯微儀在10倍物鏡觀察時，放大倍率調(diào)節(jié)至1000-2000倍。40倍與100倍物鏡觀察時，放大倍率調(diào)節(jié)至4000-8000倍，必要時，也可調(diào)節(jié)至10000-12000倍。一般采用相差視場，當觀察細胞漿內(nèi)或細胞核內(nèi)微小質(zhì)粒運動時，也可采用暗視場。
2、高清晰放大物像顯示在17時計算機屏幕上，根據(jù)活細胞和微生物的形態(tài)特征與活動狀態(tài)，以及受感染細胞的類型，識別和判斷細胞感染的病原微生物。通過計算機設(shè)定的程序，存貯JPG或AVI圖像，并打印彩色圖文檢查報告。
本發(fā)明是一種活細胞檢查技術(shù)，細胞和微生物在高倍率顯微儀下呈現(xiàn)活動物像，因而保持了它們的形態(tài)特征，有利于細胞、病原微生物的識別、鑒別與診斷。在一份標本中，能同時檢查泌尿生殖道常見的各種病原微生物，為患者節(jié)省了檢查費用。且方法簡便、快速，減少了病員的等待時間。與傳統(tǒng)檢查方法比較，其優(yōu)越性是顯而易見的。
本發(fā)技術(shù)特征概述為從尿道、陰道或?qū)m頸獲取含有粘膜表層細胞的標本，放置細胞保存液中，經(jīng)活細胞制片技術(shù)制成活細胞濕片，直接在高倍率顯微儀下，采用不同放大倍率的相差觀察及暗視場觀察；高清晰放大物像顯示在計算機大屏幕上，根據(jù)活細胞和微生物的形態(tài)特征與活動狀態(tài)，以及受感染細胞的類型，識別和判斷細胞感染的病原微生物。通過計算機設(shè)定的程序，存貯JPG或AVI圖像，并打印彩色圖文檢查報告；所述的標本為泌尿生殖道粘膜表層細胞的標本；所述的細胞為鱗狀上皮細胞和柱狀上皮細胞；所述的放大倍率為1000倍-12000倍；所述的細胞保存液為市售的白細胞自動計數(shù)儀用細胞稀釋液或外科器官移植用器官保存液；所述的活細胞濕片為沒有固定、染色的濕片；所述的觀察設(shè)備為高倍率顯微儀，以相差(或暗視場)觀察；所述的識別和判斷細胞所感染的病原微生物為衣原體包涵體、支原體、淋病雙球菌、加德納桿菌(線索細胞)、白色念珠菌、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、梅毒螺旋體、乳突瘤狀病毒(HPV)等。


圖1為本發(fā)明流程框圖。
具體實施列本發(fā)明系采用高倍率顯微儀對泌尿生殖道病原微生物感染進行檢查的一種新方法。它與以往醫(yī)學(xué)上其它任何檢查方法不同，其特點是1、用棉拭子或?qū)m頸惻從尿道、陰道或?qū)m頸獲取含有粘膜表層細胞的標本，涮洗于標本瓶內(nèi)的細胞保存液中。經(jīng)活細胞制片機制成濕片，無須固定、染色等步驟，以蓋玻片復(fù)蓋，即可直接在高倍率顯微儀下觀察。高倍率顯微儀在10倍物鏡觀察時，放大倍率調(diào)節(jié)至1000-2000倍。40倍與100倍物鏡觀察時，放大倍率調(diào)節(jié)至4000-8000倍，必要時，也可調(diào)節(jié)至10000-12000倍。一般采用相差視場，當觀察細胞漿內(nèi)或細胞核內(nèi)微小質(zhì)粒運動時，也可采用暗視場。2、高清晰放大物像顯示在17時計算機屏幕上，根據(jù)活細胞和微生物的形態(tài)特征與活動狀態(tài)，以及受感染細胞的類型，識別和判斷細胞感染的病原微生物。通過計算機設(shè)定的程序，存貯JPG或AVI圖像，并打印彩色圖文檢查報告。
本發(fā)明是一種活細胞檢查技術(shù)，細胞和微生物在高倍率顯微儀下呈現(xiàn)活動物像，因而保持了它們的形態(tài)特征，有利于細胞、病原微生物的識別、鑒別與診斷。在一份標本中，能同時檢查泌尿生殖道常見的各種病原微生物，為患者節(jié)省了檢查費用。且方法簡便、快速，減少了病員的等待時間。與傳統(tǒng)檢查方法比較，其優(yōu)越性是顯而易見的。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用高倍率顯微儀檢查泌尿生殖道微生物感染的方法，其特征在于從尿道、陰道或?qū)m頸獲取含有粘膜表層細胞的標本，放置細胞保存液中，經(jīng)活細胞制片技術(shù)制成活細胞濕片，直接在高倍率顯微儀下，采用不同放大倍率的相差觀察及暗視場觀察。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用高倍率顯微儀檢查泌尿生殖道微生物感染的方法，其特征在于高清晰放大物像顯示在計算機大屏幕上，根據(jù)活細胞和微生物的形態(tài)特征與活動狀態(tài)，以及受感染細胞的類型，識別和判斷細胞感染的病原微生物，通過計算機設(shè)定的程序，存貯JPG或AVI圖像，并打印彩色圖文檢查報告。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用高倍率顯微儀檢查泌尿生殖道微生物感染的方法，其特征在于所述的標本為泌尿生殖道粘膜表層細胞的標本。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用高倍率顯微儀檢查泌尿生殖道微生物感染的方法，其特征在于所述的細胞為鱗狀上皮細胞和柱狀上皮細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用高倍率顯微儀檢查泌尿生殖道微生物感染的方法，其特征在于所述的放大倍率為1000倍-12000倍。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用高倍率顯微儀檢查泌尿生殖道微生物感染的方法，其特征在于所述的細胞保存液為市售的白細胞自動計數(shù)儀用細胞稀釋液或外科器官移植用器官保存液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用高倍率顯微儀檢查泌尿生殖道微生物感染的方法，其特征在于所述的活細胞濕片為沒有固定、染色的濕片。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用高倍率顯微儀檢查泌尿生殖道微生物感染的方法，其特征在于所述的觀察設(shè)備為高倍率顯微儀，以相差(或暗視場)觀察。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用高倍率顯微儀檢查泌尿生殖道微生物感染的方法，其特征在于所述的識別和判斷細胞所感染的病原微生物為衣原體包涵體、支原體、淋病雙球菌、加德納桿菌、白色念珠菌、單純皰疹病毒、巨細胞病毒、梅毒螺旋體、乳突瘤狀病毒等。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)療診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種應(yīng)用高倍率顯微儀檢查泌尿生殖道微生物感染的方法。本發(fā)明是一種活細胞檢查技術(shù)，細胞和微生物在高倍率顯微儀下呈現(xiàn)活動物像，因而保持了它們的形態(tài)特征，有利于細胞、病原微生物的識別、鑒別與診斷。在一份標本中，能同時檢查泌尿生殖道常見的各種病原微生物，為患者節(jié)省了檢查費用。且方法簡便、快速，減少了病員的等待時間。與傳統(tǒng)檢查方法比較，其優(yōu)越性是顯而易見的。
文檔編號C12Q1/04GK101067625SQ20071002823
公開日2007年11月7日 申請日期2007年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月28日
發(fā)明者宋士明, 宋若渠 申請人:宋士明