專利名稱：超螺旋質(zhì)粒分離純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及高純度超螺旋質(zhì)粒的提取和純化工藝。
背景技術(shù)：
基因治療和基因疫苗作為新興的分別用來治療重大疾病和預(yù)防疾病的手段，越來越受到研究者的重視。而基因治療和基因疫苗的關(guān)鍵是將目的基因?qū)氚屑毎?，這就需要合適的載體來把目的基因?qū)氚屑毎Ｗ畛Ｓ玫妮d體主要有病毒載體和非病毒載體兩類。病毒載體如反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒及其其他病毒體轉(zhuǎn)染率一般較高，但存在一些安全憂慮。而非病毒載體方法例如將基因插入質(zhì)粒導(dǎo)入靶細胞被認為是比較安全和方便的一種方法。但質(zhì)粒DNA在靶細胞中的基因表達效率低、持續(xù)時間短，因此需要大量的符合藥學(xué)規(guī)格的質(zhì)粒DNA。一般一個療程需要毫克數(shù)量級的質(zhì)粒DNA。這使質(zhì)粒DNA作為生物制劑產(chǎn)品的生產(chǎn)面臨著新的嚴峻的挑戰(zhàn)。
質(zhì)粒DNA一般是細胞質(zhì)中獨立于染色體以外的共價閉環(huán)的小分子雙鏈DNA，它具有獨立復(fù)制的能力。在質(zhì)粒DNA提取過程中，由于剪切力，質(zhì)粒DNA主要以超螺旋形、開環(huán)形、線形三種構(gòu)象存在。而超螺旋形于其他兩種構(gòu)象相比，進入靶細胞以后的穩(wěn)定性和表達能力較強。因此，用在基因治療和基因疫苗中的質(zhì)粒DNA超螺旋形的比例越高，起到的效果越明顯。因此，在生產(chǎn)質(zhì)粒DNA制品時，產(chǎn)品中超螺旋質(zhì)粒DNA的比例越高越好，超螺旋質(zhì)粒DNA的分離純化成為一個重要的迫待解決研究課題。
用于人體的質(zhì)粒DNA有很嚴格的要求，質(zhì)粒DNA的純化過程中不能使用動物源性的酶，例如RNase A和蛋白酶K；不能使用對人畜有毒的苯酚、氯仿等有機溶劑。所以，目前制備質(zhì)粒DNA的實驗室方法雖然很多，但存在著許多問題，例如使用有毒有機試劑酚或氯仿來降低細胞蛋白濃度等，得到的產(chǎn)品不符合世界衛(wèi)生組織的要求，不能用于人體，也大多都不適用于工業(yè)生產(chǎn)。
同時，目前大規(guī)模純化質(zhì)粒DNA的方法有氯化銫密度梯度離心法、親和層系法、分子截留法和多聚陽離子沉淀法等。其中氯化銫密度梯度離心純化質(zhì)粒DNA是最經(jīng)典的方法，雖然此方法所純化的質(zhì)粒DNA能夠達到相關(guān)標準，純度也相當高，但是它必須在使用溴化乙錠和氯化銫的情況下長時間高速離心制得，不僅耗時、耗力，而且污染環(huán)境，費用昂貴，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。
也有報道利用反向?qū)游鯮PC、疏水層析HIC、羥基磷灰石層析HAC、離子交換層析IEX、親和層析AFC和凝膠過濾層析SEC等來純化超螺旋質(zhì)粒DNA，取得了較好的效果。但大多數(shù)過程都用到了溶菌酶來破壞細胞壁，用胰RNase來除去RNA，這樣就引入了動物源性的酶；并且大多數(shù)純化過程都需要3根或更多的層析柱來進行，這樣就增加了生產(chǎn)成本，增加了生產(chǎn)一批產(chǎn)品的時間。
所以，要建立一套純化率高、操作簡單、易于放大、毒性低、低成本的適合工業(yè)化生產(chǎn)的超螺旋質(zhì)粒DNA純化工藝，來解決質(zhì)粒DNA作為生物制劑產(chǎn)品的生產(chǎn)與應(yīng)用過程中面臨的嚴峻挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種超螺旋質(zhì)粒分離純化工藝，不使用動物源性的酶，不使用對人畜有毒的苯酚、氯仿等有機溶劑，優(yōu)化了工藝原料的用量和步驟，降低了生產(chǎn)成本，減少了對環(huán)境的污染，提高了提取效率。
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種超螺旋質(zhì)粒分離純化工藝，包括以下步驟(1)取發(fā)酵菌液，4℃、5000g離心2min，去上清，得菌體沉淀；(2)STE洗脫液洗滌，于4℃、5000g條件下離心2min，去上清，沉淀干燥得濕菌；(3)濕菌中加入溶液I；(4)加入溶液溶液II，輕輕混勻，室溫放置3min；(5)加入冰預(yù)冷溶液III，輕輕混勻，冰上放置5min，于4℃、12000g條件下離心15min，取上清液；(6)上清液中加入硫酸銨調(diào)電導(dǎo)率至280-285ms/cm，4℃放置20min，于4℃、12000g條件下離心15min，取上清液；(7)上清液經(jīng)疏水層析柱層析，洗脫收集第2個峰；(8)第2個峰經(jīng)分子篩柱層析，洗脫收集第1個峰。
步驟(2)所述STE洗滌是用與發(fā)酵菌液等體積的STE將細胞沉淀洗滌，于4℃、5000g條件下離心2min，去上清，干燥沉淀，得濕菌并稱重。
所述STE含0.1mol/L NaCl，pH8.0的10mmol/L Tri s-C1，pH8.0的1mmol/L EDTA。
步驟(3)所述溶液I是按照溶液I濕菌重等于15ml∶1g的比例加入，所述溶液I含pH8.0的25mmol/L Tri s-Cl，pH8.0的10mmol/LEDTA，50mmol/L Glucose。
步驟(4)所述溶液II是按照溶液II溶液I等于l∶1的比例加入，所述溶液II是2％SDS溶液和0.4mol/L Na0H溶液等體積的新鮮混合液。
步驟(5)所述溶液III是按照溶液III溶液I等于1∶1的比例加入，所述溶液III是醋酸鉀緩沖液，濃度為3mol/L。
本發(fā)明步驟(7)所述疏水層析平衡疏水層析的緩沖液為2-3.5mol/L；所述平衡層析緩沖液中EDTA濃度為10mmol/L，Tris-Cl濃度為100mmol/L，所述平衡緩沖液的pH為7.5-8.0。
本發(fā)明的有益效果是1、本發(fā)明所描述的超螺旋質(zhì)粒DNA的純化工藝不使用動物源性的RNase A和蛋白酶K以及對人體和動物有毒副作用的苯酚、氯仿，也沒有使用易燃的試劑乙醇和異丙醇，降低了生產(chǎn)成本和和產(chǎn)品毒性。
2、本發(fā)明優(yōu)化了原料尤其是溶液I的用量，降低了生產(chǎn)成本，減少了對環(huán)境的污染，提高了提取效率。
3、本發(fā)明只利用兩種層析填料達到了對超螺旋質(zhì)粒DNA純化的目的，減少了生產(chǎn)成本，減少了時間，從而提高了生產(chǎn)效率。
4、本發(fā)明為超螺旋質(zhì)粒DNA在制備基因治療和基因疫苗藥物方面的應(yīng)用打下了堅實的基礎(chǔ)。


圖1本發(fā)明溶液I最佳用量篩選2本發(fā)明疏水層析圖譜圖3本發(fā)明疏水層析電泳圖譜，0.8％瓊脂糖，100V電壓，跑后EB染色圖4本發(fā)明分子篩層析圖譜具體實施方式
下面結(jié)合附圖和具體實施例來進一步詳細說明本發(fā)明。
實施例1溶液I最佳用量實驗(1)取菌液20ul，接種到20ml LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中含50ug/ml的Ka，37℃，220rpm離心操作后，培養(yǎng)過夜。取8支離心管分別稱重，記錄重量并分別標號1-8，把過夜菌液混勻，1-8號離心管分別加入混勻的菌液4ml、3.5ml、3ml、2.5ml、2ml、1.5ml、lml、500ul，4000g、4℃條件下離心操作2min。去掉培養(yǎng)液，使細胞沉淀盡可能干燥。
(2)將細胞沉淀分別重懸于4ml、3.5ml、3ml、2.5ml、2ml、1.5ml、1ml、500ul STE，4℃、5000g條件離心2min，去掉洗滌液，使細胞沉淀盡可能干燥。稱各管重量，得菌重分別為0.03g、0.026g、0.023g、0.019g、0.015g、0.013g、0.009g、0.004g。
(3)向1-8號EP管中分別加入100ul預(yù)冷的溶液I，充分混勻。
(4)向1-8號EP管中加入200ul新鮮配制的溶液溶液II，快速顛倒離心管5次，以混合內(nèi)容物。應(yīng)確保離心管的整個內(nèi)表面均與溶液II接觸。不要振蕩，將離心管靜置5min。
(5)向各EP管中加150ul冰預(yù)冷的溶液III，將管倒置后溫和地振蕩10秒鐘使溶液III在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，之后將管置冰上5min。4℃、12000g離心15min，取上清300ul。
(6)加0.6倍體積的異丙醇，4℃放置15min。常溫12000g離心30min。70％乙醇洗兩遍，在空氣中使核酸沉淀干燥10min。1-8號管分別用400ul、350ul、300ul、250ul、200ul、150ul、100ul、50ul TE溶解核酸。取5ul樣品采用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒中超螺旋的含量和比例，得出結(jié)果如圖1，圖1中，縱坐標為質(zhì)粒DNA相對量，每克菌體加溶液I毫升數(shù)。本發(fā)明優(yōu)選溶液I最佳用量控制為溶液I濕菌重等于15ml∶1g。
實施例2(1)取發(fā)酵菌液，4℃，5000g離心2min，去上清，得菌體沉淀。
(2)沉淀用與發(fā)酵菌液等體積的STE洗滌，4℃、5000g離心2min，去上清，使沉淀盡可能干燥，得濕菌，并稱重。
(3)按照溶液I濕菌重等于15ml∶1g的比例向菌體中加入溶液I，使細胞沉淀充分懸浮。
(4)按照溶液II溶液I等于1∶1的比例加入新鮮配制的溶液II，輕輕混勻，室溫放置3min。
(5)按照溶液III溶液I等于1∶1的比例加入冰預(yù)冷溶液III，輕輕混勻，使溶液成分接觸，冰上放置5min。4℃、12000g條件離心15min，取上清液。
(6)向上清液中加入硫酸銨調(diào)電導(dǎo)率至280-285ms/cm，4℃放置20min后，4℃、12000g條件離心15min，取上清。
(7)上清液上預(yù)先平衡好的疏水層析介質(zhì)OCTYL SEPHAROSE 4FAST FLOW柱子，后洗脫收集第2個峰。疏水層析圖譜見圖2，圖2中，1號峰為OC plasmid DNA，2號峰為Supercoiled plasmid DNA，3號峰為RNA，4號峰為小分子雜質(zhì)。
電泳圖譜見圖3，圖3中，由左至右依次為堿裂解上清，加(NH4)2SO4后離心沉淀，加(NH4)2SO4后上清，1號峰峰尖，2號峰峰尖，2號峰大樣，2號峰大樣，3號峰峰尖，4號峰峰尖。
(8)收集的第二個峰上預(yù)先處理好的分子篩層析介質(zhì)SEPHACRYLS-500HR，洗脫收集第一個峰。圖譜見圖4，圖4中，1號峰Supercoiled plasmid DNA；2號峰小分子雜質(zhì)。
采用常規(guī)的0.8％瓊脂糖凝膠電泳方法檢測質(zhì)粒中超螺旋質(zhì)粒含量達95％以上，蛋白、基因組和內(nèi)毒素含量都符合藥典要求。
實驗結(jié)論按照本發(fā)明工藝，采用了溶液I的最佳用量，減少了成本，同時降低了對環(huán)境的污染；上柱前沒有利用異丙醇或乙醇對樣品進行沉淀，直接用硫酸銨來調(diào)節(jié)溶液的電導(dǎo)率和達到除去RNA和蛋白等雜志的效果，減少了損失和生產(chǎn)成本，也為用層析柱進一步純化打下了基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種超螺旋質(zhì)粒分離純化工藝，其特征是包括以下步驟(1)取發(fā)酵菌液，4℃、5000g離心2min，去上清，得菌體沉淀；(2)STE洗脫液洗滌，于4℃、5000g條件下離心2min，去上清，沉淀干燥得濕菌；(3)濕菌中加入溶液I；(4)加入溶液溶液II，輕輕混勻，室溫放置3min；(5)加入冰預(yù)冷溶液III，輕輕混勻，冰上放置5min，于4℃、12000g條件下離心15min，取上清液；(6)上清液中加入硫酸銨調(diào)電導(dǎo)率至280-285ms/cm，4℃放置20min，于4℃、12000g條件下離心15min，取上清液；(7)上清液經(jīng)疏水層析柱層析，洗脫收集第2個峰；(8)第2個峰經(jīng)分子篩柱層析，洗脫收集第1個峰。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其特征是步驟(2)所述STE洗滌是用與發(fā)酵菌液等體積的STE將細胞沉淀洗滌，于4℃、5000g條件下離心2min，去上清，干燥沉淀，得濕菌并稱重。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的工藝，其特征是所述STE含0.1mol/L NaCl，pH8.0的10mmol/L Tris-Cl，pH8.0的1mmol/L EDTA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其特征是步驟(3)所述溶液I是按照溶液I∶濕菌重等于15ml∶1g的比例加入。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的工藝，其特征是所述溶液I含pH8.0的25mmol/L Tri s-Cl，pH8.0的10mmol/L EDTA，50mmol/L Glucose。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其特征是步驟(4)所述溶液II是按照溶液II∶溶液I等于1∶1的比例加入。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的工藝，其特征是所述溶液II是2％SDS溶液和0.4mol/L NaOH溶液等體積的新鮮混合液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其特征是步驟(5)所述溶液III是按照溶液III∶溶液I等于1∶1的比例加入。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或8所述的工藝，其特征是所述溶液III是醋酸鉀緩沖液，濃度為3mol/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其特征是步驟(7)所述疏水層析平衡疏水層析的緩沖液為2-3.5mol/L；所述平衡層析緩沖液中EDTA濃度為10mmol/L，Tris-Cl濃度為100mmol/L，所述平衡緩沖液的pH為7.5-8.0。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種超螺旋質(zhì)粒分離純化工藝，不使用動物源性的酶，不使用對人畜有毒的苯酚、氯仿等有機溶劑，優(yōu)化了工藝原料的用量和步驟，降低了生產(chǎn)成本，減少了對環(huán)境的污染，提高了提取效率，為超螺旋質(zhì)粒DNA在制備基因治療和基因疫苗藥物方面的應(yīng)用打下了堅實的基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/63GK101070543SQ200710028389
公開日2007年11月14日 申請日期2007年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月1日
發(fā)明者黃樹林, 李黃金, 薄華本, 邵紅偉, 沈娟, 余雪松 申請人:廣東藥學(xué)院