專利名稱：一種藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)中色素蛋白質(zhì)材料領(lǐng)域，具體涉及一種藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì) 的制備方法。
背景技術(shù)：
藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍(lán)藻和紅藻光合作用捕光復(fù)合物的功能組分。根據(jù) 其吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡稱CPE)、 藻紅藍(lán)蛋白(phycoerythrocyanin，簡稱PEC)、藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和 變藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin，簡稱APC)。藻紅蛋白、藻紅藍(lán)蛋白、藻紅蛋白和變藻藍(lán) 蛋白含alpha和beta亞基，每個(gè)亞基中藻膽色素(phycobilin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白 脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸殘基的巰基共價(jià)結(jié)合，其種類及其與脫輔 基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜性質(zhì)。藻膽色素與脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合形成特定的 構(gòu)象，使得藻紅蛋白主要吸收約560nm的可見光，發(fā)射約580nm的熒光；藻紅藍(lán)蛋白吸收 約570nm的可見光，發(fā)射約630咖的熒光；藻紅蛋白吸收約620nm的可見光，發(fā)射約640nm 的熒光；變藻藍(lán)蛋白吸收約650 660nm的可見光，發(fā)射約660 670nm的熒光。藻紅蛋白 結(jié)合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB);藻紅藍(lán)蛋白的alpha亞基 結(jié)合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB);藻紅藍(lán)蛋白的beta亞基結(jié) 合的輔基色素為藻藍(lán)膽素(phycocyatiobilin，簡稱PCB);藻紅蛋白和變藻藍(lán)蛋白結(jié)合的 輔基色素都為藻藍(lán)膽素PCB。
藻紅藍(lán)蛋白的alpha亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(chǎn)(Tooley AJ, Glazer AN. Biosynthesis of the cyanobacterial light-harvesting polypeptide phycoerythrocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host. J" Bacteriol. 2002; 184(17): 4666 4671)。藻紅蛋白是藻膽蛋白的一種，廣泛的存在于海洋紅藻中，它特有 的Y亞基將分子中的兩個(gè)三聚體緊緊的鉚在一起，因而結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定，又由于它的色基數(shù)量 和種類最多，光敏效應(yīng)很強(qiáng)，并且無任何毒性。同時(shí)藻紅蛋白不僅分離簡單，價(jià)格低廉， 而且藻紅蛋白本身就有提高機(jī)體免疫能力的作用。目前只是用來作生化試劑和食品添加 劑，還沒有被充分的開發(fā)、利用。
藻紅蛋白的分子結(jié)構(gòu)為通過硫醚鍵連接的載體蛋白與發(fā)色團(tuán)——開鏈線性延展的四 吡咯化合物，其脫輔蛋白單體由a、 e、 Y三種亞基組成，是從藻類中提取純化的，在適
宜波長激發(fā)下能發(fā)射強(qiáng)烈熒光，外觀為紅色凍干粉，易溶于水。
藻藍(lán)膽素生物合成基因由力W和； C州組成，可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(chǎn)藻 藍(lán)膽素(F. T. Landgraf, C. Forreiter， et al. Recombinant holophytochrome in Echerichia coli[J]. FEBS Letters, 2001, 508:459-462)。與前人的方法不同，我們發(fā)現(xiàn)力朋Z ae/3asp. PCC7120中a7/v^77基因、5>/7ec/ oc/s"s sp. PCC 6803中s7/^^^基因編碼beta裂合 酶，在其它藍(lán)藻中也存在同源的beta裂合酶。這些beta裂合酶能催化藻藍(lán)膽素與藻紅藍(lán) 蛋白的beta亞基及其同源蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，從而生成具有優(yōu)良熒光性質(zhì)的藻紅藍(lán)蛋白類 熒光蛋白質(zhì)。在絕大部分的藍(lán)藻和紅藻中，都存在有編碼藻紅蛋白脫輔基蛋白、藻紅蛋白 脫輔基蛋白、變藻藍(lán)蛋白脫輔基蛋白、beta裂合酶以及藻藍(lán)膽素生物合成所需的酶的基 因，其中某些缺乏PE而具有異形胞的藍(lán)藻中存在藻紅藍(lán)蛋白；隱藻中沒有藻膽體，不存 在上述基因中的變藻藍(lán)蛋白的基因。藻膽蛋白類熒光蛋白質(zhì)可以應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域。目前使用的 藻膽蛋白類熒光蛋白質(zhì)主要從藍(lán)藻和紅藻中提取(高純度藻膽蛋白的分離方法， CN1344723, 2002.04.17。 一種水華藍(lán)藻制備藻藍(lán)蛋白的方法，CN1563083, 2005.01.12)。 本方法不利用藻類作為原料，而是利用基因工程方法生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白。藻紅藍(lán)蛋白類熒光 蛋白質(zhì)具有優(yōu)良的熒光性質(zhì)，為了發(fā)展藻紅藍(lán)蛋白類新型熒光探針，可以分子設(shè)計(jì)藻紅藍(lán) 蛋白類熒光蛋白質(zhì)。本方法為藻紅藍(lán)蛋白類色素蛋白質(zhì)功能材料應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī) 藥和生物工程領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，它是應(yīng)用beta裂合酶催化藻藍(lán)膽素與藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合，從而制備藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，將含有beta裂合酶基因、藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因和藻藍(lán)膽素生物合成酶基因的表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入宿主菌，得到相應(yīng)的工程菌，通過如此設(shè)計(jì)的基因工程菌生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。本發(fā)明的目的是提供一種藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，包括以下(1) 采用基因工程方法，將beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表達(dá)載體中，得到 beta裂合酶表達(dá)質(zhì)粒，應(yīng)用基因工程方法將藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因 克隆于第二個(gè)表達(dá)載體中，得到脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；應(yīng)用基因工程方法將藻藍(lán)膽素生物 合成酶基因(力o7和pcW)或其同源基因克隆于第三個(gè)和(或)第四個(gè)表達(dá)載體中，得到 藻藍(lán)膽素合成酶表達(dá)質(zhì)粒。(2) 將beta裂合酶表達(dá)質(zhì)粒、脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、藻藍(lán)膽素合成酶表達(dá)質(zhì)粒依次 轉(zhuǎn)入配套的宿主菌。(3) 當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌，應(yīng)用此工程菌通過發(fā)酵 工程能生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。(4) 發(fā)酵后，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1、 不使用藻類為原料而是利用大腸桿菌生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，大腸桿菌繁 殖快，可以大大縮短周期；2、 與藻類相比，大腸桿菌細(xì)胞壁容易破碎，純化過程中可節(jié)省能源；3、 通過大腸桿菌生產(chǎn)，目標(biāo)蛋白含量高，有His-tag標(biāo)記，且體系中幾乎沒有性質(zhì) 類似的蛋白，提取方便；4、 方便進(jìn)行藻膽蛋白分子設(shè)計(jì)，有利于發(fā)展熒光藻膽蛋白類色素蛋白質(zhì)功能材料。


圖1為本發(fā)明制備的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的吸收與熒光光譜；其中實(shí)線為吸收光 譜，而虛線為熒光光譜。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳述 實(shí)施例1:(1)采用基因工程方法，可以從GeneBank中查到。藻種^7a力ae;7a sp.PCC7120和 5y/7ec/ ocy"A sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測定完成。力/ a6ae/7a sp. PCC7120在GeneBank 中編號(hào)為BA000019，加ec/ oc/"is sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為:BA000022, 可從全序列中找到所需基因；^朋tee朋sp. PCC7120中的3^rW77基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a7^rt^7;7，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為 模版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn) 入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2 )應(yīng)用基因工程方法將藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因漢2X^"歪A ^克隆于Novagen 公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-藻"ir^"蛋A5，在大腸桿菌中能表達(dá)脫輔基 蛋白藻紅藍(lán)蛋白B;即裂合酶alr0617或者slr2049在pCDFDuet中，處于第二個(gè)多克隆位 點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是Nde I和Xho I ;當(dāng)裂合酶和脫輔基蛋白同時(shí)在pCDFDuet時(shí)，裂合酶在 載體中的位置不變，只是在另外一個(gè)多克隆位點(diǎn)多了一個(gè)脫輔基蛋白基因。脫輔基蛋白cpcB在pET30中是在EcoRV和Xho I之間；當(dāng)脫輔基蛋白跟裂合酶同時(shí) 在pCDFDuet時(shí)，脫輔基蛋白在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，所用的酶切位點(diǎn)是EcoRI和PstI。PCB合成酶是2個(gè)基因(H01和PcyA)，當(dāng)他們在同一個(gè)載體的時(shí)候，hol處于第一個(gè) 多克隆位點(diǎn)，在Nco I和Pst I之間，pcyA在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Nde I和Xho I之間； 當(dāng)H01和PcyA不在同一個(gè)載體的時(shí)候，他們在相應(yīng)的載體中的位置也是同樣的酶切位點(diǎn)。(3) 應(yīng)用基因工程方法將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力o/和pcy力克隆于Novagen 公司的pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7-pc/A在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01 和PcyA?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對。上游下游 都分別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基 因片段，把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收。所得片段用設(shè)計(jì)的酶進(jìn)行酶切，同時(shí)也把載體 用同樣的酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在T4連接酶 作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4) 將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，轉(zhuǎn)化方式如下從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21 (DE3)單菌落，接種于5mL LB培養(yǎng)基， 37。C振蕩培養(yǎng)過夜。取100)aL飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mL LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng) 至OD600 = 0.3 0.4時(shí)，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10min。離心lmin (10000g， 4。C)棄去上清，收集沉淀菌體。用lmL預(yù)冷的0.1mol/L CaC12無菌溶液重懸菌 體，離心30s(10000g, 4。C)去上清，菌體沉淀用100nL預(yù)冷的0.1mol/L CaC12重懸，放置于 冰上，加入一定量的連接產(chǎn)物或構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻冰浴放置30min， 42。C熱休克90s， 冰浴5min后加入300)aL LB培養(yǎng)基，37°C低速振蕩培養(yǎng)45min，無菌涂布在含有相應(yīng)抗 生素的LB培養(yǎng)基平板上，倒置于37°C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個(gè)左右菌落，分別接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和； 分別從中取lOOpL轉(zhuǎn)接至5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中。37°C振蕩培養(yǎng)至OD600= 0.5-0.7時(shí)，冰浴約30min，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。避光，20度，150轉(zhuǎn)/分，表達(dá)約l-小時(shí)。 離心收集細(xì)胞，細(xì)胞加入緩沖液重懸。通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌 株進(jìn)行大量表達(dá)。將pCDFDuet-a7/^W7、 pET30-漢^iT^^"歪^ 5和pACYCDuet-力o7-pc^轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌。將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至006。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophylthio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmraol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)12至16小時(shí)，生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的藻紅藍(lán)蛋
白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。 實(shí)施例2:(1)采用基因工程方法，可以從GeneBank中査到。藻種^7a力朋朋sp.PCC7120和 5>/7ec/ oc;^z^s sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測定完成?！古?朋朋sp. PCC7120在GeneBank 中編號(hào)為BA000019， 5y/ ec/ oc/s"s sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為BA000022, 可從全序列中找到所需基因；^/7a6aey a sp. PCC7120中的a^rt W7基因克隆于Novagen 公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet- WrW77，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合 酶。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為 模版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn) 入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2)應(yīng)用基因工程方法將藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因藻^T^"歪A A(C155I)克隆于 Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-湊"^1"_^"歪^5(<:1551)，在大腸桿 菌中能表達(dá)脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B(C1551);即裂合酶alr0617或者slr2049在pCDFDuet 中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是NdeI和XhoI ;當(dāng)裂合酶和脫輔基蛋白同時(shí)在 pCDFDuet時(shí)，裂合酶在載體中的位置不變，只是在另外一個(gè)多克隆位點(diǎn)多了一個(gè)脫輔基 蛋白基因。脫輔基蛋白cpcB在pET30中是在EcoRV和Xho I之間；當(dāng)脫輔基蛋白跟裂合酶同時(shí) 在pCDFDuet時(shí)，脫輔基蛋白在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，所用的酶切位點(diǎn)是EcoR I和Pst I 。PCB合成酶是2個(gè)基因(H01和PcyA),當(dāng)他們在同一個(gè)載體的時(shí)候，hol處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，在NcoI和PstI之間，pcyA在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Nde I和Xho I之間；當(dāng)H01和PcyA不在同一個(gè)載體的時(shí)候，他們在相應(yīng)的載體中的位置也是同樣的酶切位點(diǎn)。(3)應(yīng)用基因工程方法將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力o7和pcj^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7-/ c/A在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PcyA?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對。上游下游都分別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收。所得片段用設(shè)計(jì)的酶進(jìn)行酶切，同時(shí)也把載體用同樣的酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4)將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，轉(zhuǎn)化方式如下 從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基， 37。C振蕩培養(yǎng)過夜。取100)aL飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mLLB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng) 至OD600 = 0.3 0.4時(shí)，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10min。離心lmin (10000g， 4。C)棄去上清，收集沉淀菌體。用lmL預(yù)冷的0.1mol/L CaC12無菌溶液重懸菌 體，離心30s(10000g，4。C)去上清，菌體沉淀用100nL預(yù)冷的0.1mol/LCaC12重懸，放置于 冰上，加入一定量的連接產(chǎn)物或構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻冰浴放置30min， 42。C熱休克90s， 冰浴5min后加入300pL LB培養(yǎng)基，37°C低速振蕩培養(yǎng)45min，無菌涂布在含有相應(yīng)抗 生素的LB培養(yǎng)基平板上，倒置于37°C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個(gè)左右菌落，分別接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和； 分別從中取100pL轉(zhuǎn)接至5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中。37°C振蕩培養(yǎng)至OD600= 0.5-0.7時(shí)，冰浴約30min，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。避光，20度，150轉(zhuǎn)/分，表達(dá)約l-小時(shí)。 離心收集細(xì)胞，細(xì)胞加入緩沖液重懸。通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌 株進(jìn)行大量表達(dá)。將pCDFDuet-W/"M77、 pET30-^"iT^歪y^5(C1551)和pACYCDuet-力W-轉(zhuǎn)入大腸 桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌，此工程菌通過發(fā)酵能生產(chǎn)藻紅 藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B(C1551)。按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，可提純得 到相應(yīng)的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B(C1551)。實(shí)施例3:(1)釆用基因工程方法，可以從GeneBank中査到。藻種^7a6ae/7a sp. PCC7120和 5>/7ec/ ocy"is sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測定完成。Z朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank 中編號(hào)為BA000019， 5y露/ o，tis sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為:BA000022， 可從全序列中找到所需基因；5y/7ec力oc/"/ssp. PCC 6803中^r^似^基因克隆于Novagen 公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet- W/"i^必，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合 酶。根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為 模版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn) 入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2)應(yīng)用基因工程方法將藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因湊^r^"歪^5克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-漢^iT^"歪AA在大腸桿菌中能表達(dá)脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B;即裂合酶alr0617或者slr2049在pCDFDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是Nde I和Xho I ;當(dāng)裂合酶和脫輔基蛋白同時(shí)在pCDFDuet時(shí)，裂合酶在
載體中的位置不變，只是在另外一個(gè)多克隆位點(diǎn)多了一個(gè)脫輔基蛋白基因。脫輔基蛋白cpcB在pET30中是在EcoRV和Xho I之間；當(dāng)脫輔基蛋白跟裂合酶同時(shí) 在pCDFDuet時(shí)，脫輔基蛋白在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，所用的酶切位點(diǎn)是EcoRI和PstI 。PCB合成酶是2個(gè)基因(H01和PcyA)，當(dāng)他們在同一個(gè)載體的時(shí)候，hol處于第一個(gè) 多克隆位點(diǎn)，在Nco I和Pst I之間，pcyA在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在NdeI和XhoI之間； 當(dāng)H01和PcyA不在同一個(gè)載體的時(shí)候，他們在相應(yīng)的載體中的位置也是同樣的酶切位點(diǎn)。 (3)應(yīng)用基因工程方法將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力o/和克隆于Novagen 公司的pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o卜/ c州，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01 和PcyA?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對。上游下游 都分別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基 因片段，把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收。所得片段用設(shè)計(jì)的酶進(jìn)行酶切，同時(shí)也把載體 用同樣的酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在T4連接酶 作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4)將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，轉(zhuǎn)化方式如下 從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基， 37。C振蕩培養(yǎng)過夜。取100)aL飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mLLB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng) 至OD600=0.3 0.4時(shí)，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10min。離心lmin (10000g， 4。C)棄去上清，收集沉淀菌體。用lmL預(yù)冷的0.1mol/L CaC12無菌溶液重懸菌 體,離心30s(10000g,4。C)去上清，菌體沉淀用100pL預(yù)冷的0.1mol/LCaC12重懸，放置于 冰上，加入一定量的連接產(chǎn)物或構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻冰浴放置30min， 42。C熱休克90s， 冰浴5min后加入300pL LB培養(yǎng)基，37°C低速振蕩培養(yǎng)45min，無菌涂布在含有相應(yīng)抗 生素的LB培養(yǎng)基平板上，倒置于37°C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個(gè)左右菌落，分別接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和； 分別從中取100nL轉(zhuǎn)接至5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中。37°C振蕩培養(yǎng)至OD600= 0.5-0.7時(shí)，冰浴約30min，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。避光，20度，150轉(zhuǎn)/分，表達(dá)約l-小時(shí)。 離心收集細(xì)胞，細(xì)胞加入緩沖液重懸。通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌 株進(jìn)行大量表達(dá)。將pCDFDuet-slr2049、pET30-藻紅藍(lán)蛋白B 和Ai9和pACYCDuet-力o7-p《W轉(zhuǎn)入大腸桿菌， 當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌，此工程菌通過發(fā)酵能生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白 類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，可提純得到相應(yīng)的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。 實(shí)施例4:(1)采用基因工程方法，可以從GeneBank中查到。藻種力/ atee朋sp.PCC7120和 5"/77ec/ ocz^'s sp. PCC 6803的全序列己經(jīng)測定完成。^/ a/ ae朋sp. PCC7120在GeneBank 中編號(hào)為BA000019, 5>/7ec/ ocj^"s sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為:BA000022, 可從全序列中找到所需基因；分/2ec/wc/s"ssp. PCC 6803中W/^似9基因克隆于Novagen 公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-W/^似9，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合 酶。根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為 模版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn) 入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2)應(yīng)用基因工程方法將藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因湊^ir^^^^冷MC155I)克隆于 Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-湊"iT^歪力^(C1551)，在大腸桿 菌中能表達(dá)脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B(C1551);即裂合酶alr0617或者slr2049在pCDFDuet 中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是NdeI和XhoI ;當(dāng)裂合酶和脫輔基蛋白同時(shí)在 pCDFDuet時(shí)，裂合酶在載體中的位置不變，只是在另外一個(gè)多克隆位點(diǎn)多了一個(gè)脫輔基 蛋白基因。脫輔基蛋白cpcB在pET30中是在EcoRV和Xho I之間；當(dāng)脫輔基蛋白跟裂合酶同時(shí) 在pCDFDuet時(shí)，脫輔基蛋白在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，所用的酶切位點(diǎn)是EcoRI和PstI。PCB合成酶是2個(gè)基因(H01和PcyA)，當(dāng)他們在同一個(gè)載體的時(shí)候，hol處于第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，在NcoI和PstI之間，pcyA在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在NdeI和XhoI之間；當(dāng)H01和PcyA不在同一個(gè)載體的時(shí)候，他們在相應(yīng)的載體中的位置也是同樣的酶切位點(diǎn)。(3)應(yīng)用基因工程方法將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力W和pcy力)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7-pc州，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PcyA?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對。上游下游都分別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模版。經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把所得基因片段進(jìn)行電泳，回收。所得片段用設(shè)計(jì)的酶進(jìn)行酶切，同時(shí)也把載體用同樣的酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4-6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。(4)將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，轉(zhuǎn)化方式如下
從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基， 37。C振蕩培養(yǎng)過夜。取10(HiL飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mLLB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng) 至OD600=0.3 0.4時(shí)，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10min。離心lmin (10000g， 4。C)棄去上清，收集沉淀菌體。用lmL預(yù)冷的0.1mol/LCaC12無菌溶液重懸菌 體，離心30s(10000g, 4。C)去上清，菌體沉淀用100pL預(yù)冷的0.1mol/L CaC12重懸，放置于 冰上，加入一定量的連接產(chǎn)物或構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻冰浴放置30min， 42。C熱休克90s， 冰浴5min后加入300(aL LB培養(yǎng)基，37°C低速振蕩培養(yǎng)45min,無菌涂布在含有相應(yīng)抗 生素的LB培養(yǎng)基平板上，倒置于37°C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個(gè)左右菌落，分別接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和； 分別從中取100pL轉(zhuǎn)接至5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中。37°C振蕩培養(yǎng)至OD600= 0.5-0.7時(shí)，冰浴約30min，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。避光，20度，150轉(zhuǎn)/分，表達(dá)約l-小時(shí)。 離心收集細(xì)胞，細(xì)胞加入緩沖液重懸。通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌 株進(jìn)行大量表達(dá)。將pCDFDuet-W/^似義pET30-^"iT^"歪^^(C155I)和pACYCDuet-/ o7-;)c/力轉(zhuǎn)入大腸 桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌，此工程菌通過發(fā)酵能生產(chǎn)藻紅 藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B(C1551)。按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，可提純得 到相應(yīng)的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B(C1551)。實(shí)施例5:(1)采用基因工程方法，可以從GeneBank中查到。藻種^a&e朋sp. PCC7120和 5y/ ec/wc/"A sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測定完成。/l朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank 中編號(hào)為BA000019， 5y"ec力oc/stis sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為BA000022， 可從全序列中找到所需基因；勱a力se朋sp. PCC7120中的Wr^^和麥iT藍(lán)歪力5基因 克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet- a7i"。W7-湊^T^"歪y^ A 在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)beta裂合酶和藻紅藍(lán)蛋白B。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為 模版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn) 入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2)應(yīng)用基因工程方法將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力o7和pc^)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o卜pc/A在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PcyA;即裂合酶alr0617或者slr2049在pCDFDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是NdeI和XhoI;當(dāng)裂合酶和脫輔基蛋白同時(shí)在pCDFDuet時(shí)，裂合酶在載體中的位 置不變，只是在另外一個(gè)多克隆位點(diǎn)多了一個(gè)脫輔基蛋白基因。脫輔基蛋白cpcB在pET30中是在EcoRV和Xho I之間；當(dāng)脫輔基蛋白跟裂合酶同時(shí) 在pCDFDuet時(shí)，脫輔基蛋白在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，所用的酶切位點(diǎn)是EcoR I和Pst I 。PCB合成酶是2個(gè)基因(H01和PcyA)，當(dāng)他們在同一個(gè)載體的時(shí)候，hol處于第一個(gè) 多克隆位點(diǎn)，在NcoI和PstI之間，pcyA在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在NdeI和XhoI之間； 當(dāng)H01和PcyA不在同一個(gè)載體的時(shí)候，他們在相應(yīng)的載體中的位置也是同樣的酶切位點(diǎn)。 (3)將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，轉(zhuǎn)化方式如下 從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基， 37。C振蕩培養(yǎng)過夜。取100nL飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mLLB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng) 至OD600=0.3 0.4時(shí)，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10min。離心lmin (10000g， 4。C)棄去上清，收集沉淀菌體。用lmL預(yù)冷的0.1mol/L CaC12無菌溶液重懸菌 體,離心30s(10000g,4。C)去上清，菌體沉淀用100i!L預(yù)冷的0.1mol/LCaC12重懸，放置于 冰上，加入一定量的連接產(chǎn)物或構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻冰浴放置30min， 42。C熱休克卯s， 冰浴5min后加入300pL LB培養(yǎng)基，37°C低速振蕩培養(yǎng)45min，無菌涂布在含有相應(yīng)抗 生素的LB培養(yǎng)基平板上，倒置于37°C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個(gè)左右菌落，分別接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和； 分別從中取lOOpL轉(zhuǎn)接至5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中。37°C振蕩培養(yǎng)至OD600= 0.5-0.7時(shí)，冰浴約30min，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。避光，20度，150轉(zhuǎn)/分，表達(dá)約l-小時(shí)。 離心收集細(xì)胞，細(xì)胞加入緩沖液重懸。通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌 株進(jìn)行大量表達(dá)。將pCDFDuet-aZrt W7-^"iT^^"歪A 5和pACYCDuet-力o卜/ c州依次轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng) 這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌，此工程菌通過發(fā)酵能生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類 熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，可提純得到相應(yīng)的藻紅藍(lán) 蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。實(shí)施例6:1)采用基因工程方法，可以從GeneBank中查到。藻種^7atee; a sp. PCC7120和5y/ ec力oc/"ys sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測定完成。力朋力朋朋sp. PCC7120在GeneBank中編號(hào)為BA000019, 5y朋c力oc/s"s sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為BA000022，可從全序列中找到所需基因；^ a/ ae朋sp. PCC7120中的aZrt^77和麥iT^"歪A^(C1551)基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-a7r。W7-湊—iT^^"蛋AMC155I),在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)beta裂合酶和藻紅藍(lán)蛋白B(C1551)。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為 模版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn) 入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2)應(yīng)用基因工程方法將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力o7和/^^)克隆于Novagen公 司的pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7-; cW，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01 和PcyA;即裂合酶alr0617或者slr2049在pCDFDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位 點(diǎn)是Nde I和Xho I ;當(dāng)裂合酶和脫輔基蛋白同時(shí)在pCDFDuet時(shí)，裂合酶在載體中的位 置不變，只是在另外一個(gè)多克隆位點(diǎn)多了一個(gè)脫輔基蛋白基因。脫輔基蛋白cpcB在pET30中是在EcoRV和Xho I之間；當(dāng)脫輔基蛋白跟裂合酶同時(shí) 在pCDFDuet時(shí)，脫輔基蛋白在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，所用的酶切位點(diǎn)是EcoR I和Pst I 。PCB合成酶是2個(gè)基因(H01和PcyA)，當(dāng)他們在同一個(gè)載體的時(shí)候，hol處于第一個(gè) 多克隆位點(diǎn)，在NcoI和PstI之間，pcyA在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在NdeI和XhoI之間； 當(dāng)HOl和PcyA不在同一個(gè)載體的時(shí)候，他們在相應(yīng)的載體中的位置也是同樣的酶切位點(diǎn)。 (3)將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，轉(zhuǎn)化方式如下 從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3傳菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基， 37。C振蕩培養(yǎng)過夜。取100pL飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mLLB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng) 至OD600=0.3 0.4時(shí)，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10min。離心lmin (10000g， 4。C)棄去上清，收集沉淀菌體。用lmL預(yù)冷的0.1mol/L CaC12無菌溶液重懸菌 體,離心30s(10000g， 4。C)去上清，菌體沉淀用100pL預(yù)冷的0.1mol/L CaC12重懸，放置于 冰上，加入一定量的連接產(chǎn)物或構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻冰浴放置30min， 42。C熱休克90s， 冰浴5min后加入300pL LB培養(yǎng)基，37°C低速振蕩培養(yǎng)45min，無菌涂布在含有相應(yīng)抗 生素的LB培養(yǎng)基平板上，倒置于37°C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個(gè)左右菌落，分別接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和； 分別從中取lOO(iL轉(zhuǎn)接至5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中。37°C振蕩培養(yǎng)至OD600= 0.5-0.7時(shí)，冰浴約30min，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。避光，20度，150轉(zhuǎn)/分，表達(dá)約l-小時(shí)。 離心收集細(xì)胞，細(xì)胞加入緩沖液重懸。通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌 株進(jìn)行大量表達(dá)。將pCDFDuet-aZrt^77-虔^iZ"^^歪^5(C155I)和pACYCDuet-轉(zhuǎn)入大腸桿菌， 當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌，此工程菌通過發(fā)酵能生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白 類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B(C1551)。按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，可提純得到相應(yīng) 的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B(C1551)。
實(shí)施例7:(1)采用基因工程方法，可以從GeneBank中查到。藻種力/^力ae/7a sp. PCC7120和 5y/ ec力oc/"is sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測定完成。力朋6ae朋sp. PCC7120在GeneBank 中編號(hào)為BA000019, 5>77ec/ oc/"j's sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為:BA000022, 可從全序列中找到所需基因；5y/jec力ocy"^s sp. PCC 6803中的Wri"似^和湊^iT^"歪力5 基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet- ^/^^^^"^1"_#"歪力 &在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)beta裂合酶和藻紅藍(lán)蛋白B。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為 模版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn) 入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2)應(yīng)用基因工程方法將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(力o7和pcy"克隆于Novagen公 司的pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-/ o/-/ c_M，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)HOI 和PcyA;即裂合酶alr0617或者slr2049在pCDFDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位 點(diǎn)是NdeI和XhoI;當(dāng)裂合酶和脫輔基蛋白同時(shí)在pCDFDuet時(shí)，裂合酶在載體中的位 置不變，只是在另外一個(gè)多克隆位點(diǎn)多了一個(gè)脫輔基蛋白基因。脫輔基蛋白cpcB在pET30中是在EcoRV和Xho I之間；當(dāng)脫輔基蛋白跟裂合酶同時(shí) 在pCDFDuet時(shí)，脫輔基蛋白在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，所用的酶切位點(diǎn)是EcoR I和Pst I 。PCB合成酶是2個(gè)基因(H01和PcyA)，當(dāng)他們在同一個(gè)載體的時(shí)候，hoi處于第一個(gè) 多克隆位點(diǎn)，在NcoI和PstI之間，pcyA在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在NdeI和XhoI之間； 當(dāng)H01和PcyA不在同一個(gè)載體的時(shí)候，他們在相應(yīng)的載體中的位置也是同樣的酶切位點(diǎn)。 (3)將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，轉(zhuǎn)化方式如下 從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3傳菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基， 37。C振蕩培養(yǎng)過夜。取100^L飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mLLB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng) 至OD600 = 0.3 0.4時(shí)，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10min。離心lmin (10000g， 4。C)棄去上清，收集沉淀菌體。用lmL預(yù)冷的0.1moI/L CaC12無菌溶液重懸菌 體,離心30s(10000g，4。C)去上清，菌體沉淀用10(^L預(yù)冷的0.1mol/LCaCI2重懸，放置于 冰上，加入一定量的連接產(chǎn)物或構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻冰浴放置30min， 42。C熱休克90s， 冰浴5min后加入300pL LB培養(yǎng)基，37°C低速振蕩培養(yǎng)45min，無菌涂布在含有相應(yīng)抗 生素的LB培養(yǎng)基平板上，倒置于37°C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個(gè)左右菌落，分別接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和；分別從中取100pL轉(zhuǎn)接至5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中。37°C振蕩培養(yǎng)至OD600= 0.5-0.7時(shí)，冰浴約30min,加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。避光，20度，150轉(zhuǎn)/分，表達(dá)約l-小時(shí)。 離心收集細(xì)胞，細(xì)胞加入緩沖液重懸。通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌 株進(jìn)行大量表達(dá)。將pCDFDuet- slr2049-藻紅藍(lán)蛋白B和pACYCDuet-hol-pcyA轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些 質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌，此工程菌通過發(fā)酵能生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光 蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，可提純得到相應(yīng)的藻紅藍(lán)蛋白 類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。實(shí)施例8:1)采用基因工程方法，可以從GeneBank中査到。藻種Anabaena sp.PCC7120和 Synechocystis sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測定完成Anabaena sp.PCC7120在GeneBank 中編號(hào)為BA000019, Synechocystis sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為BA000022, 可從全序列中找到所需基因；Synechocystis sp. PCC 6803中的藻紅藍(lán)蛋白B(C155I)基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-slr2049-藻紅藍(lán)蛋白B(C155I)，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)beta裂合酶和藻紅藍(lán)蛋白B(C155I)。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為 模版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn) 入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2)應(yīng)用基因工程方法將藻藍(lán)膽素生物合成酶基因(hol和pcyA)克隆于Novagen公 司的pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-hol-pcyA，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01 和PcyA;即裂合酶alr0617或者slr2049在pCDFDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位 點(diǎn)是Nde I和Xho I ;當(dāng)裂合酶和脫輔基蛋白同時(shí)在pCDFDuet時(shí)，裂合酶在載體中的位 置不變，只是在另外一個(gè)多克隆位點(diǎn)多了一個(gè)脫輔基蛋白基因。脫輔基蛋白cpcB在pET30中是在EcoRV和Xho I之間；當(dāng)脫輔基蛋白跟裂合酶同時(shí) 在pCDFDuet時(shí)，脫輔基蛋白在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，所用的酶切位點(diǎn)是EcoRI和Pst I 。PCB合成酶是2個(gè)基因(H01和PcyA)，當(dāng)他們在同一個(gè)載體的時(shí)候，hoi處于第一個(gè) 多克隆位點(diǎn)，在NcoI和PstI之間，pcyA在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Nde I和Xho I之間； 當(dāng)H01和PcyA不在同一個(gè)載體的時(shí)候，他們在相應(yīng)的載體中的位置也是同樣的酶切位點(diǎn)。 (3)將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，轉(zhuǎn)化方式如下 從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基， 37。C振蕩培養(yǎng)過夜。取lOOpL飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mLLB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng) 至OD600=0.3 0.4時(shí)，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10min。離心lmin (lOOOOg， 4。C)棄去上清，收集沉淀菌體。用lmL預(yù)冷的0.1mol/L CaC12無菌溶液重懸菌 體,離心30s(10000g,4。C)去上清，菌體沉淀用100pL預(yù)冷的0.1mol/LCaC12重懸，放置于 冰上，加入一定量的連接產(chǎn)物或構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻冰浴放置30min， 42。C熱休克90s， 冰浴5min后加入300)aL LB培養(yǎng)基，37°C低速振蕩培養(yǎng)45min，無菌涂布在含有相應(yīng)抗 生素的LB培養(yǎng)基平板上，倒置于37°C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個(gè)左右菌落，分別接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和； 分別從中取IOOjuL轉(zhuǎn)接至5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中。37°C振蕩培養(yǎng)至OD600 = 0.5-0.7時(shí)，冰浴約30min，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。避光，20度，150轉(zhuǎn)/分，表達(dá)約l-小時(shí)。 離心收集細(xì)胞，細(xì)胞加入緩沖液重懸。通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌 株進(jìn)行大量表達(dá)。將pCDFDuet-s7r^^^^"iT^"歪A5(C155I)和pACYCDuet-力o -/ c_M轉(zhuǎn)入大腸桿菌， 當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌，此工程菌通過發(fā)酵能生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白 類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B(C1551)。按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，可提純得到相應(yīng) 的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B(C1551)。實(shí)施例9:(1)采用基因工程方法，可以從GeneBank中査到。藻種J朋6朋朋sp. PCC7120和 5y/ ec/ oc/"is sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測定完成。J朋Z ae朋sp. PCC7120在GeneBank 中編號(hào)為BA000019, 5>/7ec/wc/s"s sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為BA000022, 可從全序列中找到所需基因；A7aAse朋sp. PCC7120中的Wr 77基因克隆于Novagen公 司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet- alrt W7，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為 模版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn) 入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2)應(yīng)用基因工程方法將藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因藻^T^"歪A^克隆于Novagen 公司的表達(dá)載體pCOLADuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-藻^T^"蛋力A在大腸桿菌中能 表達(dá)脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B;即裂合酶alr0617或者slr2049在pCDFDuet中，處于第二 個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是Nde I和Xho I ;當(dāng)裂合酶和脫輔基蛋白同時(shí)在pCDFDuet時(shí)， 裂合酶在載體中的位置不變，只是在另外一個(gè)多克隆位點(diǎn)多了一個(gè)脫輔基蛋白基因。脫輔基蛋白cpcB在pET30中是在EcoRV和Xho I之間；當(dāng)脫輔基蛋白跟裂合酶同時(shí) 在pCDFDuet時(shí)，脫輔基蛋白在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，所用的酶切位點(diǎn)是EcoR I和Pst I 。PCB合成酶是2個(gè)基因(HOI和PcyA)，當(dāng)他們在同一個(gè)載體的時(shí)候，hoi處于第一個(gè)
多克隆位點(diǎn)，在Nco I和Pst I之間，pcyA在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在Nde I和Xho I之間； 當(dāng)H01和PcyA不在同一個(gè)載體的時(shí)候，他們在相應(yīng)的載體中的位置也是同樣的酶切位點(diǎn)。(3) 應(yīng)用基因工程方法將藻藍(lán)膽素生物合成基因之一的力o7克隆于Novagen公司的 pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o厶在大腸桿菌中能表達(dá)HOl。(4) 應(yīng)用基因工程方法將藻藍(lán)膽素生物合成基因之一的pcy力克隆于Novagen公司的 pETDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-/ c//！，在大腸桿菌中能表達(dá)PcyA。(5)將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，轉(zhuǎn)化方式如下 從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基， 37。C振蕩培養(yǎng)過夜。取100)aL飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mL LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng) 至OD600 = 0.3 0.4時(shí)，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10min。離心lmin (lOOOOg， 4。C)棄去上清，收集沉淀菌體。用lmL預(yù)冷的0.1mol/L CaC12無菌溶液重懸菌 體，離心30s(10000g, 4。C)去上清，菌體沉淀用lOO)iL預(yù)冷的0.1mol/L CaC12重懸，放置于 冰上，加入一定量的連接產(chǎn)物或構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻冰浴放置30min， 42。C熱休克卯s， 冰浴5min后加入300pL LB培養(yǎng)基，37°C低速振蕩培養(yǎng)45min，無菌涂布在含有相應(yīng)抗 生素的LB培養(yǎng)基平板上，倒置于37°C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個(gè)左右菌落，分別接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和； 分別從中取lOO^L轉(zhuǎn)接至5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中。37°C振蕩培養(yǎng)至OD600-0.5-0.7時(shí)，冰浴約30min，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。避光，20度，150轉(zhuǎn)/分，表達(dá)約l-小時(shí)。 離心收集細(xì)胞，細(xì)胞加入緩沖液重懸。通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌 株進(jìn)行大量表達(dá)。將pCDFDuet-aZr(^77、 pC0LADuet-^"iT^"歪力仏pACYCDuet-力o7和pETDuet-pc/Z 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌，此工程菌通過發(fā)酵能 生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，可提純 得到相應(yīng)的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。實(shí)施例10:(1)采用基因工程方法，可以從GeneBank中查到。藻種^s6ae朋sp.PCC7120和 分"ec力ocj^"s sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測定完成。Z朋Z ae/7a sp. PCC7120在GeneBank 中編號(hào)為BA000019，分/7ec力ocy"is sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為BA000022， 可從全序列中找到所需基因；^7s6ae/ s sp. PCC7120中的alrt^/7基因克隆于Novagen 公司的pCDFDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet- aZrM77，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合 酶。 根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為 模版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn) 入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2)應(yīng)用基因工程方法將藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因藻—iT^"歪A S(C155I)克隆于 Novagen公司的表達(dá)載體pCOLADuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-湊"iZ"^^"^^Ai9(C1551), 在大腸桿菌中能表達(dá)脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B(C1551);即裂合酶alr0617或者slr2049在 pCDFDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是Nde I和Xho I ;當(dāng)裂合酶和脫輔基 蛋白同時(shí)在pCDFDuet時(shí)，裂合酶在載體中的位置不變，只是在另外一個(gè)多克隆位點(diǎn)多了 一個(gè)脫輔基,蛋白基因。脫輔基蛋白cpcB在pET30中是在EcoRV和Xho I之間；當(dāng)脫輔基蛋白跟裂合酶同時(shí) 在pCDFDuet時(shí)，脫輔基蛋白在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，所用的酶切位點(diǎn)是EcoRI和PstI。PCB合成酶是2個(gè)基因(H01和PcyA)，當(dāng)他們在同一個(gè)載體的時(shí)候，hol處于第一個(gè) 多克隆位點(diǎn)，在NcoI和PstI之間，pcyA在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在NdeI和XhoI之間； 當(dāng)H01和PcyA不在同一個(gè)載體的時(shí)候，他們在相應(yīng)的載體中的位置也是同樣的酶切位點(diǎn)。(3) 應(yīng)用基因工程方法將藻藍(lán)膽素生物合成基因之一的力o7克隆于Novagen公司的 pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7，在大腸桿菌中能表達(dá)HOl。(4) 應(yīng)用基因工程方法將藻藍(lán)膽素生物合成基因之一的pcj^克隆于Novagen公司的 pETDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-; c/A在大腸桿菌中能表達(dá)PcyA。(5)將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，轉(zhuǎn)化方式如下從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3傳菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)過夜。取100nL飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mLLB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)至OD600 = 0.3 0.4時(shí)，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10min。離心lmin(10000g， 4。C)棄去上清，收集沉淀菌體。用lmL預(yù)冷的0.1mol/L CaC12無菌溶液重懸菌體,離心30s(10000g,4。C)去上清，菌體沉淀用100nL預(yù)冷的0.1mol/LCaC12重懸，放置于冰上，加入一定量的連接產(chǎn)物或構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻冰浴放置30min， 42。C熱休克90s，冰浴5min后加入300jaL LB培養(yǎng)基，37°C低速振蕩培養(yǎng)45min，無菌涂布在含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基平板上，倒置于37°C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個(gè)左右菌落，分別接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和；分別從中取100nL轉(zhuǎn)接至5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中。37°C振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5-0.7時(shí)，冰浴約30min,加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。避光，20度，150轉(zhuǎn)/分，表達(dá)約l-小時(shí)。離心收集細(xì)胞，細(xì)胞加入緩沖液重懸。通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌 株進(jìn)行大量表達(dá)。將pCDFDuet- aJr。W;7、 pCOLADuet-綦iTi歪^戲C1551) 、 pACYCDuet-力o7和 pETDuet- pc;^轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌，此工 程菌通過發(fā)酵能生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B(C1551)。按常規(guī)蛋 白質(zhì)提純技術(shù)，可提純得到相應(yīng)的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白 B(C1551)。實(shí)施例11:(1)采用基因工程方法，可以從GeneBank中査到。藻種力朋力ae朋sp. PCC7120和 5y"ec/ oc/Wj's sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測定完成?？盿6ae朋sp. PCC7120在GeneBank 中編號(hào)為BA000019， 5""ec力oc/s"s sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為BA000022， 可從全序列中找到所需基因；分/7ec力ocy"issp. PCC 6803中W/^似9基因克隆于Novagen 公司的pCDFDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet- Wri^必，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合 酶。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為 模版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn) 入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2)應(yīng)用基因工程方法將藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因藻WX^蛋^5克隆于Novagen 公司的表達(dá)載體pCOLADuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-漢^iT^"歪力萬，在大腸桿菌中能 表達(dá)脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B;即裂合酶alr0617或者slr2049在pCDFDuet中，處于第二 個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是Nde I禾B Xho I ;當(dāng)裂合酶和脫輔基蛋白同時(shí)在pCDFDuet時(shí)， 裂合酶在載體中的位置不變，只是在另外一個(gè)多克隆位點(diǎn)多了一個(gè)脫輔基蛋白基因。脫輔基蛋白cpcB在pET30中是在EcoRV和Xho I之間；當(dāng)脫輔基蛋白跟裂合酶同時(shí) 在pCDFDuet時(shí)，脫輔基蛋白在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，所用的酶切位點(diǎn)是EcoR I和Pst I 。PCB合成酶是2個(gè)基因(H01和PcyA)，當(dāng)他們在同一個(gè)載體的時(shí)候，hol處于第一個(gè) 多克隆位點(diǎn)，在NcoI和PstI之間，pcyA在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在NdeI和XhoI之間； 當(dāng)H01和PcyA不在同一個(gè)載體的時(shí)候，他們在相應(yīng)的載體中的位置也是同樣的酶切位點(diǎn)。(3) 應(yīng)用基因工程方法將藻藍(lán)膽素生物合成基因之一的力o7克隆于Novagen公司的 pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力o7，在大腸桿菌中能表達(dá)HOI。(4) 應(yīng)用基因工程方法將藻藍(lán)膽素生物合成基因之一的pc州克隆于Novagen公司的 pETDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-pc/A在大腸桿菌中能表達(dá)PcyA。(5)將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，轉(zhuǎn)化方式如下 從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基， 37。C振蕩培養(yǎng)過夜。取100pL飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mLLB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng) 至OD600=0.3 0.4時(shí)，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10min。離心lmin (10000g， 4。C)棄去上清，收集沉淀菌體。用lmL預(yù)冷的0.1mol/L CaC12無菌溶液重懸菌 體,離心30s(10000g， 4。C)去上清，菌體沉淀用100pL預(yù)冷的0.1mol/L CaC12重懸，放置于 冰上，加入一定量的連接產(chǎn)物或構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻冰浴放置30min， 42。C熱休克卯s， 冰浴5min后加入300pL LB培養(yǎng)基，37°C低速振蕩培養(yǎng)45min，無菌涂布在含有相應(yīng)抗 生素的LB培養(yǎng)基平板上，倒置于37°C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個(gè)左右菌落，分別接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和； 分別從中取100pL轉(zhuǎn)接至5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中。37°C振蕩培養(yǎng)至OD600= 0.5-0.7時(shí)，冰浴約30min，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。避光，20度，150轉(zhuǎn)/分，表達(dá)約l-小時(shí)。 離心收集細(xì)胞，細(xì)胞加入緩沖液重懸。通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌 株進(jìn)行大量表達(dá)。將pCDFDuet—57riY ^9、 pC0LADuet-^"iZ"^"歪々5、 pACYCDuet—力o7禾卩pETDuet-; c;^ 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌，此工程菌通過發(fā)酵能 生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，可提純 得到相應(yīng)的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B。實(shí)施例12:(1)采用基因工程方法，可以從GeneBank中查到。藻種^s6ae朋sp. PCC7120和 分/7ec/ ocj^z^'s sp. PCC 6803的全序列已經(jīng)測定完成。v^a6ae朋sp. PCC7120在GeneBank 中編號(hào)為BA000019， 5ynec/ oc/"J's sp. PCC 6803在GeneBank中編號(hào)為BA000022， 可從全序列中找到所需基因；6y/ ec力ocj^"'ssp. PCC6803中sZr^似9基因克隆于Novagen 公司的pCDFDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCDFDuet- WriY 必，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合 酶。根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)了引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為 模版，通過PCR擴(kuò)增得到所需片段。通過上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn) 入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。(2)應(yīng)用基因工程方法將藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因藻^T^"歪A MC155I)克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pC0LADuet-1中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-漢"iT^歪^5(C1551)，在大腸桿菌中能表達(dá)脫輔基蛋白藻紅藍(lán)蛋白B(C1551);即裂合酶alr0617或者slr2049在pCDFDuet中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)是Nde I和Xho I ;當(dāng)裂合酶和脫輔基
蛋白同時(shí)在pCDFDuet時(shí)，裂合酶在載體中的位置不變，只是在另外一個(gè)多克隆位點(diǎn)多了 一個(gè)脫輔基蛋白基因。脫輔基蛋白cpcB在pET30中是在EcoRV和Xho I之間；當(dāng)脫輔基蛋白跟裂合酶同時(shí) 在pCDFDuet時(shí)，脫輔基蛋白在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)，所用的酶切位點(diǎn)是EcoRl和PstI。PCB合成酶是2個(gè)基因(HOI和PcyA)，當(dāng)他們在同一個(gè)載體的時(shí)候，hol處于第一個(gè) 多克隆位點(diǎn)，在NcoI和PstI之間，pcyA在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)，在NdeI和XhoI之間； 當(dāng)H01和PcyA不在同一個(gè)載體的時(shí)候，他們在相應(yīng)的載體中的位置也是同樣的酶切位點(diǎn)。(3) 應(yīng)用基因工程方法將藻藍(lán)膽素生物合成基因之一的力o7克隆于Novagen公司的 pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-力W，在大腸桿菌中能表達(dá)HOl。(4) 應(yīng)用基因工程方法將藻藍(lán)膽素生物合成基因之一的克隆于Novagen公司的 pETDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-pc^，在大腸桿菌中能表達(dá)PcyA。(5)將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，轉(zhuǎn)化方式如下 從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基， 37。C振蕩培養(yǎng)過夜。取100pL飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mLLB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng) 至OD600 = 0.3 0.4時(shí)，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10min。離心lmin (10000g， 4。C)棄去上清，收集沉淀菌體。用lmL預(yù)冷的0.1mol/L CaC12無菌溶液重懸菌 體，離心30s(10000g,4。C)去上清，菌體沉淀用100pL預(yù)冷的0.1mol/LCaC12重懸，放置于 冰上，加入一定量的連接產(chǎn)物或構(gòu)建好的質(zhì)粒，混勻冰浴放置30min， 42。C熱休克90s， 冰浴5min后加入300|iL LB培養(yǎng)基，37°C低速振蕩培養(yǎng)45min，無菌涂布在含有相應(yīng)抗 生素的LB培養(yǎng)基平板上，倒置于37°C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。提取3個(gè)左右菌落，分別接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和 分別從中取100pL轉(zhuǎn)接至5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中。37°C振蕩培養(yǎng)至OD600-0.5-0.7時(shí)，冰浴約30min，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。避光，20度，150轉(zhuǎn)/分，表達(dá)約l-小時(shí)。 離心收集細(xì)胞，細(xì)胞加入緩沖液重懸。通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌 株進(jìn)行大量表達(dá)。將pCDFDuet-W/^ 必、pCOLADuet-麥iri歪A 5(t75"5""、 pACYCDuet-力o7和 pETDuet-pcj^轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌，此工 程菌通過發(fā)酵能生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白B(C1551)。按常規(guī)蛋 白質(zhì)提純技術(shù)，可提純得到相應(yīng)的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻藍(lán)膽素-藻紅藍(lán)蛋白 B(C1551)。上述制備方法適用于采用各種藍(lán)藻中的beta裂合酶、藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白和藻
藍(lán)膽素生物合成酶基因或其同源基因來制備藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，但涉及到微生物菌 種公開的問題，本發(fā)明只選用了 GenBank中己公開的藍(lán)藻如a6ae朋sp. PCC7120和 6y/ ec力ocj^"s sp. PCC 6803為例對本發(fā)明方法加以說明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù) 上述公開的內(nèi)容采用其它原料實(shí)施本發(fā)明。
權(quán)利要求
1. 一種藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于，它包括(1) 采用基因工程方法，將beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表達(dá)載體中，得到 beta裂合酶表達(dá)質(zhì)粒；應(yīng)用基因工程方法將藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因 克隆于第二個(gè)表達(dá)載體中，得到脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；應(yīng)用基因工程方法將藻藍(lán)膽素生物 合成酶基因(力W和；x^4)或其同源基因克隆于第三個(gè)和(或)第四個(gè)表達(dá)載體中，得到 藻藍(lán)膽素合成質(zhì)粒。(2) 將beta裂合酶表達(dá)質(zhì)粒、脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、藻藍(lán)膽素生物合成酶質(zhì)粒依次 轉(zhuǎn)入配套的宿主菌；當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌，應(yīng)用此工程菌 通過發(fā)酵工程能生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，可提純 得到相應(yīng)的藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于應(yīng)用beta裂合酶催化藻膽色素與藻紅 藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白進(jìn)行共價(jià)結(jié)合而制備藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的方法，其特征在于將beta裂合酶表達(dá)質(zhì)粒、脫輔基 蛋白表達(dá)質(zhì)粒、藻藍(lán)膽素生物合成酶質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌。當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入 宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌，應(yīng)用此工程菌通過發(fā)酵工程能生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白 質(zhì)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于beta裂合酶基因是指與^7^朋朋 sp. PCC7120中a&M77基因或5>/ ec/ oc/"j's sp. PCC 6803中sZr^似^基因同源的基 因。藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因是指與j朋6ae/7asp. PCC7120或分/7ec力oc^"ssp. PCC 6803中藻^"_#"_^^^同源的基因。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于beta裂合酶基因是指與^7a6ae/^sp. PCC7120中aZrt W7基因或分/jec/ ocy"j's sp. PCC 6803中Wr^^9基因同源的基因。 藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白基因是指與^7a&e朋sp. PCC7120或5y/7ec/ oc_KS"s sp. PCC 6803中^"it^歪^5同源的基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，通過應(yīng)用藻膽蛋白beta裂合酶催化藻藍(lán)膽素與藻紅藍(lán)蛋白類脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合，制備藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)。本發(fā)明的方法應(yīng)用生物過程生產(chǎn)藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)，是一種環(huán)境友好的生產(chǎn)方法。藻紅藍(lán)蛋白類熒光蛋白質(zhì)能應(yīng)用于食品、保健與醫(yī)藥功能材料領(lǐng)域，特別是應(yīng)用為生物和醫(yī)學(xué)分子監(jiān)測領(lǐng)域的熒光探針。
文檔編號(hào)C12N15/52GK101121931SQ200710029120
公開日2008年2月13日 申請日期2007年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月11日
發(fā)明者佟順剛, 坤 夏 申請人:廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司