專利名稱：：一種檢測(cè)wt1和mdr1基因異常表達(dá)的多重定量pcr試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于診斷疾病的試劑盒，具體是用于診斷白血病的試劑盒，特別是利用熒光定量PCR診斷白血病的試劑盒。
背景技術(shù)：
：難治復(fù)發(fā)是導(dǎo)致急性白血病治療失敗的根本原因，目前研究發(fā)現(xiàn)某些基因和急性白血病的難治復(fù)發(fā)存在密切關(guān)系，其中最主要的有人類多藥耐藥基因MDR1基因和Wilm's瘤I型(WT1)基因，MDR1基因所編碼的P糖蛋白(P-gp)可將白血病細(xì)胞內(nèi)藥物泵至細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積，導(dǎo)致化學(xué)治療的效果下降乃至消失。WT1基因是一種抑癌基因，定位于llpl3，所編碼的鋅指蛋白是序列特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，具有轉(zhuǎn)錄抑制和轉(zhuǎn)錄激活的雙重作用，研究發(fā)現(xiàn)MDR1，WT1基因的異常表達(dá)均與難治復(fù)發(fā)白血病有關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因表達(dá)水平有明顯的相關(guān)性，且與臨床預(yù)后有關(guān)，目前關(guān)于WT1和MDR1異常表達(dá)與難治復(fù)發(fā)急性白血病關(guān)系的研究已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前國內(nèi)外研究一般是對(duì)WT1和MDR1基因進(jìn)行單獨(dú)檢測(cè)，并沒有建立對(duì)WT1和MDR1基因同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)的體系方法。國內(nèi)有研究者用PCR分別擴(kuò)增WT1和MDR1基因，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行半定量分析，研究兩種不同的基因在白血病臨床耐藥中的作用及相互關(guān)系，GalimbertiS等人應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR分別檢測(cè)50例AML患者WT1和MDR1基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)WT1和MDR1基因在表達(dá)水平上明顯相關(guān)。但是，這些檢測(cè)方法都是存下述缺陷(O國內(nèi)多使用半定量的方法檢測(cè)WT1和MDR1基因，不能準(zhǔn)確地對(duì)這兩個(gè)基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量，判斷陽性、陰性帶有一定的主觀性；(2)國外應(yīng)用T叫man探針法分別檢測(cè)WT1和MDR1基因，雖能準(zhǔn)確地對(duì)兩者的表達(dá)水平進(jìn)行定量，但是不同反應(yīng)體系中不同干擾因素對(duì)MDR1和WT1基因擴(kuò)增效率有不同的影響；(3)不同反應(yīng)管存在加樣誤差而導(dǎo)致對(duì)同一樣本MDR1和WT1基因定量結(jié)果受到影響。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可同管檢測(cè)WT1和MDR1基因異常表達(dá)的多重定量PCR試劑盒，該試劑盒具有試劑用量少，大大地節(jié)約了成本，縮短檢測(cè)時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是一種檢測(cè)WT1和MDR1基因異常表達(dá)的多重定量PCR試劑盒，該試劑盒由定量PCR緩沖液，DNA聚合酶，標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)WT1基因的弓I物和探針，檢測(cè)MDR1基因的引物和探針組成，其特征在于(1)標(biāo)準(zhǔn)品是重組pMD18載體，其中的外源基因是WT1基因和MDR1基因；(2)檢測(cè)WT1基因的引物和探針的核苷酸序列分別是WT1-F:5-CCCAGGCTGCAATAAGAGATATTT-3(SEQNO.1)，WT1-R:5國GTGTGCTTCCTGCTGTGCAT-3(SEQNO.2),WTl-探針5-AAGCTGTCCCACTTA陽3(SEQN0.3);(3)檢測(cè)MDR1基因的引物和探針的核苷酸序列分別是MDR1-F:5-CAAGATCCTCCTGCTGGATGA-3(SECN0.4)，MDR1-R:5-GAACCACTGCTTCGCTTTCTG-3(SEQNO.5),MDRl-探針5-ACGTCAGCCTTGGAC陽3(SEQN0.6)。上述檢測(cè)WT1基因的探針和檢測(cè)MDR1基因的探針分別標(biāo)記有不同的標(biāo)記物，這些標(biāo)記物可以是VIC、FAM等；定量PCR緩沖液為常用的或商業(yè)化的定量PCRbuffer,如PCRbuffer(5X)，其成分為10mMTris陽HCl(pH8.0)，50mMKC1，2mMMgCl2,。本發(fā)明所述的標(biāo)準(zhǔn)品的可由以下方法制備得到用RT-PCR法從K562細(xì)胞的總RNA中逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增WT1和MDR1的cDNA;通過BamHI，BglII酶切后連接成WT1+MDR1重組片斷，并對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后將其與pMD18載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化宿主菌DH-5a，然后提取重組質(zhì)粒DNA,即可。本發(fā)明試劑盒檢測(cè)白血病患者WT1和MDR1基因異常表達(dá)是通過多重?zé)晒鈱?shí)時(shí)定量PCR實(shí)現(xiàn)的，即WT1基因和MDR1基因的擴(kuò)增是在同一反應(yīng)管中進(jìn)行，檢測(cè)過程如下(1)PCR的反應(yīng)體系的總體積最好為50nl，其中定量PCRbuffer(5X)10nl，WT1-F(10^M)lnl，WT1-R(lOnM)lnl,WT1-探針(10jxM)lpl，MDRl-F(10nM)lpl,MDR卜R(10^M)1^1,MDR1-探針(10mM)lnl，Taq酶(2U/pl)2^1,模板5pl，加水補(bǔ)足至50nl。PCR的反應(yīng)程序是93'C熱啟動(dòng)3min，再按以下的過程循環(huán)40次93'C變性45s,然后降溫至55'C退火45s。上述PCR的反應(yīng)程序也可采用本領(lǐng)域常見的方法表達(dá)如下93°C3min93。C45s，卜40個(gè)循環(huán)。55。C45s」(2)本發(fā)明試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立把質(zhì)粒按108，107，106,105,104,103,102，10'個(gè)拷貝進(jìn)行倍比稀釋作為PCR反應(yīng)的模板按(1)進(jìn)行多重?zé)晒鈱?shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算機(jī)自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=aX+b，R2，其中Y表示起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，X表示C(t)值。(3)本發(fā)明試劑盒檢測(cè)白血病患者WT1和MDR1基因異常表達(dá)的方法是取患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞，提取總RNA,然后合成cDNA,以cDNA為反應(yīng)模板按(1)進(jìn)行多重?zé)晒鈱?shí)時(shí)定量PCR。(4)結(jié)果判斷當(dāng)檢測(cè)樣品來自于白血病患者，則能擴(kuò)增出WT1和MDR1基因，WT1和MDR1基因的表達(dá)量可通過將C(t)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算；當(dāng)檢測(cè)樣本來自于正常人，則不能擴(kuò)增出WT1和MDR1基因。本發(fā)明試劑盒采用多重?zé)晒鈱?shí)時(shí)定量PCR對(duì)白血病患者WT1和MDR1基因異常表達(dá)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管與待測(cè)基因的反應(yīng)條件相同，消除了不同反應(yīng)體系中不同干擾因素對(duì)MDR1和WT1基因擴(kuò)增效率的不同影響；(2)避免由于不同反應(yīng)管存在加樣誤差而導(dǎo)致對(duì)同一樣本MDR1和WT1基因定量結(jié)果的影響；(3)用本發(fā)明設(shè)計(jì)的的內(nèi)引物對(duì)MDR1和WT1基因進(jìn)行擴(kuò)增，使擴(kuò)增片段縮短，減少應(yīng)用兩對(duì)相鄰引物時(shí)的空間位阻效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)兩個(gè)基因的同管擴(kuò)增，并使擴(kuò)增效率得到有效的提高；(4)同時(shí)檢測(cè)MDR1和WT1基因可了解基因之間表達(dá)變化的相互關(guān)系與難治復(fù)發(fā)白血病的關(guān)系；(5)如果采用兩種質(zhì)粒相互混合的方法構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品，難以做到準(zhǔn)確絕對(duì)定量，而采用MDR1+WT1重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品可做到準(zhǔn)確絕對(duì)定量；(6)構(gòu)建MDR1+WT1重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品可實(shí)現(xiàn)同管檢測(cè)同一樣本中MDR1和WT1基因的拷貝數(shù)，比分管檢測(cè)要準(zhǔn)確，而且還具有省時(shí)，省力，減低成本。圖1是PCR擴(kuò)增mdrl基因的電泳圖，其中，M:標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量(250bpladder);1，2:MDR1PCR產(chǎn)物。圖2是PCR擴(kuò)增WT1基因的電泳圖，其中，M:標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量(250bpladder);1~3:WT1PCR產(chǎn)物。圖3是EcoRl酶切重組質(zhì)粒的電泳圖，其中，M-標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量(250bpladder);1-小量提取質(zhì)粒電泳；2-酶切鑒定；3-WT1+MDR1PCR;4-WTlPCR產(chǎn)物；5-MDRlPCR產(chǎn)物；圖4是不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的定量PCR擴(kuò)增曲線圖，其中1為1()S拷貝/ml標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，2為107拷貝/ml標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，3為106拷貝/1!11，4為1()S拷貝/ml標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線；5為104拷貝/1111標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，6為103拷貝加1標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，7為1(^拷貝/ml標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，8為10i拷貝/ml標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線。圖5是不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的定量PCR擴(kuò)增MDR1基因曲線圖，其中1為108拷貝/1111標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，2為107拷貝/1111標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，3為106拷貝/!!11，4為1(^拷貝/ml標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線；5為104拷貝/ml標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，6為1(^拷貝/ml標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，7為102拷貝/1111標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，8為10'拷貝/ml標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線。圖6是使用本發(fā)明試劑盒擴(kuò)增WT1基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖7是使用本發(fā)明試劑盒擴(kuò)增MDR1基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖8是本發(fā)明試劑盒檢測(cè)白血病患者骨髓細(xì)胞樣品的擴(kuò)增曲線圖，其中實(shí)線表示W(wǎng)T1基因擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線，虛線表示MDR1基因擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實(shí)施方式制備例本發(fā)明試劑盒的組成Mastermix(2X)，標(biāo)準(zhǔn)品，引物WT1-F、WT1-R、MDR1-F和MDR1-R，探針WTl-probe-VIC和MDRl-probe-FAM。其中，WT1-F:5-CCCAGGCTGCAATAAGAGATATTT-3(SEQNO.l)，WT1-R:5陽GTGTGCTTCCTGCTGTGCAT-3(SEQN0.2),MDR1-F:5-CAAGATCCTCCTGCTGGATGA-3(SEQN0.3)，MDR1-R:5-GAACCACTGCTTCGCTTTCTG-3(SEQN0.4),WTl-probe-VIC:5-AAGCTGTCCCACTTA-3(SEQN0.5)，MDRl-probe-FAM:5陽ACGTCAGCCTTGGAC國3(SEQN0.6);標(biāo)準(zhǔn)品為含有含有WT1基因和MDR1基因的重組pMD18載體，其制備方法為1、3Xl()6K562細(xì)胞加TRIZo1(Invitrogen公司)1mL，混勻，轉(zhuǎn)置于1.5mLEppendorf管，15-30'C孵育5min，加入氯仿0.2ml,蓋緊蓋子，用力搖動(dòng)15s，15-30'C孵育2-3min，4°C12000r/min離心15min，取上清液至新的1.5mlEppendorf管，加與上清液等體積的異丙醇，15-30'C孵育樣品10min，4°C12000r/min離心10min，棄上清液，75%乙醇(DEPC處理水配制)洗漆沉淀一次(至少lml75。/。乙醇/mlTRIzol)，4°C7500r/min離心5min，棄乙醇，空氣或真空干燥5-10min(不要完全干燥)，加DEPC處理水溶解RNA，-S(rC保存?zhèn)溆?。樣品在紫外分光光度?jì)上測(cè)定波長為260nm時(shí)的吸光度值。濃度計(jì)算公式濃度(g/L)=0026(^稀釋倍數(shù)乂40/10002、隨機(jī)六聚體法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)從K562細(xì)胞的總RNA中逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系如下5X逆轉(zhuǎn)錄buffer4wl隨機(jī)六聚體2uldNTPs(25mM)0.8u1醒LV(10U/wl)lulDEPC水10u1RNA模板4u1總體積20ul逆轉(zhuǎn)錄buffer成分50mMTris-HCl(pH8.0),50mMKC1，4mMMgCl2，10mMDTT反應(yīng)條件37'Clh，然后95°C3分鐘。3、PCR擴(kuò)增WT1基因(引物為SEQNO.l，2)和MDR1基因片段(引物為SEQNO.4，5),PCR的反應(yīng)條件取上述cDNA2nl，用引物分別擴(kuò)增WT1和MDR1。PCR反應(yīng)體系5X緩沖液,上、下游引物2pldNTP(薩m)4plTaq酶0.5nlcDNA2nl總體積50jil.用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以cDNA為模板，WTl禾nMDRl的上下游引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增應(yīng)分別得到297bp，300bp長的目的片段，經(jīng)15g/L瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示擴(kuò)增出的目的片段大小與預(yù)期值相符合，如圖1、2所示。4、通過BamHI,BglII分別酶切WT1、MDR1片斷[酶切反應(yīng)條件反應(yīng)緩沖液100mMNaCl，50mMTris陽HCl，10mMMgC12，1mMDTT(pH7.925°C)，37°C溫育l小時(shí)]，純化后通過T4連接酶連接[連接條件反應(yīng)緩沖液300mMTris-HCl(pH7.825。C)，100mMMgCl2,100mMDTT，10mMATP，37°C溫育l小時(shí)]，利用上述連接產(chǎn)物為模板，通過WT1上游引物與MDRl下游引物(SEQNO.l、4)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)15g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收試劑盒回收、備用。5、20ul連接反應(yīng)液含pMD18-T載體lnl、步驟4所得的連接產(chǎn)物9jxl、連接液10^1，于22'C反應(yīng)30分鐘，所得重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)(IOO涂布在含有X-Gal、IPTG、氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上，倒置37'C培養(yǎng)1216小時(shí)，篩選白斑菌落進(jìn)一步擴(kuò)增，抽提質(zhì)粒。并對(duì)其進(jìn)行純化后將其與pMD18載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化宿主菌DH-5a，然后提取重組質(zhì)粒DNA。6、重組質(zhì)粒DNA的鑒定①將步驟5得到的重組質(zhì)粒DNA，分別用引物SEQ.NOl和2,SEQ.N04和5以及SEQ.NOl和5擴(kuò)增WT1，MDR1，WT1+MDR1片段，擴(kuò)增后進(jìn)行15g/L瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示擴(kuò)增出的目的片段大小與預(yù)期值相符合。以EcoRl酶切(50mMNaCl，100mMTris-HCl，10mMMgCl2，0.025%TritonX-100(pH7.525。C)。37。C溫育l小時(shí))重組質(zhì)粒DNA,經(jīng)15g/L瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示與預(yù)期值相符合(圖3)。效果例下述實(shí)驗(yàn)均采用制備例所述的試劑盒進(jìn)行。1、本發(fā)明試劑盒檢測(cè)AML患者骨髓中的WT1基因和MDRl基因。(1)取患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞，提取總RNA，RT-PCR法合成cDNA，作為熒光實(shí)時(shí)定量PCR的模版，熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系為5X定量buffer10ulWT1上游引物F:SEQNO.l(lOpmol/ul)1UlWT1下游引物R:SEQN0.2(10pmol/yl)1UlMDR1上游引物F:SEQNO.4(10pmol/"1)lulMDRl下游引物R:SEQNO.5(lOpmol/ul)lulWT1探針SEQNO.31wlMDRl探針SEQNO.6luldNTPs(10mM)1ulTaq酶(2U/ul)2nlcDNA5U1ddH2026ul總體積50ul其中，PCRbuffer成分10mMTris-HCl(pH8.0),50mMKC1，2mMMgCl2。PCR的反應(yīng)程序如下93'C3min93°C45s，卜40個(gè)循環(huán)。55。C45s」定量PCR在美國Bio-rad公司生產(chǎn)的iCyclerIq熱循環(huán)儀中完成，結(jié)果采用OpticonMonitor3.0軟件進(jìn)行分析。(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:把質(zhì)粒按108，107，106，105,104,103，102，IO'個(gè)拷貝進(jìn)行倍比稀釋作為PCR反應(yīng)的模板按上述條件進(jìn)行多重實(shí)時(shí)定量PCR,反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算機(jī)自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR結(jié)果如圖47所示,WT1基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-0.3627X+10.52，R2=0.998，MDR1基因的標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=-0.3831X+10.85，R2=0.997，其中Y表示起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，X表示C(t)值。樣本的檢測(cè)取患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞，提取總RNA，然后合成cDNA，以cDNA為反應(yīng)模板按上述條件進(jìn)行多重?zé)晒鈱?shí)時(shí)定量PCR,其中一個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果如圖7所示。2、對(duì)WT1和MDR1基因進(jìn)行單獨(dú)熒光定量PCR檢測(cè)(傳統(tǒng)方法)(1)取患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞，提取總RNA，RT-PCR法合成cDNA,作為熒光實(shí)時(shí)定量PCR的模版，熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系為WT1基因檢測(cè)5X定量buffer10ulWT1上游引物F:SEQNO.l(10pmol/nl)lulWT1下游引物R:SEQNO.2(10pmol/ul)lulWTl探針SEQNO.3lwldNTPs(10mM)1ulTaq酶(2U/ul)2nlcDNA5U1ddH2029P1總體積50HlMDR1基因檢測(cè)5X定量buffer10iUWT1上游引物F:SEQNO.l(10pmol/iU)lulWT1下游引物R:SEQN0.2(10pmol/ul)lulWTl探針SEQN0.31U1dNTPs(10mM)1ulTaq酶(2U/ul)2iUcDNA5U1ddH2029yl總體積50lUPCR的反應(yīng)程序如下93°C3min93。C45s，卜40個(gè)循環(huán)。55。C45s」定量PCR在美國Bio-rad公司生產(chǎn)的iCyclerIq熱循環(huán)儀中完成，結(jié)果采用OpticonMonitor3.0軟件進(jìn)行分析。(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立把質(zhì)粒進(jìn)行倍比稀釋作為PCR反應(yīng)的模板按上述條件進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算機(jī)自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣本的檢測(cè)取患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞，提取總RNA,然后合成CDNA，以cDNA為反應(yīng)模板按上述條件分別對(duì)WTl和MDR1基因進(jìn)行單獨(dú)熒光定量PCR檢測(cè)。3、對(duì)比結(jié)果通過熒光定量PCR單獨(dú)檢測(cè)63例初治AML患者WTl和MDR1基因，及通過多重?zé)晒舛縋CR同時(shí)檢測(cè)63例初治AML患者WTl和MDR1基因，其中一部分檢測(cè)結(jié)果如表1所示，通過兩種方法所檢測(cè)同一標(biāo)本W(wǎng)Tl和MDR1基因的拷貝數(shù)基本一致，但通過本試劑盒多重?zé)晒鈱?shí)時(shí)定量PCR同時(shí)檢測(cè)WTl和MDR1基因的方法，相對(duì)于熒光定量PCR單獨(dú)檢測(cè)WTl和MDR1基因的方法，此試劑盒更加簡(jiǎn)便，節(jié)約大量時(shí)間和試劑。表1兩種方法檢測(cè)MDR1和WT1mRNA的結(jié)果(拷貝數(shù)/ugRNA)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>說明WTl—old表示用傳統(tǒng)方法檢測(cè)WTl基因的拷貝數(shù)，WTl—new表示W(wǎng)Tl—old表示用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)WTl基因的拷貝數(shù)，MDRl—old表示用傳統(tǒng)方法檢測(cè)MDRl基因的拷貝數(shù)，MDRl—new表示用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)MDRl基因的拷貝數(shù)。SEQUENCELISTING<110>南方醫(yī)科大學(xué)<120>—種檢測(cè)WTl和MDRl基因異常表達(dá)的多重定量PCR試劑盒<160>6<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>1cccaggctgcaataagagatattt24<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列'<400>2*gtgtgcttcctgctgtgcat20<210;3<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>3aagctgtcccactta<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4caagatcctcctgctggatga<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>5gaaccactgcttcgctttctg<210>6<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>6acgtcagccttggac1521211權(quán)利要求1、一種檢測(cè)WT1和MDR1基因異常表達(dá)的多重定量PCR試劑盒，該試劑盒由定量PCR緩沖液，DNA聚合酶，標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)WT1基因的引物和探針，檢測(cè)MDR1基因的引物和探針組成，其特征在于(1)標(biāo)準(zhǔn)品是重組pMD18載體，其中的外源基因是WT1基因和MDR1基因；(2)檢測(cè)WT1基因的引物和探針的核苷酸序列是WT1-F5-CCCAGGCTGCAATAAGAGATATTT-3，WT1-R5-GTGTGCTTCCTGCTGTGCAT-3，WT1-探針5-AAGCTGTCCCACTTA-3；(3)檢測(cè)MDR1基因的引物和探針的核苷酸序列是MDR1-F5-CAAGATCCTCCTGCTGGATGA-3，MDR1-R5-GAACCACTGCTTCGCTTTCTG-3，MDR1-探針5-ACGTCAGCCTTGGAC-3。2、一種使用權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測(cè)WT1和MDR1基因異常表達(dá)的方法，其特征在于將WT1基因和MDR1基因在同一反應(yīng)管中反應(yīng)，反應(yīng)的程序是93'C熱啟動(dòng)3min，再按以下的過程循環(huán)40次93'C變性45s，然后降溫至55'C退火45s。全文摘要一種檢測(cè)WT1和MDR1基因異常表達(dá)的多重定量PCR試劑盒，該試劑盒由定量PCR緩沖液，DNA聚合酶，標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)WT1基因的引物和探針，檢測(cè)MDR1基因的引物和探針組成，其中標(biāo)準(zhǔn)品是重組pMD18載體，該重組載體的外源基因是WT1基因和MDR1基因；檢測(cè)WT1基因的上游引物是SEQNO.1，下游引物是SEQNO.2，探針的核苷酸序列是SEQNO.3；檢測(cè)MDR1基因的上游引物是SEQNO.4，下游引物是SEQNO.5，探針的核苷酸序列分別是SEQNO.6。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101182570SQ20071003140公開日2008年5月21日申請(qǐng)日期2007年11月15日優(yōu)先權(quán)日2007年11月15日發(fā)明者宋小燕,兵徐申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)