專利名稱：：唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因及其真核表達(dá)載體與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因、含有該基因的重組表達(dá)載體、用該載體轉(zhuǎn)化的唐魚(yú)以及對(duì)該轉(zhuǎn)基因唐魚(yú)的外源基因檢測(cè)。
背景技術(shù)：
：轉(zhuǎn)基因魚(yú)是目前國(guó)內(nèi)外獲得最成功的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物之一。轉(zhuǎn)基因魚(yú)的構(gòu)建主要包括以下幾個(gè)方面l.目的基因的獲得；2.基因克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建；3.受體魚(yú)(受精卵)的獲得；4.注射基因。轉(zhuǎn)基因魚(yú)的應(yīng)用潛力l.快速育種。傳統(tǒng)的品種選育需經(jīng)過(guò)多代反復(fù)選種交配才能育成優(yōu)良品種。轉(zhuǎn)基因技術(shù)有可能在很短時(shí)間內(nèi)超越自然界億萬(wàn)年生物進(jìn)化歷程，創(chuàng)造自然界原來(lái)沒(méi)有的品種或品系，這是常規(guī)育種難以辦到的，故此引誘力極強(qiáng)。2.改良養(yǎng)殖性能，如加快受體魚(yú)的生長(zhǎng)、提高餌料利用率及抗逆性等。不少實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因魚(yú)生長(zhǎng)速度可提高11%-30%，即所謂"超級(jí)魚(yú)"。但這些結(jié)果多為實(shí)驗(yàn)室環(huán)境所得，尚待養(yǎng)殖生產(chǎn)環(huán)境的檢驗(yàn)。有的轉(zhuǎn)基因魚(yú)可提高餌料利用率，有的則表現(xiàn)出耐寒或耐熱、耐低鹽度或高鹽度、耐高濃度重金屬、耐污染物以及乃缺氧等，產(chǎn)生抗逆性較強(qiáng)的魚(yú)。3.生產(chǎn)醫(yī)藥生物制品。通過(guò)轉(zhuǎn)基因魚(yú)生產(chǎn)生物活性物質(zhì)以滿足醫(yī)藥需要，生產(chǎn)對(duì)外來(lái)物質(zhì)成陽(yáng)性的反應(yīng)器的魚(yú)以滿足醫(yī)療的需要，研制攜帶人類胰島素的轉(zhuǎn)基因魚(yú)以提供胰島素的研究也開(kāi)始引起了人們的重視。唐魚(yú)(ram'c/^/^a仿om/^s)屬鯉形目、鯉科、唐魚(yú)屬。它體形細(xì)小，長(zhǎng)而側(cè)扁。體高約等于頭長(zhǎng)，腹部圓、吻鈍而短，口上位.口裂向下傾斜，幾乎與體鈾垂直。上頜長(zhǎng)于下頜，前端無(wú)突起?？跓o(wú)須，眼大，側(cè)上位。背鰭短，起點(diǎn)顯著在腹鰭起點(diǎn)之后，胸縮短，末端不達(dá)腹部起點(diǎn)，腹縮末端可達(dá)肛門(mén)，肛門(mén)緊靠臀鰭起點(diǎn)。臀鰭較長(zhǎng)，約與背鰭相對(duì)。尾鰭叉形，末端尖，上下葉約等長(zhǎng)。體被中等大小圓鱗，體側(cè)鱗片上無(wú)側(cè)線。體側(cè)顏色鮮艷，體側(cè)從鰓孔上角至尾柄基部有一條金黃色的條紋.條紋上下各有幾條黑色線條。尾柄基部有一紅色大圓斑，背鰭和尾鰭基部有許多紅色小斑點(diǎn)。背鰭和臀鰭呈黃綠色，邊緣透明。唐魚(yú)分布在廣東省廣州附近的小山溪中，具有很高的觀賞價(jià)值。唐魚(yú)現(xiàn)已列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物。唐魚(yú)是對(duì)生存環(huán)境要求極高的魚(yú)種，可成為測(cè)定環(huán)境品質(zhì)的"指標(biāo)魚(yú)"，是用生物方法監(jiān)測(cè)環(huán)境水質(zhì)污染的一個(gè)極好的魚(yú)類生物標(biāo)記物，所以對(duì)它的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究，對(duì)環(huán)境資源和生物資源的保護(hù)，具有極大的科學(xué)意義。轉(zhuǎn)基因魚(yú)具有表達(dá)量高、世代周期短、成本低、不帶哺乳類病毒等優(yōu)點(diǎn)，且作為生物反應(yīng)器更易被接受，因此通過(guò)轉(zhuǎn)基因獲得較大體型、生長(zhǎng)快的轉(zhuǎn)基因唐魚(yú)，及該轉(zhuǎn)基因體系方法的建立對(duì)后續(xù)的研究(如培育可生產(chǎn)重要的蛋白的轉(zhuǎn)基因魚(yú)等)具有重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因。本發(fā)明的另一目的在于提供包含上述唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的另一目的在于提供包含上述唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因的基因工程菌。本發(fā)明的進(jìn)一歩目的在于提供上述唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因在促進(jìn)魚(yú)類生長(zhǎng)中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明根據(jù)GENBANK上已登陸的魚(yú)類生長(zhǎng)激素基因cDNA序列，在同源保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物(pl和p2)，然后提取唐魚(yú)總RNA，以總RNA為模板，Pl和P2為引物，RT-PCR得到唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因開(kāi)放閱讀框(ORF)，再根據(jù)該ORF設(shè)計(jì)引物，以唐魚(yú)總RNA為模板，分別進(jìn)行5'RACE和3'RACE，擴(kuò)增得到5'末端序列和3'末端序列，然后將5'和3'端序列及核心序列ORF用Vector軟件拼接獲得了唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因的cDNA序列，全長(zhǎng)1145bp。本發(fā)明根據(jù)唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因ORF設(shè)計(jì)一對(duì)引物P6和P7，再以唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因ORF為模板，用引物P6和P7進(jìn)行PCR改造，然后將PCR產(chǎn)物雙酶切純化；同時(shí)雙酶切轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pTLA-DsRed，并回收含有啟動(dòng)子的載體；T4連接酶按照摩爾數(shù)比1:3，連接酶切純化后的唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因ORF和含有啟動(dòng)子的載體。本發(fā)明將上述T4連接酶得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后通過(guò)菌落PCR，并提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切初步篩選重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒測(cè)序列證實(shí)，重組轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體構(gòu)建正確，命名為pTLA-GH。本發(fā)明將轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pTLA-GH酶切使其線性化，純化后測(cè)定OD值，調(diào)整濃度，將pTLA-GH顯微注射到唐魚(yú)受精卵中。本發(fā)明根據(jù)轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pTLA-GH設(shè)計(jì)一對(duì)引物PP-SF和GP-SR;將實(shí)驗(yàn)魚(yú)與對(duì)照魚(yú)培育至0.4g左右后，剪取鰭條提取基因組DNA，用引物PP-SF和GP-SR進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)植基因，結(jié)果在兩尾個(gè)體最大的轉(zhuǎn)基因魚(yú)(1#和2#魚(yú))中檢測(cè)到轉(zhuǎn)植基因pTLA-GH;以Southernblot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)植基因pTLA-GH己整合到唐魚(yú)基因組上；以RT-PCR和Westernblotting方法檢測(cè)到轉(zhuǎn)植基因pTLA-GH在唐魚(yú)組織器官中的表達(dá)；同時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)組唐魚(yú)和對(duì)照組唐魚(yú)的表型變化，結(jié)果證實(shí)重組表達(dá)載體pTLA-GH已成功地轉(zhuǎn)化到唐魚(yú)體內(nèi)，并且在唐魚(yú)體內(nèi)發(fā)揮了生長(zhǎng)激素的促生長(zhǎng)生理功能。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果1、本發(fā)明從唐魚(yú)總RNA中獲得了唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因及編碼的氨基酸序列，這極大地?cái)U(kuò)充了轉(zhuǎn)基因魚(yú)類的基因庫(kù)；2、本發(fā)明將唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因連接到轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pTLA-DsRed上，構(gòu)建了新的重組表達(dá)載體pTLA-GH,并且成功在轉(zhuǎn)基因唐魚(yú)內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，該重組表達(dá)載體對(duì)改善其他魚(yú)類的生長(zhǎng)發(fā)育性狀具有極大的生物學(xué)和生物工程學(xué)意義。3、本發(fā)明得到的轉(zhuǎn)基因唐魚(yú)，生長(zhǎng)快、體型大，可以用于生物反應(yīng)器等其他生物學(xué)領(lǐng)域。圖1為轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pTLA-GH的構(gòu)建圖；圖2為轉(zhuǎn)基因唐魚(yú)PCR擴(kuò)增初步篩選結(jié)果；其中，1為MarkerIII;2為空白(ddH20);3為用于注射的DNApTLA-GH;415為實(shí)驗(yàn)唐魚(yú)，其中6是1#魚(yú)的鰭條，9和15是2#魚(yú)的肌肉和眼睛，其佘是其它實(shí)驗(yàn)魚(yú)的鰭條；1618，分別為對(duì)照唐魚(yú)的鰭條、肌肉、眼睛。圖3為轉(zhuǎn)基因唐魚(yú)基因組DNApTLA-GH基因的Southernblot雜交；其中，1為陽(yáng)性對(duì)照pTLA-GH;2為鰭條組織基因組DNA酶切產(chǎn)物。圖4為Westernblotting檢測(cè)生長(zhǎng)激素的表達(dá)情況的結(jié)果；其中，l為陽(yáng)性對(duì)照組(重組鯉魚(yú)GH);2為野生型唐魚(yú)；3為試驗(yàn)唐魚(yú)。具體實(shí)施方式實(shí)施例1唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因開(kāi)放閱讀框(ORF)的克隆1.引物設(shè)計(jì)參照GenBank中已登錄的鯉(Cyprz'ra'iwc^77k)、青魚(yú)woWfo)、團(tuán)頭魴(A/eg(3/oZ7ramaa附6fy，/ia/a)、泥鰍(Af/紹wrn^a/zgw/〃z'cat^/ato)等生長(zhǎng)激素基因cDNA序列在同源保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)一對(duì)引物(pl和p2)擴(kuò)增該基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)序列。Pl:5'-ATGGCTAGAGCATTRGTGC-3';P2:5'-CTACAGGGTGCAGTTTGAATCC-3'。2.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取出膜后5d幼體唐魚(yú)20尾，提取唐魚(yú)全魚(yú)的總RNA，具體步驟嚴(yán)格參照試劑盒SVTotalRNAIsolationSystem。提取的RNA用0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)，--20。C保存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄參照RNAPCRKit(AMV)Ver.3.0試劑盒的方法，以唐魚(yú)全魚(yú)總RNA為模板進(jìn)行第一鏈合成。反應(yīng)體系如表1所示表1.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系唐魚(yú)全魚(yú)總RNA1MgCl22jxLOligodT-AdaptorPrimer0，10XRTBuffer1&dNTPMixture1RNaseInhibitorAMVReverseTranscriptase0.5^RNaseFreedH203.754Total10反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為48°C30min;95°C5min;5°C5min。3.PCR擴(kuò)增以上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用pl、P2擴(kuò)增唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因開(kāi)放閱讀框(ORF)。PCR反應(yīng)體系如表2:表2.PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件反應(yīng)前先94'C變性3min，每個(gè)循環(huán)包括94卩變性30s，54'C復(fù)性30s，72'C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)。最后一次循環(huán)結(jié)束時(shí)72"C延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后取5pLPCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。4.PCR產(chǎn)物的T載體連接用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，其TaqDNAPolymerase擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物DNA雙鏈前后末端都有一個(gè)游離的A堿基，可以與pMD18-Tvector末端游離的T堿基互補(bǔ)形成環(huán)狀重組T質(zhì)粒。按T載體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行膠回收產(chǎn)物與pMD18-Tvector連接，體系如表3:表3.連接體系<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>反應(yīng)產(chǎn)物混勻后于16'C下連接2小時(shí)。5.重組菌的菌液PCR檢測(cè)將PCR產(chǎn)物與pMD18-TVector的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a菌株，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜。菌液PCR篩選轉(zhuǎn)化子用牙簽挑取菌落放入加有3mlLB液體培養(yǎng)基(含Amp)的離心管中，37'C培養(yǎng)10小時(shí)后進(jìn)行菌液PCR來(lái)挑選重組轉(zhuǎn)化子。PCR反應(yīng)體系如下表4:表4.PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件反應(yīng)前先94。C變性3min,每個(gè)循環(huán)包括9fC變性30s，57'C復(fù)性30s，72t:延伸30s，共30個(gè)循環(huán)。最后一次循環(huán)結(jié)束時(shí)72'C延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后取5PCR產(chǎn)物，1呢瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，12個(gè)重組菌落中有11個(gè)可以擴(kuò)增出633bp大小片段，初步判斷為陽(yáng)性克隆。6.酶切鑒定從菌液PCR結(jié)果中的11個(gè)陽(yáng)性克隆任意取一管菌液，參照E.Z.N.APlasmidMiniprepKit試劑盒說(shuō)明書(shū)中的操作方法提取重組質(zhì)粒。用￡coRI和A7n^HI進(jìn)行雙酶切質(zhì)粒DNA鑒定，酶切結(jié)果有預(yù)期兩條帶(2630bp和700bp)，確認(rèn)該重組質(zhì)粒插入了目的片段。將該重組質(zhì)粒的菌株送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，作進(jìn)一步的鑒定，防止插入片段發(fā)生變異或移碼現(xiàn)象。實(shí)施例2唐魚(yú)生長(zhǎng)激素全長(zhǎng)cDNA的克隆l.引物設(shè)計(jì)根據(jù)上述生長(zhǎng)激素基因ORF序列設(shè)計(jì)了一對(duì)下游引物(p3和p4)，上游引物使用SMARTRACEcDNAAmplificationkit的通用引物UPM和NUP。在已測(cè)得的生長(zhǎng)激素基因ORF序列上設(shè)計(jì)了一條上游引物(p5)，下游引物為T(mén)aKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0的通用引物Ml3PrimerM4。p3:5'-CAATGAGGCGGAAAGAGATG-3';p4:5'-GGTTGTCCTCAAAGTCGTTAATC-3'。p5:5'-GTCAACCAAACATGGACGACAATGAC-3';M13PrimerM4:5'-GTnTCCCAGTCACGAC-3';UPM:5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3';NUP:5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'。2.5、-RACE用p3和UPM進(jìn)行5'RACE擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)有預(yù)期帶出現(xiàn)，再以擴(kuò)增的產(chǎn)物為模板，以p4和NUP做套式擴(kuò)增后獲得單一的特異條帶，該片段回收測(cè)序，具體步驟如下采用BD公司的SMARTRACEcDNAAmplificationkit，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因cDNA5'RACE擴(kuò)增，方法如下a)5'-RACE-ReadycDNA的制備(1)分別在0.5ml離心管中加入以下溶液，溶液具體見(jiàn)表5:表5.所加入溶液RNA樣品35'-CDSPrimerl[iLSMARTIIAoligoTotal5|iL(2)每管加滅菌水至終體積為5^L，用槍頭混合均勻，低速離心至管底；(3)7(TC溫浴2分鐘，置冰上冷卻2分鐘，輕微離心，收集溶液于管底，并加入組分，具體見(jiàn)表6:表6.所加組分5xFirst-strandBuffer2jxLDTT(20mM)l^LdNTPMix(10mM)lpLPowerscriptreversetranscriptase1jjL(4)用槍頭輕輕混勻，輕微離心，收集溶液于管底；(5)42。C溫浴1.5小時(shí)，力卩1OOpLTricine-EDTABuffer稀釋First-strand反應(yīng)產(chǎn)物；(6)72r溫浴7分鐘，樣品保存于一2(TC冰箱備用。b)PCR擴(kuò)增以5'-RACE-ReadycDNA為模板，p3和試劑盒中的UPM為引物，按以下反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系見(jiàn)表7:表7.PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件反應(yīng)前先94'C變性3min，每個(gè)循環(huán)包括94'C變性30s，54匸復(fù)性30s，72'C延伸30s，共30個(gè)循環(huán)。最后一次循環(huán)結(jié)束時(shí)72'C延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后取5pLPCR產(chǎn)物，1免瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。然后以第一次PCR產(chǎn)物為模板，用引物p4和NUP進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系見(jiàn)表8:表8.PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件反應(yīng)前先94'C變性3min，每個(gè)循環(huán)包括94'C變性30s，54'C復(fù)性30s，72t:延伸30s，共30個(gè)循環(huán)。最后一次循環(huán)結(jié)束時(shí)72'C延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后取5pLPCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。c)PCR產(chǎn)物的T載體連接用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，其TaqDNAPolymerase擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物DNA雙鏈前后末端都有一個(gè)游離的A堿基，可以與pMD18-Tvector末端游離的T堿基互補(bǔ)形成環(huán)狀重組T質(zhì)粒。按T載體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行膠回收產(chǎn)物與pMD18-Tvector連接，體系如表9:表9.連接體系LigationSolution2.5|iL線性化T載體膠回收產(chǎn)物2(jLTotal5(jL反應(yīng)產(chǎn)物混勻后于16'C下連接2小時(shí)。d)重組菌的菌液PCR檢測(cè)將PCR產(chǎn)物與pMD18-TVector的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a菌株，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜。菌液PCR篩選轉(zhuǎn)化子用牙簽挑取菌落放入加有3mlLB液體培養(yǎng)基(含Amp)的離心管中，37。C培養(yǎng)10小時(shí)后進(jìn)行菌液PCR來(lái)挑選重組轉(zhuǎn)化子。PCR反應(yīng)體系如下表10:表10.PCR反應(yīng)體系ddH2016.55(iL1OxPCRBuffer(plusMgCl2)2dNTPMixture0.4pL7h^0.15)jl,UPMO單P4O單_5^_0.1|xL_Total_20pLPCR擴(kuò)增反應(yīng)條件反應(yīng)前先94'C變性3min，每個(gè)循環(huán)包括94'C變性30s，57°C復(fù)性30s，72°C延伸30s，共30個(gè)循環(huán)。最后一次循環(huán)結(jié)束時(shí)72°C延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后取5PCR產(chǎn)物，1呢瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，12個(gè)重組菌落中有l(wèi)l個(gè)可以擴(kuò)增出64bp大小片段，初步判斷為陽(yáng)性克隆。e)酶切鑒定從菌液PCR結(jié)果中的11個(gè)陽(yáng)性克隆任意取一管菌液，參照E.Z.N.APlasmidMiniprepKit試劑盒說(shuō)明書(shū)中的操作方法提取重組質(zhì)粒。用￡coRI和H/m;ni進(jìn)行雙酶切質(zhì)粒DNA鑒定，酶切結(jié)果有預(yù)期兩條帶(2630bp和126bp),確認(rèn)該重組質(zhì)粒插入了目的片段。將該重組質(zhì)粒的菌株送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，作進(jìn)一步的鑒定，防止插入片段發(fā)生變異或移碼現(xiàn)象。3.3、-RACEa)唐魚(yú)全魚(yú)總RNA經(jīng)上述相同反轉(zhuǎn)錄后，以p5和M13PrimerM4為引物進(jìn)行擴(kuò)增唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因cDNA的3'端。PCR反應(yīng)體系如表11:表1L3、-RACE反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>50PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件反應(yīng)前先94'C變性3min，每個(gè)循環(huán)包括94"變性30s，54'C復(fù)性30s，72t:延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)。最后一次循環(huán)結(jié)束時(shí)72'C延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后取5pLPCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。b)PCR產(chǎn)物的T載體連接用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，其TaqDNAPolymerase擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物DNA雙鏈前后末端都有一個(gè)游離的A堿基，可以與pMD18-Tvector末端游離的T堿基互補(bǔ)形成環(huán)狀重組T質(zhì)粒。按T載體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行膠回收產(chǎn)物與pMD18-Tvector連接，連接體系如表12:表12.連接體系<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>反應(yīng)產(chǎn)物混勻后于16。C連接2小時(shí)。c)重組菌的菌液PCR檢測(cè)將PCR產(chǎn)物與pMD18-TVector的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a菌株，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜。菌液PCR篩選轉(zhuǎn)化子用牙簽挑取菌落放入加有3mlLB液體培養(yǎng)基(含Amp)的離心管中，37r培養(yǎng)10小時(shí)后進(jìn)行菌液PCR來(lái)挑選重組轉(zhuǎn)化子。PCR反應(yīng)體系如表13:表13.PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件反應(yīng)前先94'C變性3min，每個(gè)循環(huán)包括94'C變性30s，57t:復(fù)性30s，72r延伸30s，共30個(gè)循環(huán)。最后一次循環(huán)結(jié)束時(shí)72r延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后取5pLPCR產(chǎn)物，1呢瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，12個(gè)重組菌落中有l(wèi)l個(gè)可以擴(kuò)增出448bp大小片段，初步判斷為陽(yáng)性克隆。d)酶切鑒定從菌液PCR結(jié)果中的11個(gè)陽(yáng)性克隆任意取一管菌液，參照E.Z.N.APlasmidMiniprepKit試劑盒說(shuō)明書(shū)中的操作方法提取重組質(zhì)粒。用￡coRI和H/m/III進(jìn)行雙酶切質(zhì)粒DNA鑒定，酶切結(jié)果有預(yù)期兩條帶(2630bp和510bp)，確認(rèn)該重組質(zhì)粒插入了目的片段。將該重組質(zhì)粒的菌株送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，作進(jìn)一步的鑒定，防止插入片段發(fā)生變異或移碼現(xiàn)象。4.唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因cDNA全序列的獲得將5'和3'端序列及核心序列用Vector軟件拼接得到唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因的cDNA序列，全長(zhǎng)1145bp，序列見(jiàn)SEQIDN0:1。經(jīng)ExPASy軟件在線分析，該基因的5'非編碼區(qū)為64bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)633bp，3'非編碼區(qū)為448bp，共編碼210個(gè)氨基酸，序列見(jiàn)SEQIDN0:2，其中包括22個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和188個(gè)氨基酸的成熟肽。所編碼的氨基酸與近緣?mèng)~種(草魚(yú)、青魚(yú)、鳙魚(yú)、鯉魚(yú)、金魚(yú)、斑馬魚(yú)、團(tuán)頭魴、泥鰍)生長(zhǎng)激素氨基酸有很高的同源性，其中與草魚(yú)和鳙魚(yú)的同源性高達(dá)97.6%。實(shí)施例3轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建1、弓1物設(shè)計(jì):根據(jù)上述唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因ORF序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物p6和p7。P6:5'-ATGGATCCACCGGTCGCCACCATGGCTAGAGCATTGG-3';P7:5'-ATGCGGCCGCCTACAGGGTGCAGTTTGAATCC-3'。2、PCR基因改造將PCR產(chǎn)物，PCR反應(yīng)體系如表14:表14.PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件反應(yīng)前先94'C變性3min，每個(gè)循環(huán)包括94'C變性30s，54'C復(fù)性30s，72匸延伸50s，共30個(gè)循環(huán)。最后一次循環(huán)結(jié)束時(shí)72'C延伸7min。反應(yīng)結(jié)束后取5nLPCR產(chǎn)物，1呢瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。用膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶fiamHI和I將其酶切純化。3、用5amHI和WWI酶切轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pTLA-DsRed，并回收含有啟動(dòng)子的載體。用T4連接酶將酶切純化后的唐魚(yú)唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因ORF和含有啟動(dòng)子的載體進(jìn)行連接。按載體和目的片斷的DNA摩爾數(shù)比為l:3進(jìn)行連接，其余條件參照T4連接酶說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的詳細(xì)構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖1。實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因唐魚(yú)的外源基因檢測(cè)將上述構(gòu)建的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入魚(yú)受精卵，孵化培育90d，以PCR方法和Southernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)植基因的整合情況，以KT-PCR和Westernblotting檢測(cè)轉(zhuǎn)植基因pTLA-GH在唐魚(yú)組織器官中的表達(dá)。同時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)組唐魚(yú)和對(duì)照組唐魚(yú)的表型變化，結(jié)果證實(shí)重組表達(dá)載體pTLA-GH已成功地轉(zhuǎn)化到唐魚(yú)體內(nèi)，并且在唐魚(yú)體內(nèi)發(fā)揮了生長(zhǎng)激素的促生長(zhǎng)生理功能。具體步驟如下1、重組表達(dá)載體pTLA-GH的轉(zhuǎn)入用I酶切重組質(zhì)粒pTLA-GH，使其線性化。酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè)其OD值，調(diào)整濃度至30ng4iL，然后將線性化后的重組表達(dá)載體顯微注射到受精卵'l'。試驗(yàn)共注射了204顆卵，受精卵于25'C孵化培育。72h后孵化出膜，有85顆卵出膜，成活的有37尾。2、PCR方法檢測(cè)根據(jù)重組表達(dá)載體pTLA-GH的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)上下游引物PP-SF禾卩GP-SR。PP-SF:5'-CGGTAGAATGCAGCACGAAAC-3';GP-SR:5'-CGGCCAGCTTCTCAGTGATC-3';提取11尾轉(zhuǎn)植基因唐魚(yú)的基因組DNA，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如下表15:表15.PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件反應(yīng)前先94'C變性3min，每個(gè)循環(huán)包括94'C變性30s，54'C復(fù)性30s，72"延伸30s，共30個(gè)循環(huán)。最后一次循環(huán)結(jié)束吋72"C延仲7min。反應(yīng)結(jié)束后取5^LPCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后測(cè)序，結(jié)果證實(shí)所擴(kuò)增的片段為轉(zhuǎn)植基因pTLA-GH，且兩尾個(gè)體最大的實(shí)驗(yàn)魚(yú)(1#和2#魚(yú))都檢測(cè)到轉(zhuǎn)植基因pTLA-GH(圖2)。3、SouthernBlot檢測(cè)轉(zhuǎn)植基因pTLA-GH的整合情況回收上一歩驟PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用分光光度計(jì)測(cè)定其OD值，并對(duì)此片段進(jìn)行地高辛標(biāo)記，Dig探針標(biāo)記和檢測(cè)試劑盒DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKit購(gòu)自RocheAppliedScience(Germany)公司。方法如下a)探針標(biāo)記l)取3~10嗎探針DNA，加入雙蒸水至總體積為16^L;2)沸水浴10min，徹底使DNA變性；3)迅速置于冰上冷卻，加入4pLVia11(試劑盒所帶)，短暫離心；4)37。C放置溫育20h;5)加入2pL0.2mol/LEDTA，65。C預(yù)熱10min，終止反應(yīng)。b)標(biāo)記后探針靈敏度檢測(cè)標(biāo)記后的探針按1:1、1:10、1:50、1:100、1:500稀釋，點(diǎn)膜檢測(cè)效率，步驟如下1)取各稀釋液lpL分別點(diǎn)于已做好記號(hào)帶正電的尼龍膜上；2)254nm紫外交聯(lián)3min將探針固定在膜上；3)用一個(gè)培養(yǎng)皿裝入20mLMaleicacidbuffer,然后將交聯(lián)后的膜轉(zhuǎn)入馬來(lái)酸中，于1525'C孵育2min;4)將膜轉(zhuǎn)入lOmLBlockingsolution中孵育30min;5)將膜轉(zhuǎn)入10邁LAntibobysolution中孵育30min;6)將膜轉(zhuǎn)入10mLWashingbuffer中孵育15min;7)重復(fù)上一步操作；8)將膜于10mLDetectionbuffer,平衡2-5min;9)在膜滴力卩2mL新配colorsubstratesolution,避光顯色2~16h;10)當(dāng)顯色的點(diǎn)密度達(dá)到要求后，用無(wú)菌雙蒸水或TEbuffer洗脫5min，終止顯色反應(yīng)。c)轉(zhuǎn)基因唐魚(yú)基因組DNA的SouthernBlot檢測(cè)取3月齡轉(zhuǎn)pTLA-GH基因唐魚(yú)，提取鰭條組織基因組DNA，經(jīng)￡c0RI酶切，反應(yīng)體系如下表16:表16.酶切體系<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>酶切產(chǎn)物經(jīng)純化(V-geneCleanUpKit)后，同時(shí)以質(zhì)粒pTLA-GH作為陽(yáng)性對(duì)照。不加EB的瓊脂糖凝膠于10V電泳24h后，采用半干轉(zhuǎn)移法進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)膜，后用標(biāo)記探針進(jìn)行Southernblot雜交，具體操作方法如下1)瓊脂糖凝膠電泳將酶切產(chǎn)物經(jīng)普通瓊脂糖凝膠電泳(不加EB)后，經(jīng)含EB的TBE緩沖液染色5min，照相，在UV下切下含目的條帶的膠條并將膠的一角切下作為標(biāo)記，將凝膠浸泡在0.5XTBEbuffer中待用(15min);2)膜準(zhǔn)備剪下大小合適的尼龍膜并在膜的適當(dāng)位置做好正面標(biāo)記(與膠相對(duì)應(yīng))，將膜以及2張ExtraThickBlotPaper(加厚濾紙)，4張3M濾紙?jiān)?.5xTBEbuffer中浸泡15min;3)電轉(zhuǎn)化按照從正極到負(fù)極的順序?qū)xtraThickBlotPaper、2張3M濾紙、膜、膠、2張3M濾紙、ExtraThickBlotPaper依次在相應(yīng)位置疊好，并保證每層樣品間無(wú)氣泡。疊好后從頂部添加適量的0.5xTBEbuffer,用紙巾吸走殘留在正極板上多余的buffer;4)插好電源，保證正負(fù)極方向正確。電轉(zhuǎn)電流不超過(guò)3.55niA/cm2，電壓設(shè)為10V，30minlh，可通過(guò)EB染色后在UV下觀察凝膠來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)膜情況；5)電轉(zhuǎn)完畢后，取出樣品，關(guān)閉電源，將尼龍膜在0.4NNaOH中浸泡5min后，2xSSC洗膜〈5min;6)紫外交聯(lián)將膜在干凈的3M濾紙上放平進(jìn)行UV-crossing，254nm，3min，2次；7)預(yù)雜交將交聯(lián)后的膜放入大小合適的三面封口的袋中，加入4mL(10ml7100cm2)的DIGEasyHyb，保證其間無(wú)氣泡，然后將另一邊用封口機(jī)封上；8)在5(TC進(jìn)行預(yù)雜交，30min;9)在雜交的同時(shí)，取2pLDNAprobe(25ng/mL)煮沸5min，使探針變性，并立即在冰上冷卻5min;10)雜交取出預(yù)雜交好的膜放入一個(gè)新的封口袋中，加入2邁LDIGEasyHyb+2pLDenatureDNAprobe，混和均勻，保證袋中無(wú)氣泡并封口；11)將雜交袋放入雜交瓶中，于雜交爐中雜交過(guò)夜(12~18h)。12)洗膜雜交完成后，取出膜用2xSSC，0.1%SDS溶液漂洗，室溫2X5min(15-25°C);13)用預(yù)熱到68。C的0.5xSSC，0.1%SDS溶液漂洗膜，68°C，2x15min;14)適量Washingbuffer室溫清洗5min;15)適量Blockingsolution(vial6，1:10inMaleicacidbuffer)封閉30min~lh;16)適量Antibobysolution(vial4，1:5000inBlockingsolution)溫育30min;17)適量Washingbuffer,室溫清洗2x15min;18)適量Detectionbuffer,平衡2~5min;19)顯色將膜放在干凈的3M濾紙上稍經(jīng)空氣干燥后，放入干凈的培養(yǎng)皿中，力卩入4mL新配的colorsubstratesolution(vial5，1:50inDetectionbuffer)，避光顯色。(顯色反應(yīng)立即開(kāi)始到16h后基本結(jié)束)顯色過(guò)程中勿動(dòng)，但可打開(kāi)蓋子觀察顯色情況；20)顯色結(jié)束后，用50mL的滅菌dH20洗脫5min，終止顯色反應(yīng)。Southern雜交的結(jié)果，如圖3所示孔道1為陽(yáng)性對(duì)照(pTLA-GH質(zhì)粒:)；孔道2為實(shí)驗(yàn)魚(yú)基因組DNA經(jīng)酶切、電泳轉(zhuǎn)膜后，與探針結(jié)合呈陽(yáng)性條帶；陰性孔道則沒(méi)有條帶(圖中未顯示)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明轉(zhuǎn)植的GH基因已整合到唐魚(yú)基因組上。4、RT-PCR方法檢測(cè)pTLA-GH在轉(zhuǎn)基因唐魚(yú)組織器官中的表達(dá)a)總RNA的提取分別提取轉(zhuǎn)基因唐魚(yú)和野生型的肌肉和內(nèi)臟組織的總RNA，提取方法如下1)將組織加入到預(yù)冷的研缽中迅速敲打數(shù)次并加入Trizol(Invitroen)溶液，勻漿后轉(zhuǎn)入1.5mLEP管中；2)15'C-25'C放置5min，使細(xì)胞充分裂解；3)加入20(^iLCH4C13，用手劇烈振蕩15s，使溶液呈淡粉白色，室溫放置2~3min使其分層；4)4。C12000rpm離心15min;5)取上清小心轉(zhuǎn)入到無(wú)菌1.5mLRNase-FreeEP管中，加入150|iL無(wú)水乙醇混勻；6)將混合液全部轉(zhuǎn)移到UNIQ-10柱中，室溫放置2min，8000rpm離心lmin;7)小心取出柱子，棄收集管中的廢液，將柱子放回收集管中，加入450pLRPESolution,lOOOOrpm離心30s;8)重復(fù)第7步；9)小心取出柱子，棄收集管中的廢液，將柱子放回收集管中10000rpm離心15s;10)小心取出柱子，放入新的無(wú)菌L5mLRNase-FreeEP管中，在膜中央小心加入50nLDEPC—H20，55。080。C放置2min。10000rpm離心lmin。一70°C保存?zhèn)溆?。b)RNA的反轉(zhuǎn)錄取少于lpg的轉(zhuǎn)基因唐魚(yú)和野生型唐魚(yú)樣品總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)ReverTraAce-a-TM(TOYOBO，Japan)所提供的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系如表17:表17.RT反應(yīng)體系成分體積RNase-FrecddH2011-取5xRTbufferdNTPMixtureRNaseInhibitorl^LOligo(dT)20l|iLRNAXpiL(海g)RevcrTraAcsl^L總體積20|aL反應(yīng)條件42°C30min，99°C5min，4°C5min;反應(yīng)完成后，冰浴5min后瞬時(shí)離心，一20'C保存?zhèn)溆?。c)PCR擴(kuò)增①pTLA-GH片段的擴(kuò)增以轉(zhuǎn)基因唐魚(yú)和尾野生型唐魚(yú)的組織器官的RT產(chǎn)物為模板，以pi和p2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系見(jiàn)表18:表18.PCR反應(yīng)體系成分體積ddH2016.25|iL10xPCRBuffer2萃TaqPIP2反轉(zhuǎn)錄液總體積25(iL反應(yīng)條件如下表PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件94"預(yù)變性3min;然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件為94。C變性30s，54。C退火30s，72。C延伸30s;循環(huán)結(jié)束后72°C再延伸7min。取5pLPCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。②P-actin基因片段的擴(kuò)增以RT產(chǎn)物為模板，以p-acitnF(5'-GTGCCCATCTACGAGGGTTACGC-3')和P-acitoR(5'-TGGTCTCGTGGATACCGCAAG-3')為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如表19:表19.PCR反應(yīng)體系成分體積ddH2016.25jiL醇PCRBuffer2.5pLTaq0.25jiLbeta-acitoFbeta-acitnR反轉(zhuǎn)錄液總體積25PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件94t:預(yù)變性3min;然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng)，94°。變性30s，58。C退火30s，72。C延伸2min;循環(huán)結(jié)束后72。C再延伸7min。取5pLPCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因唐魚(yú)和野生型唐魚(yú)的肌和內(nèi)臟均能擴(kuò)增出預(yù)期大小的特異帶，轉(zhuǎn)基因唐魚(yú)的肌肉和內(nèi)臟組織的mRNA分別比野生型唐魚(yú)的高34.3%和40.7%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明轉(zhuǎn)植的GH基因在唐魚(yú)體內(nèi)獲得表達(dá)，且轉(zhuǎn)基因唐魚(yú)的GHmRNA高于野生唐魚(yú)。5、Westernblotting檢測(cè)生長(zhǎng)激素的表達(dá)情況a)唐魚(yú)肌肉蛋白的提取①分別取轉(zhuǎn)基因唐魚(yú)(PCR、Southern雜交和KT-PCR結(jié)果為陽(yáng)性)和野生型唐魚(yú)lOOmg肌肉，加入lmlRlPA和10ulPMSF(不能預(yù)先加入到RIPA中，否則PMSF會(huì)失去效能)，在冰里用勻漿器將組織勻漿；②將樣品轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管，4。C20000g離心30min;③將上清小心轉(zhuǎn)移到干凈無(wú)菌離心管中，一20。C保存。b)WesternblottingWesternblotting使用的溶液，見(jiàn)表2025:<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>注上述成分預(yù)溶于600mLddH20，用鹽酸調(diào)pH至7.4后，再用ddH20定容至1L。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注轉(zhuǎn)移緩沖液預(yù)冷至4'C。表24.封閉液<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>注1)10ml底物溶液加入10nl30免的H202，混勻后立即使用；2)或直接使用武漢博士德生物工程公司的DAB顯色試劑盒顯色。Westernblotting操作1)SDS-PAGE①聚丙烯酰胺凝膠的制備電泳前，將電泳槽等用具擦洗干凈，晾干，按要求裝配電泳槽；配制12%的分離膠注入玻璃板夾層中，馬上加ddH20于表面，使膠面保持平整；待分離膠凝聚后，倒去并吸干分離膠表面的水分，配制5%的濃縮膠灌入玻璃板夾層中，插入點(diǎn)樣梳。12%分離膠和5%濃縮膠配置如表26:表26.12%和5%凝膠的配制<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>②上樣將提取的轉(zhuǎn)基因唐魚(yú)和非轉(zhuǎn)基因唐魚(yú)的肌肉蛋白分別加入等體積的2xSDS-PAGE上樣緩沖液，IO(TC水浴煮沸5min,每個(gè)泳道上樣20^L;③電泳起始電壓為100V，待樣品進(jìn)入分離膠后，加大i乜壓至150V，當(dāng)溴酚藍(lán)剛好跑出凝膠時(shí)，停止電泳。2)電轉(zhuǎn)移a.切取大小與凝膠一致的硝酸纖維素濾膜(NC膜)l張、普通濾紙8張，并在NC膜的右上角做切口記號(hào)；b.把硝酸纖維素濾膜漂浮于去離子水的水面.匕借毛細(xì)管作用使之從下往上濕潤(rùn)后，將之浸沒(méi)于水中，浸泡5min以上，直到濾膜上沒(méi)有氣泡；c.把濾紙、墊膜(filterpad)浸泡于少量轉(zhuǎn)移緩沖液中使之充分浸濕；d.SDS-PAGE結(jié)束后從玻璃上取下凝膠，去離子水中略作漂洗；e.按下列順序逐張疊放、精確對(duì)齊灰色板在最下方，其上依次放置墊膜、4張濾紙、凝膠、NC膜、4張濾紙、墊膜。小心趕走濾紙和膠之間的所有氣泡；f.小心地合上轉(zhuǎn)移槽的膠板，并立即放入轉(zhuǎn)移槽'I'。注意不要移動(dòng)凝膠和濾紙；g.加入轉(zhuǎn)移緩沖液，至轉(zhuǎn)移膠板浸沒(méi)。同時(shí)加入冰盒避免電泳過(guò)程緩沖液溫度過(guò)高；h.接通電源，注意正負(fù)極方向。凝膠位于負(fù)極，NC膜位于正極。50V，2h;i.轉(zhuǎn)移結(jié)束后打開(kāi)膠板取出NC膜，室溫干燥30min。根據(jù)預(yù)染蛋白Marker的條帶清晰狀況判斷轉(zhuǎn)膜效果。3)封閉a.按濾膜面積O.lml/cm2的量加入封閉液，盡可能排除里面的氣泡，然后密閉袋口，平放，室溫?fù)u床孵育l2h或4t:過(guò)夜；1)1>85溶液洗膜3次，10111111/次。加入含一抗的封閉液(稀釋比例為1:1000)，4。C平緩搖23h;c.TBST溶液(含0.40.5%T\veen20的TBS)漂洗3次,10min/次。再用TBS漂洗3次，10min/次。4)與二抗反應(yīng)a.二抗(辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的IgG羊抗兔)用封閉液按1:400的比例稀釋，室溫緩慢搖動(dòng)lh;b.PBS洗NC膜3次，10min/次。再用TBS漂洗3次,10min/次。5)顯色按DAB顯色試劑盒的使用說(shuō)叨，分別加入A、B、C液各1滴至lmlddH20中，1030min顯色，待蛋白帶顏色深度達(dá)到耍求后用水終止反應(yīng)，掃描NC膜。Westernblotting的結(jié)果如圖4所示轉(zhuǎn)基因唐魚(yú)和野生型唐魚(yú)的肌肉巾均可檢測(cè)到大小與生長(zhǎng)激素蛋白相當(dāng)(21KD)的特異性條帶，陽(yáng)性對(duì)照(重組鯉魚(yú)GH)條帶最清晰(第1泳道)，實(shí)驗(yàn)魚(yú)(第三泳道)的條帶比野生型的明顯性(第二泳道)。6、培育70d和100d，分別測(cè)定對(duì)轉(zhuǎn)植基因和非轉(zhuǎn)基因唐魚(yú)進(jìn)行了全長(zhǎng)和體重，數(shù)據(jù)見(jiàn)表27。培育70d的實(shí)驗(yàn)魚(yú)中有3尾大體型魚(yú)，其中最大個(gè)體的體重是對(duì)照組魚(yú)最大個(gè)體體重的1.7倍，是對(duì)照組魚(yú)平均體重的2.5倍；培育100d，實(shí)驗(yàn)組最大個(gè)體體重1.120g，是對(duì)照組最大個(gè)體體重的2.1倍，是對(duì)照組平均體重的3.0倍。表27.實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組魚(yú)全長(zhǎng)與體重平均值70d100d實(shí)驗(yàn)魚(yú)平均全長(zhǎng)(mm)平均體重(g)平均全長(zhǎng)(mm)平均體重(g)轉(zhuǎn)基因唐魚(yú)28.66±5.270.242±0.09233.71±4.970.401±0.087(共37尾)非轉(zhuǎn)基因唐魚(yú)27.41±5.000.203士0.04232.22±4.300.373±0.041(共32尾)綜合PCR、Southern雜交、RT-PCR和Westernblotting雜交結(jié)果，以及體長(zhǎng)體重的數(shù)值比較，說(shuō)明轉(zhuǎn)植的GH基因整合到了實(shí)驗(yàn)唐魚(yú)體中并進(jìn)行了有效的GHmRNA的轉(zhuǎn)錄,表達(dá)了GH蛋白，發(fā)揮了GH的促生長(zhǎng)功能。唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因及其真核表達(dá)載體與應(yīng)用序列表.t.xtSEQUENCELIST頂G<110〉中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所〈120〉唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因及其真核表達(dá)載體與應(yīng)用〈130〉<160〉2<170〉Paterrtlnversion3.2<210〉1<211〉1145<212〉DMA<213〉唐魚(yú)(Tanichthysalbonubes)〈220〉<221>CDS<222〉(65)..(694)<400〉1acgcggggaaaccttcacagcaagccttcaactaagaacacaagagttggcaacccagag60caaaatggetagagcattggtgctgtttteggtggttctggttagtttg109MetAlaArgAlaLeuValLeuPheSerValValLeuValSerLeu151015ttggtgaaccaggggagagccteagagaaccageggetcateaacaat157LeuAsnGinGlyArgAlaSerGluAsnGinArgLeulieAsnAsn202530getgtcatecgt.gttcaacacctgcaccagctggetgcaaaaatgatt205AlaVallieArgValGinHisLeuHisGinLeuAlaAlaLysMetlie354045aacgactttgaggacaacctgttgcctgaggaacgcagacagctgag"t253AsnA_spPhe6luAspAsnLeuLeuProGluGluArgArgGinLeuSer505560aaaatttttcct.ctgtctttctgcaactctgactecattgaggcgccc301LysliePheProLeuSerPheCysAsnSerAspSerlieGluAlaPro657075actggaaaagatgaaacgcagaagaget.ct.atgt.tgaagetccttcgc349ThrGlyLysAspGluThrGinLysSerSerMetLeuLysLeuLeuArg80859095atetctttccgcetcattgagtectgggagtttcccagecagaccctg397lieSerPheArgLeulieGluSerTrpGluPheProSerGinThrLeu100105110agtggaaccgtctctaacagectgaccgtcgggaaccccaaccagate445SerGlyThrValSerAsnSerLeuThrValGlvAsnProAsnGinlie115120125actgagaagctggccgacttgaaagtgggcateagegtgetcateaag493ThrGluLysLeuAlaAspLeuLysValGlvlieSerValLeulieLys130135140ggatgtctggatggtcaaccaaacatggacgacaatgactecctgccg541GlvCysLeuAspGlyGinProAsnMetAspAspAsnAspSerLeuPro145150155ctgcctttcgaggatttctacttgaccatgggggagaacageetcaga589LeuProPheGluAspPheTyrLeuThrMetGlyGluAsnSerLeuArg160165170175gagagetttcgtcttctggettgcttcaagaaggacatgcacaaggtg637GluSerPheArgLeuLeuAlaCysPheLvsLysAspMetHisLysVal180lbOgaaacttacctgagggttgcaetattgcaggagatecctggatteaaac685GluThrTyrLeuArgValAlaAsnCysArgArgSerLeuAspSerAsn唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因及其真核表達(dá)載體與應(yīng)用序列表.txt195200205tgcaccctgt鄰a.gggcgccaaagtattgctagtcatagcctgtaacac734CysThrLeu210gtgtgct.tcgct.t.aattaal:tatctggtcttacatacccagaaaaggtcaagcaggct.gg794gtt3gtmgt.tctatatttccctcaccct.ttt.gtntttttcttctattttg,attg854cccattatttatggtgggatctgattaaacatttaaaagtattttatggc914ataat.attttaaaat.ttgcccttttcactt.t.ggcttattatg3CCCC333aagggttaag974犯tgctt.ttggccaa犯c^agtgtttgaatggtgggtttcccccccsatggttgggatg1034cttaataccaatggt.gttttaattgttagatcgggttttt1094ct.ggtgt.gattttccccaaaaaattttaaaacggc3ca^1145<210〉2〈211〉210〈212>PRT<213>唐魚(yú)()<400>2MetAlaArgAlaLeuValLeuPheSerValValLeuValSerLeuLeu151015ValAsnGinGlyArgAlaSerGluAsnGinArgLeulieAsnAsnAla202530VallieArgValGinHisLeuHisGinLeuAlaAlaLysMetlieAsn354045AspPheGluAspAsnLeuLeuProGluGluArgArgGinLeuSerLys505560liePheProLeuSerPheCysAsnSerAspSerlieGluAlaProThr65707580GlyLysAspGluThrGinLysSerSerMetLeuLysLeuLeuArglie859095SerPheArgLeulieGluSerTrpGluPheProSerGinThrLeuSer100105110GlyThrValSerAsnSerLeuThrValGlyAsnProAsnGinlieThr115120125GluLysLeuAlaAspLeuLysValGlylieSerValLeulieLysGly130135140CysLeuAspGlvGinProAsnMetAspAspAsnAspSerLeuProLeu145150155160ProPheGluAspPheTyrLeuThrMetGlyGluAsnSerLeuArgGlu165170175SerPheArgLeuLeuAlaCvsPheLysLysAspMetHisLysValGlu180185190唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因及其真核表達(dá)載體與應(yīng)用序列表.txtThrTyrLeuArgValAlaAsnCysArgArgSerLeuAspSerAsnCys195200205ThrLeu210權(quán)利要求1.唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的多功能燃煤催化劑，特征在于，所述的堿金屬氧化物為Na20、LO或Cs20;所述的堿土金屬氧化物為CaO、MgO或BaO;所述的過(guò)渡金屬氧化物為FeO、MnO、NiO、CuO、CoO、SbO、HgO、VO、WO、MoO或Ti。2。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的多功能燃煤催化劑，特征在于，所述的堿金屬鹵化物為NaX、KX或CsX;所述的堿土金屬卣化物為CaXz、MgX2或BaX2;所述的過(guò)渡金屬卣化物為FeX2、MnX2、CuX2或HgX;其中X為氟、氯、溴或者碘。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的多功能燃煤催化劑，特征在于，所述的堿金屬氫氧化合物為NaOH、KOH或CsOH;所述的堿土金屬氫氧化合物為Ca(OH)2、Mg(OH)2或Ba(OH)2;所述的過(guò)渡金屬氫氧化合物為Fe(0H)2或A1(0H)3。5、根據(jù)權(quán)利要求l所述的多功能燃煤催化劑，特征在于，所述的過(guò)渡金屬有機(jī)化合物為醋酸鋅、醋酸銅、醋酸鐵或醋酸鎳。6、根據(jù)權(quán)利要求l-5任一項(xiàng)所述燃煤催化劑，其特征在于該催化劑在溫度為IOO(TC時(shí)，失重30-50%。7、權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述多功能燃煤催化劑的制備方法，其特征在于，以摩爾份數(shù)計(jì)，將氧化物1~25份、鹵化物2~10份、氫氧化合物1~25份、有機(jī)金屬化合物1~IO份和堿金屬的鹽1~25份混合，過(guò)篩，得燃煤催化劑；所述氧化物為堿金屬氧化物、堿全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因及其真核表達(dá)載體與應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)GenBank上已登陸的魚(yú)類生長(zhǎng)激素基因cDNA序列，在同源保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物(p1和p2)，然后提取唐魚(yú)總RNA，以總RNA為模板，P1和P2為引物，獲得了唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因的cDNA序列，全長(zhǎng)1145bp。本發(fā)明將唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因連接到轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，構(gòu)建了新的重組表達(dá)載體，并且成功在轉(zhuǎn)基因唐魚(yú)內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。本發(fā)明的唐魚(yú)生長(zhǎng)激素基因能應(yīng)用于唐魚(yú)等魚(yú)類的生長(zhǎng)促進(jìn)，應(yīng)用前景廣闊。文檔編號(hào)C12N15/16GK101220362SQ200710031440公開(kāi)日2008年7月16日申請(qǐng)日期2007年11月16日優(yōu)先權(quán)日2007年11月16日發(fā)明者勞海華,星葉,夏仕玲,王海英,白俊杰,清簡(jiǎn),郁二蒙申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所