專利名稱：：一種多環(huán)芳烴高效降解菌系及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于環(huán)境污/生物處理^:領(lǐng)域，具,及一種多環(huán)芳烴高效,菌系及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：多環(huán)芳烴(PAHs)是指兩個(gè)或兩個(gè)以上的苯環(huán)以鏈狀、角狀或串狀排列組成的化合物，主要來(lái)源于化石燃料的燃燒、石油開(kāi)釆的泄漏和石油煉制過(guò)程的廢物排放等。PAHs在環(huán)境中的含量雖然微量但是分布廣泛，由于多環(huán)芳烴的潛在毒性、致癌性及致畸誘變作用，對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境具有明顯的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。美國(guó)環(huán)保局(USEPA)在上個(gè)世紀(jì)八"h^代就將16種未帶分支的PAHs列入了環(huán)境優(yōu)先污染物的黑名單。近年來(lái)，隨著石油及石油產(chǎn)品的大量〗頓，環(huán)境中的多環(huán)芳烴有不斷增多的趨勢(shì)。另外，多環(huán)芳烴的遺傳毒性和致癌性隨著苯環(huán)數(shù)目的增加而增加，在4、5個(gè)環(huán)時(shí)毒性最高。芘是多環(huán)芳烴四個(gè)苯環(huán)的代表物，在環(huán)境中廣泛存在，是檢測(cè)多環(huán)芳烴污染的指示物。研究表明，多環(huán)芳烴的水解和光解速率都非常緩慢，生物降解成為它們從環(huán)境中緩慢消失的主要途徑，因此高效降解菌的篩選成為修復(fù)多環(huán)芳烴污染的生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵。目前，人們m3i人工富集培養(yǎng)等技術(shù)，已經(jīng)分離得到很多能,或轉(zhuǎn)化某種多環(huán)芳烴的細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類等，大多數(shù)來(lái)自土壤微生物，其中細(xì)菌由于在生化上的多種適應(yīng)能力以及容易誘發(fā)突變菌種從而占據(jù)了主要地位。但是對(duì)多環(huán)芳烴芘的糊效率還有待提高，已分離到芘的高效菌種不多。另一方面，在實(shí)際污染修復(fù)中，多環(huán)芳烴的,3lf呈往往是徼生物菌系的協(xié)同代謝完成的。因此，尋找育隨應(yīng)真實(shí)環(huán)境的高效,菌是目前環(huán)境^J戶研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有IW多環(huán)芳烴芘存在的難題，提供一種多環(huán)芳烴高效,菌系及其應(yīng)用，主要是在廢水生物處理和環(huán)境污染修復(fù)中用于,多環(huán)芳烴芘中的應(yīng)用。本發(fā)明所ili共的高效糊菌系GP3來(lái)源于廣州石化總廠附近受石化產(chǎn)品污染的土壤，經(jīng)人工富集培養(yǎng)、分離純化得到。該混合菌系GP3由兩種純菌GP3A和GP3B所組成。菌株GP3A革蘭氏染色陰性，其菌落表面光滑不透明、邊緣整齊、有光澤，菌體形態(tài)為無(wú)芽孢短桿狀，接觸酶陽(yáng)性，氧化酶陽(yáng)性，非發(fā)酵型，專性需氧，菌株GP3Ai^ewfifowo膨sp.GP3A)的16SrDNA的GeneBank的登錄號(hào)為EU233280，于2007年10月25日在武漢的中國(guó)典型培養(yǎng)劍，中心，編號(hào)為M207166。菌株GP3B(尸awforaea;wowe"usaGP3B)革蘭氏染色陰性，菌落較小，表面光滑不透明，邊緣整齊，菌體形態(tài)為無(wú)芽孢桿狀，劍蟲(chóng)酶強(qiáng)陽(yáng)性，氧化酶陰性，非發(fā)酵型，專性需氧，菌株16SrDNA的GeneBank的登錄號(hào)為EU233279，于2007年10月25日在武漢的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心^lt，編號(hào)為M207167。該降解菌系的最適生長(zhǎng)^f牛為PH=3.88.3，》鵬3040。C。該混合菌系能利用芘作為唯一碳源和能源生長(zhǎng)繁殖，將芘完全礦化成C02和H20。在純培養(yǎng)割牛下，該菌系7天能將無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中15mg/L的芘,90%以上。如果添加適量的共代謝底物菲可以提高該菌系降解的效率。菌株GP3A和GP3B組成的混合菌系GP3在中性和偏酸性的較寬pH范圍內(nèi)均離艮好的,芘，另外，該菌系能耐受一定濃度的Cu"、Zn2+、Cd"等重金屬離子，并且在芘的初始濃度為530mg/L范圍內(nèi)混合菌均可以^f的,芘，這將對(duì)該混合菌系在含多環(huán)芳烴工業(yè)廢水的生物處理和污染環(huán)境的生物修復(fù)中發(fā)揮重要作用。圖1混合菌GP3的細(xì)胞生長(zhǎng)與芘的降解曲線圖，—口一培養(yǎng)液中芘的殘留率，_—培養(yǎng)液中GP3的菌密度。圖2芘初始濃度對(duì)菌系GP3,率的影響。、具體實(shí)駄式實(shí)施例1:sp.GP3A和PandoraeapnomenusaGP3B的分離與降解芘的性能現(xiàn)場(chǎng)采集廣州石化總廠受石化產(chǎn)品污染的土壤，采用以芘為唯一碳源的純無(wú)機(jī)鹽體系馴化芘降解菌，芘的初始濃度保持15mg/L。無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液(MSM)成分5.0ml/L磷酸鹽緩沖液(8.5g/LKH2P04，21.75g/LK2HP04'H20,33.4g/LNa2HP04'12H20，5.Og/LNH4)C)，3.0ml/LMgSO4水溶液(22.5g/L)，1.0ml/LCaCl27jC溶液(36.4g/L)，1.Oml/LFeCl37JC溶液(0.25g/L)，1.0ml/L微量元素溶液(39.9mg/LMnS04'H20，42.8mg/LZnS04'H20，34.7mg/L(NH4)6Mo7024'4H20)。經(jīng)過(guò)若干代反復(fù)馴化，在固體培養(yǎng)基(NR)中劃線培養(yǎng)，得到多株純菌，純菌^31接種至液體培養(yǎng)基中驗(yàn)證其降解芘的能力，最后得到由GP3A和GP3B組成的芘的高效,菌系GP3，菌株GP3A經(jīng)16SrDNA鑒定為假單胞菌屬(Ptewcfowo腿sp.)，菌株GP3B經(jīng)16SrDNA鑒定為尸a/rfiforaea;"owera^a。NR成分蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaC15g，瓊脂條15g，蒸餾水1L，調(diào)pH為7.0。將混合菌系GP3接種至含芘15mg/L的MSM培養(yǎng)基中，在150r/min、3(TC搖床中避光振蕩培養(yǎng)，在第0、1、2、3、4、5、6、7d的同一時(shí)間分別取樣須淀培養(yǎng)液中菌密度和芘的殘留率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖l。由圖1的生長(zhǎng)曲線可以看出，在培養(yǎng)初期(0~ld)，混合菌GP3生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，這是微生物對(duì)外源異生物質(zhì)的適應(yīng)過(guò)程。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)(l~4d)，微生物進(jìn)AX寸數(shù)生長(zhǎng)期，對(duì)芘的糊科乍用增強(qiáng)。到第4d時(shí)，GP3對(duì)芘的,率達(dá)到m6。/。，生物量增加了38倍。到,的后期(4~7天)，微生物進(jìn)入穩(wěn)定期，混合菌對(duì)芘的降解曲線趨于平緩，殘留的芘得到進(jìn)一步的降解。到第7天時(shí)，GP3的菌密度達(dá)到5xl(^Celhni;1，芘的,率達(dá)到90%以上。本實(shí)施例說(shuō)明分離馴化所得到的菌系GP3可利用多環(huán)芳烴芘作為唯一碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，并且具有高效降解芘的能力。實(shí)施例2:pH對(duì)芘降解作用的影響調(diào)節(jié)MSM培養(yǎng)基為不同pH值(4^n)，在初始芘濃度為15mg/L的條件下，培養(yǎng)7d，觀啶pH值對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響。表1為pH對(duì)芘,作用的影響。表l<table>complextableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由表1可以看出，在pH為6.2時(shí)，,菌系GP3對(duì)芘的,作用最強(qiáng)，在7天后其降解率達(dá)97.0%;在pH為10.9時(shí)降解率受到較大的抑制，僅為2.6%，說(shuō)明GP3在偏酸性環(huán)境中更有利于降解芘。GP3在不同pH值下的菌密度表明，pH對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響與,率相一致。在pH值在3.88.3時(shí)，GP3的生長(zhǎng)受到影響不大，而當(dāng)pH值為10.9時(shí)，微生物已經(jīng)不能存活。在酸性到弱堿性環(huán)境時(shí)，GP3對(duì)芘的糊率執(zhí)較高，在這樣寬廣的范圍內(nèi)軎雜高效的發(fā)揮,芘的能力，表明GP3在實(shí)際污染物處理中能夠適應(yīng)復(fù)雜的環(huán)境條件。本實(shí)施例說(shuō)明菌系GP3在中性和偏酸性的較寬pH范圍內(nèi)均能,的降解芘，為其在不同pH環(huán)境中的應(yīng)用掛共了保證。實(shí)施例3:芘初始濃度對(duì)菌系GP3,芘的影響在芘濃度分別為5、10、15、20和30mg'U1的MSM中，7d后混合菌GP3對(duì)的降解率分別為99.5%、948%、87.6%、79.1%與75.7%(見(jiàn)圖2)。由圖2可知，GP3能將初始濃度為5mg'L'1的芘幾乎完全卩繊，但是當(dāng)芘的初始濃度增加時(shí)，殘留芘的濃度便顯著增加。當(dāng)芘濃度達(dá)到30mg-L—1時(shí)，其降解效能受到一定的抑制，這可能是因?yàn)楦邼舛溶旁?過(guò)程中積累了某種有害的中間產(chǎn)物，對(duì)微生物產(chǎn)生了一定的毒害作用。微生物對(duì)芘的絕對(duì)降解量隨著初始濃度的升高而升高，可能是因?yàn)檐诺拿傅幕钚噪S之升高弓胞的。本實(shí)施例說(shuō)明菌系GP3可在較高(530mg/L)的濃度范圍內(nèi)較好的糊多環(huán)芳烴芘，為其在多環(huán)芳烴污染環(huán)境中的修復(fù)共了保證。實(shí)施例4:添加葡萄糖和菲對(duì)菌系GP3的細(xì)胞生長(zhǎng)與芘,率的影響將GP3接種至含芘15mg/L的MSM培養(yǎng)基中，然后在培養(yǎng)液中分別添加不同濃度的葡萄糖蛋和菲作為共代謝底物。表2為添加不同濃度葡萄糖、菲對(duì)GP3細(xì)胞生長(zhǎng)與芘,的影響。表2<table>complextableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表2給出的娜可知，當(dāng)葡萄糖濃度為100mg'L"時(shí)，芘的,效率與不加葡萄糖對(duì)照相差不大；但當(dāng)葡萄糖的濃度增加到1000mg^時(shí)，芘的,率急劇下降至29.6%。添加了IO(MOOOmg-i;1的葡萄糖會(huì)抑制混合菌GP3對(duì)花的利用，同時(shí)GP3的菌密度要比只加芘時(shí)要高。從表2也可知添加低濃度的菲(10mg'L")有利于艦混合菌系GP3的生長(zhǎng)，提高其對(duì)芘的降解效率。但當(dāng)菲的濃度達(dá)到5(M00mg1—4寸，GP3的菌密度則斷氏，其對(duì)芘的,也受到抑制。本實(shí)施例說(shuō)明添加適量刺戈謝底物可艦降解菌系GP3的生長(zhǎng)，同時(shí)提高其對(duì)芘的降解率。實(shí)施例4:不同重金屬離子又寸菌系GP3,芘的影響將GP3接種至含芘15mg/L的MSM培養(yǎng)基中，在150r/min、3(TC搖床中避光振蕩培養(yǎng)，分別加入不同濃度的重金屬離子Zn2+、Cd2+以及Cu2+、不添加重金屬{,照，培養(yǎng)7d進(jìn)行芘l^實(shí)驗(yàn)。表3是重金屬離子對(duì)菌株,芘的影響。表3<table>complextableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由表3可知，GP3對(duì)Cd2+的耐性較差，MSM中Cd2+的濃度為210mgi"時(shí)，芘的,均受到明顯的抑制，說(shuō)明CcP對(duì)GP3撤大的毒害作用；當(dāng)Zi^+濃度為10mg'i;i時(shí)，芘的,沒(méi)有受到影響，但Zn2+濃度在30mg^以上時(shí)，GP3對(duì)芘的,率也顯著下降；與不加重金屬對(duì)照，Cu2+對(duì)芘的,也有明顯的抑制，而且Q+濃度越高，其對(duì)芘,的抑制作用越強(qiáng)。E^實(shí)驗(yàn)的三種重金屬離子而言，它們均對(duì)GP3有一定的毒害作用，.而Cd2+的毒性最強(qiáng)。本實(shí)施例說(shuō)明降解菌系GP3能耐受一定濃度的Cu2+、Zn2+、Cd2+等重金屬離子，為該菌系在有重金屬?gòu)?fù)合污染環(huán)境中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)和保證。權(quán)利要求1、一種多環(huán)芳烴高效降解菌系，其特征在于該菌系包括革蘭氏染色陰性的鞘氨醇單胞菌屬的菌株GP3A(Pseudomonassp.GP3A)和革蘭氏染色陰性的菌株GP3B(PandoraeapnomenusaGP3B)；GP3A的保藏編號(hào)為M207166，為接觸酶陽(yáng)性，氧化酶陽(yáng)性，非發(fā)酵型，專性需氧，菌體形態(tài)為無(wú)芽孢短桿狀，菌落表面光滑不透明，邊緣整齊，有光澤；GP3B的保藏編號(hào)為M207167，為接觸酶強(qiáng)陽(yáng)性，氧化酶陰性，非發(fā)酵型，專性需氧，菌體形態(tài)為無(wú)芽孢桿狀，菌落較小，表面光滑不透明，邊緣整齊。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的,菌系在廢7jC生物處理和環(huán)境污染修復(fù)中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種多環(huán)芳烴高效降解菌系及其應(yīng)用，該菌系包括革蘭氏染色陰性的鞘氨醇單胞菌屬的菌株GP3A和革蘭氏染色陰性的菌株GP3B；GP3A為接觸酶陽(yáng)性，氧化酶陽(yáng)性，非發(fā)酵型，專性需氧，菌體形態(tài)為無(wú)芽孢短桿狀，菌落表面光滑不透明，邊緣整齊，有光澤；GP3B為接觸酶強(qiáng)陽(yáng)性，氧化酶陰性，非發(fā)酵型，專性需氧，菌體形態(tài)為無(wú)芽孢桿狀，菌落較小，表面光滑不透明，邊緣整齊。該菌系可在好氧條件下高效降解多環(huán)芳烴芘，在以10mg/L菲為共代謝底物時(shí)可促進(jìn)菌系GP3對(duì)多環(huán)芳烴芘的降解作用。該菌系GP3不僅有較強(qiáng)的芘降解能力，而且也有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，可用于修復(fù)廢水生物處理和污染環(huán)境。文檔編號(hào)C12N1/20GK101195810SQ20071003182公開(kāi)日2008年6月11日申請(qǐng)日期2007年11月30日優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日發(fā)明者志黨,易筱筠,琛楊,陳曉鵬申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)