專利名稱：高效防治香蕉枯萎病的地衣芽孢桿菌201及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物保護(hù)領(lǐng)域，尤其涉及一種防治香蕉枯萎病的內(nèi) 生生防菌株，具體地說(shuō)涉及一種高效防治香蕉枯萎病的地衣芽孢桿 菌201及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；?Fusarium oxysporum f. sp. cubense)侵染引起的一種毀滅性病害，是香蕉生產(chǎn)的毀滅性土 傳病害。病原菌從受傷的根莖侵入，通過(guò)維管束向假莖及葉部蔓延， 堵塞木質(zhì)部導(dǎo)管，直至植株枯萎死亡。香蕉枯萎病菌是土壤習(xí)居菌， 其厚垣孢子能夠在土壤中存活8 10年。香蕉枯萎病在中國(guó)珠江三 角洲香蕉產(chǎn)區(qū)的多個(gè)縣市均有分布，病園病株率約為10% 40%， 嚴(yán)重的達(dá)90%以上，以致蕉園丟荒。
目前對(duì)該病的防治尚無(wú)理想藥劑和抗病品種， 一些栽培管理措 施只能起到局部的控制作用，尋找一種經(jīng)濟(jì)、安全、有效的防治措 施是當(dāng)務(wù)之急，生物防治不失為重要的輔助手段，其中拮抗細(xì)菌在 植物病害生物防治中起到非常重要的作用，其主要優(yōu)勢(shì)在于l)種 類和數(shù)量眾多，在植物根際根內(nèi)、根際大量存在；2)對(duì)病原菌的作 用方式多種多樣，包括競(jìng)爭(zhēng)、拮抗、寄生、誘導(dǎo)植物抗性的產(chǎn)生等； 3)繁殖速度快；4)許多細(xì)菌在植物的根內(nèi)或根際定殖力強(qiáng)；5)細(xì) 菌大多能夠人工培養(yǎng)，易于操作，便于生產(chǎn)應(yīng)用；6)有些細(xì)菌不僅 能夠防治病害而且可以增加作物產(chǎn)量。從香蕉植株內(nèi)分離篩選獲得
對(duì)香蕉枯萎病菌具有拮抗作用的生防細(xì)菌菌株，對(duì)香蕉枯萎病的防 治具有重要意義，但目前相關(guān)技術(shù)仍舊很薄弱甚至空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的空白，提供一種高效防治香蕉枯
萎病的地衣芽孢桿菌201，地衣芽孢桿菌201是一種從香蕉植株內(nèi)分 離篩選獲得對(duì)香蕉枯萎病菌具有拮抗作用的生防細(xì)菌菌株，對(duì)香蕉 枯萎病的防治具有重要意義。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供了所述高效防治香蕉枯萎病的地衣芽 孢桿菌201在防止香蕉病災(zāi)害方面的多種應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種高效防治香蕉枯萎病的地衣芽孢 桿菌201， Bacillus licheniformis 201，保藏號(hào)CCTCCM207092，在 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落呈灰白色，圓形，平展，無(wú)光澤，邊緣整 齊，菌落直徑一般2 3mm，菌體直桿狀，大小為2.06X0.70Mm，芽 孢呈橢圓形。
本發(fā)明所述高效防治香蕉枯萎病的地衣芽孢桿菌201通過(guò)平板 對(duì)峙、盆栽試驗(yàn)篩選獲得。
本發(fā)明還提供了所述的高效防治香蕉枯萎病的地衣芽孢桿菌201 的應(yīng)用，其一是對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)小種菌絲的抑菌作用。
其二是在23 25"C的溫室條件下對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)小種菌絲 的抑制作用。
其三是對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)小種菌絲分生孢子萌發(fā)的抑制作用。 其四是對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)小種菌絲的致畸作用。
其五是對(duì)西瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、膠胞炭 疽菌、玉米彎孢葉斑病菌、棉花黃萎病菌或小麥赤霉病菌病原真菌具 有拮抗作用。
本發(fā)明的有益效果是
(1) 地衣芽孢桿菌201為植物內(nèi)生菌，對(duì)香蕉枯萎病菌抑制作 用強(qiáng)，對(duì)多種病原真菌具有拮抗作用，具有拮抗細(xì)菌在植物病害生物 防治中所起到的非常重要的作用，例如種類和數(shù)量眾多，在植物根 際根內(nèi)、根際大量存在；對(duì)病原菌的作用方式多種多樣；繁殖速度 快等優(yōu)點(diǎn)，尤其是對(duì)香蕉枯萎病的防治具有重要意義。
(2) 種菌株培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、容易保存，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有 良好的開發(fā)應(yīng)用前景。


圖1 10X40倍顯微鏡下測(cè)定抑菌帶的直徑觀察倍地衣芽孢桿菌 201對(duì)FOC4菌絲的抑制作用
圖2 10X40倍顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)變化了解地衣芽孢桿菌 201對(duì)FOC4菌絲的致畸作用
圖3 10X40倍鏡檢孢子萌發(fā)情況了解地衣芽孢桿菌201對(duì) FOC4分生孢子萌發(fā)的抑制作用
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。 實(shí)施例1地衣芽孢桿菌201對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)小種菌絲FOC4的 抑制作用將香蕉枯萎病菌4號(hào)小種菌絲FOC4直徑為5mm菌絲塊接入馬 鈴薯蔗糖培養(yǎng)基PDA平板中央，將直徑為5mm的滅菌濾紙片三片等 距離接種于FOC4菌絲塊周圍，每片濾紙片上滴加培養(yǎng)24h的菌株 201培養(yǎng)液10叱。三次重復(fù)，25 28。C培養(yǎng)，5天后測(cè)定抑菌帶的直 徑。由附圖1可見地衣芽孢桿菌201對(duì)香蕉枯萎病菌抑菌作用強(qiáng)。 實(shí)施例2地衣芽孢桿菌201在溫室條件下對(duì)香蕉枯萎病的抑制
將株高約為10cm的巴西香蕉幼苗浸入菌株201的培養(yǎng)液中，培 養(yǎng)液OD等于0.5， 30min后取出，種植于花盆中。分別在第2d、第 7d、第15d和第30d，將蕉苗撥起，浸入FOC4的孢子懸浮液中30min， 孢子懸浮液1X105個(gè)孢子/mL，再種植于花盆中，每個(gè)花盆處理36 株。接種后香蕉苗放置在23 25。C的溫室中培養(yǎng)，每日淋水一次。 接種FOC4后20天、30天、40天調(diào)查發(fā)病率和病情指數(shù)。結(jié)果表明， 菌株201接種15天、30天后挑戰(zhàn)接種FOC4，與對(duì)照相比，香蕉幼 苗發(fā)病率顯著下降，接種香蕉枯萎病菌后40天，香蕉苗發(fā)病率分別 為43.5%和29.8%，病情指數(shù)分別為82%和57%，而對(duì)照株發(fā)病率在 95%以上;病情指數(shù)在98%以上。 實(shí)施例3地衣芽孢桿菌201對(duì)FOC4菌絲的致畸作用
將玻璃紙剪成5mmX25mm的長(zhǎng)條狀，12rC高壓滅菌，用鑷子 將其鋪放于菌株201和病原菌FOC4之間。28。C恒溫培養(yǎng)5 7天， 待菌株201和FOC4菌絲之間出現(xiàn)明顯抑菌帶后，將玻璃紙小心取下， 置于10X40倍的顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)變化，以不接菌株201的 病原菌為對(duì)照。觀察到菌絲前期膨大突出，后期明顯變細(xì)，分枝多而
短，形態(tài)不均勻，見附圖2，其中1:正常生長(zhǎng)的FOC4菌絲(10X40 倍)；2:前期菌絲膨大突出(10X40倍)；3:后期多數(shù)菌絲變尖細(xì)， 分枝多而短，形態(tài)不均勻(10X40倍)。
實(shí)施例4地衣芽孢桿菌201對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)小種菌絲FOC4分 生孢子萌發(fā)的抑制作用
吸取的FOC4孢子懸浮液，滴加到凹玻片上。風(fēng)干后，滴 加菌株201的培養(yǎng)液，以滴加無(wú)菌水為對(duì)照。每處理重復(fù)5次， 置于28'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h以后鏡檢孢子萌發(fā)情況。觀察到分生孢 子大多變得細(xì)長(zhǎng)，少數(shù)孢子的兩端出現(xiàn)泡狀物，見附圖3，其中l(wèi): 48h后觀察到的正常萌發(fā)的FOC4分生大孢子(10X40倍)；2:正常 萌發(fā)的FOC4分生小孢子(10X40倍)；3:菌株201處理48h后， 多數(shù)FOC4分生大孢子萌發(fā)被抑制，孢子變得細(xì)長(zhǎng)(10X40倍)；4: 少數(shù)FOC4分生的大孢子兩端出現(xiàn)泡狀物(10X40倍)。 實(shí)施例5地衣芽孢桿菌201對(duì)多種病原菌的拮抗作用。
將振蕩培養(yǎng)40h的菌株201培養(yǎng)液配成濃度約為 1.0X109CFU/mL (OD值約為0.5)的懸浮液，10000g離心10min， 取上清液，在培養(yǎng)皿加入lmL上清液，再倒入10mLPDA培養(yǎng)基， 混勻，待平板冷卻凝固后，分別接入不同的病原真菌西瓜枯萎病菌， 番茄枯萎病菌，香蕉炭疽病菌，膠胞炭疽菌，玉米彎孢葉斑病菌，棉 花黃萎病菌和小麥赤霉病菌。以加入lmL肉膏蛋白胨培養(yǎng)基NB為 空白對(duì)照，25 28'C培養(yǎng)5 7天，計(jì)算相對(duì)抑制率。從表l的實(shí)驗(yàn) 結(jié)果可以得出地衣芽孢桿菌201對(duì)多種病原菌均具有較強(qiáng)的抑制作用。
表1地衣芽孢桿菌201對(duì)多種病原菌的抑制作用
病原菌相對(duì)抑制率(％)
西瓜枯萎菌58.67土3.875b
番茄枯萎菌76.92土1.693b
香蕉炭疽菌91.39士2.236a
膠胞炭疽菌62.75±0.493a
彎孢葉斑菌60.10士1.163a
棉花黃萎菌82.38:t0.953a
小麥赤霉菌65.07土1.222b
注相對(duì)抑制率為三次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。DMRT檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)
計(jì)檢驗(yàn)，同行具有相同字母的數(shù)據(jù)間無(wú)顯著差異(/7=0.05)
權(quán)利要求
1、一種高效防治香蕉枯萎病的地衣芽孢桿菌201，其特征在于地衣芽孢桿菌201，Bacillus licheniformis 201，保藏號(hào)CCTCCM207092，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落呈灰白色，圓形，平展，無(wú)光澤，邊緣整齊，菌落直徑一般2～3mm，菌體直桿狀，大小為2.06×0.70μm，芽孢呈橢圓形。
2、 權(quán)利要求1所述高效防治香蕉枯萎病的地衣芽孢桿菌201的 制備方法，其特征在于所述地衣芽孢桿菌201通過(guò)平板對(duì)峙和盆栽試 驗(yàn)篩選獲得。
3、 權(quán)利要求1所述的高效防治香蕉枯萎病的地衣芽孢桿菌201 的應(yīng)用，其特征在于對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)小種菌絲的抑制作用。
4、 權(quán)利要求1所述的高效防治香蕉枯萎病的地衣芽孢桿菌201 的應(yīng)用，其特征在于在23 25"C的溫室條件下對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào) 小種菌絲的抑制。
5、 權(quán)利要求1所述的高效防治香蕉枯萎病的地衣芽孢桿菌201 的應(yīng)用，其特征在于對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)小種菌絲分生孢子萌發(fā)的抑 制作用。
6、 權(quán)利要求1所述的高效防治香蕉枯萎病的地衣芽孢桿菌201 的應(yīng)用，其特征在于對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)小種菌絲的致畸作用。
7、 權(quán)利要求1所述的高效防治香蕉枯萎病的地衣芽孢桿菌201 的應(yīng)用，其特征在于對(duì)西瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、 膠胞炭疽菌、玉米彎孢葉斑病菌、棉花黃萎病菌或小麥赤霉病菌病原 真菌具有拮抗作用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效防治香蕉枯萎病的地衣芽孢桿菌201，Bacillus licheniformis 201，保藏號(hào)CCTCCM207092，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落呈灰白色，圓形，平展，無(wú)光澤，邊緣整齊，菌落直徑一般2～3mm，菌體直桿狀，大小為2.06×0.70μm，芽孢呈橢圓形；同時(shí)公開了其制備方法和應(yīng)用，地衣芽孢桿菌201的對(duì)香蕉枯萎病菌抑制作用強(qiáng)，抑菌譜廣，對(duì)香蕉枯萎病菌，西瓜枯萎病菌，番茄枯萎病菌，香蕉炭疽病菌，膠胞炭疽菌，玉米彎孢葉斑病菌，棉花黃萎病菌，小麥赤霉病菌等多種病原真菌都具有拮抗作用，防效高，環(huán)境安全性好，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101186885SQ200710032049
公開日2008年5月28日 申請(qǐng)日期2007年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月4日
發(fā)明者孫正祥, 王振中, 王春華, 紀(jì)春艷 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)