專利名稱：稻瘟菌激發(fā)子csbⅰ基因及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種稻瘟菌糖蛋白激發(fā)子 CSB I基因及其克隆方法。
背景技術(shù)：
稻瘟病(rice blast disease)是山子囊菌i/ag/7a/ ort/ egrisea (Hebert) Barr[其無性世代為/yr_z'c〃7arj'<s grisea (Cooke) Sacc.] 引起的水稻三大病害之一，在水稻栽培的國家和地區(qū)廣泛分布并嚴(yán) 重影響水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量。稻瘟病常年均冇不同程度的發(fā)生，流行 年份一般減產(chǎn)10%—20%，嚴(yán)軍:時(shí)達(dá)50%以上。水稻抗稻瘟病品種的 選育和利用是防治稻瘟病的有效措施。但山于稻瘟菌的遺傳背景復(fù) 雜，易于變異，而且抗稻瘟病品種相對單一化，主栽品種的遺傳同 質(zhì)性，使抗病育種難以跟上稻瘟病菌生理小種的變異速度，常常導(dǎo) 致一個(gè)新的具冇抗稻媼病的水稻品種在火面積種植3到5年后就嚴(yán) 重感病。稻瘟菌冇多個(gè)生理小種，其中Zd3是廣東省優(yōu)勢小種，對 水稻造成很人危害。
激發(fā)子是來自于生物的化合物，病原菌產(chǎn)生的激發(fā)子能誘導(dǎo)植 物產(chǎn)生不同類型的防衛(wèi)反應(yīng)，包括離子滲漏，氧化突發(fā)，植物細(xì)胞 壁的修飾，植保素及病原相關(guān)蛋白的合成，過敏性反應(yīng)的發(fā)生，防 御基因的誘導(dǎo)啟動(dòng)等，從而使植物對病原菌具有殺傷作用或產(chǎn)生抗 性。如果能找到稻瘟菌Zd3生理小種的激發(fā)子，將對稻瘟菌誘導(dǎo)抗
病機(jī)制研究提供重要的技術(shù)資料和基礎(chǔ)，為有效提高水稻的產(chǎn)量和
質(zhì)量做出貢獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
木發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的空白，提供一種稻瘟菌激發(fā)子
CSBI基因。
木發(fā)明的另-'個(gè)目的是提供了所述稻瘟菌激發(fā)子CSBI基岡的 簡單準(zhǔn)確有效的克隆方法。
木發(fā)明的技術(shù)方案是提供.'種稻瘟菌激發(fā)子CSBI基岡，基因 編碼的核苷酸序列，cDNA全長序列如SEQ ID N0:1，氨基酸序列如 SEQ ID NO:2。
本發(fā)明同時(shí)提供了所述稻瘟菌激發(fā)子CSB I基因的克隆方法，包 括以下步驟
(1) 稻瘟病菌生理小種菌株培養(yǎng)后提取總RNA;
(2) 以(1)總RNA為模板，采用RT-PCR法合成cDNA第一鏈； 利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)克隆得到稻瘟病菌生現(xiàn)小種CSB I激發(fā) 子的推導(dǎo)cDNA序列。
步驟(l)所述稻瘟病菌生理小種菌株為稻瘟病菌Zd3生理小種。 步驟(1)所述菌株培養(yǎng)為在合適的培養(yǎng)基屮25X:培養(yǎng)4天。 所述培養(yǎng)基為采川酵母浸膏5g和葡萄糖22g用水定容至 lOOOmL，于121。C火齒20 min。
所述稻瘟菌激發(fā)子CSBI基因的克隆方法的步驟(2)包括以下
步驟 (a) 設(shè)計(jì)兩條上游簡并引物P33A和P39A，進(jìn)行所述稻瘟病齒 ZC13生理小種總RNA的3， RACE,得到CSB I基因cDNA的3，端的片 段；
(b) 在cDNA的3，端設(shè)計(jì)一特異引物P5B，并根據(jù)3，端序列 與稻瘟菌全基因組數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果，在同源性設(shè)高的假定蛋白 hypothetical protein MG07877. 4的cDNA編碼序列的5，端設(shè)計(jì)-■ 特異引物P5endA，將其分別作為下游和上游引物擴(kuò)增cDNA的5，端， 得到CSB I基因cDNA的5，末端片段；
(c) 3'和5'末端拼接得到序列；用3'端序列設(shè)計(jì)特異引物 P3endB,與P5endA擴(kuò)增由P3endB反轉(zhuǎn)錄稻瘟菌ZC13生理小種總 RNA得到的cDNA，驗(yàn)證拼接得到序列。
歩驟(a)所述引物分別為
P33A: 5， - GYATYAACTACGARWCCGAYCGC-3，；
P39A: 5， - CARCARGCBTGGGTBATYCGTC -3，；
M13 Primer M4: 5， - GTTTTCCCAGTCACGAC -3，。
步驟(b)所述特異引物分別為
P5B: 5， -CTGCAAACACCCTCGAATGACCC- 3，；
P5endA: 5， -GCTTGTTCCGACGAGTCCTTGT- 3，。
步驟(c)所述引物為
P3endB: 5， -GGCGCATTACAGGTAGCTAGTCA- 3，。 本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明中的CSB I激發(fā)子可以誘導(dǎo)水稻產(chǎn) 生抗病性，抵抗稻瘟病菌的侵染。所獲得的CSB I激發(fā)子cDNA序列，
除了可以作為進(jìn)一歩研究稻瘟病菌與水稻相互作川的機(jī)制之外，可
以進(jìn)行轉(zhuǎn)化水稻進(jìn)行抗病育種使川，并且將CSBI激發(fā)子基因轉(zhuǎn)化 到真核微生物屮，所表達(dá)的CSBI可以作為防治水稻病害的新藥劑 一一植物抗病誘導(dǎo)劑使川。這種抗病誘導(dǎo)劑具有高效、安全、持久 的特點(diǎn)。


圖1 ZC]3CSB I激發(fā)子cDNA序列3， RACE第-'次擴(kuò)增產(chǎn)物電泳
圖
圖2 ZC13CSB I激發(fā)子cDNA序列3， RACE巢式擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖 圖3 ZC13CSB I激發(fā)子cDNA序列5， RACE產(chǎn)物電泳圖 圖4 ZC13CSB I激發(fā)子cDNA推導(dǎo)序列巢式擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)^ '歩詳細(xì)的描述。 極據(jù)已測的稻瘟菌ZC13生理小種CSB I激發(fā)子肽段編碼序列設(shè)
計(jì)引物，克隆CSBIcDNA的全長序列，按照編碼規(guī)則推導(dǎo)出CSB I
的氨基酸序列。包括以下步驟
(1) 稻瘟病菌生理小種菌株培養(yǎng)后提取總RNA;
(2) 以(1)總RNA為模板，采用RT-PCR法合成cDNA第一鏈； 利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)克隆得到稻瘟病菌生理小種CSB I激發(fā) 子的推導(dǎo)cDNA序列。
步驟(1)過程如下
低溫保存的稻瘟病菌ZC13生理小種菌株經(jīng)活化后接種在液體培
養(yǎng)基于25'C培養(yǎng)4天，液體培養(yǎng)基為酵母沒膏5g、葡萄糖22g，用 水定容至1000mL， m。C，火菌20 min。然后用2層普通濾紙以布 氏漏斗濾出齒絲，經(jīng)雙蒸水ddH20充分洗滌，真空泵抽干水分。
改進(jìn)OMEGA公rfj的真齒RNA抽提純化試劑盒E. Z. NA Fungal RNA Kit方法提取總RNA。方法如下
首先將抽濾收獲的齒絲放入研缽屮，加液氮速凍后研磨成粉末， 取約50mg粉末轉(zhuǎn)移到川液氮預(yù)冷的1. 5mL離心管屮，向離心管屮加 入600 u L RM裂解液RFL和12 u L P -巰基乙醇快速混勻，振蕩10 秒，使菌絲粉末完全溶解。然后加入140 uL RNA抽提液SP，顛倒 混合數(shù)秒鐘，冰浴15分鐘，室溫離心10 000 g， 10min，吸取上清， 再加入140 yL RNA抽提液SP，重復(fù)抽提-'次，以完全除去除菌絲 體屮的蛋白質(zhì)和多糖。接著吸取十.清，加入等體積異丙醇，室溫離 心10 000 g， 10min，棄上清，離心管倒置于干凈濾紙上，流干其 中的液體。加350uL 65。C預(yù)熱RB緩沖液，350 w L溶解RNA沉淀， 加入350uL 75%的乙醇，振蕩混勻。再將混勻的樣品移入HiBind RNAspin吸附柱中，放入2mL離心管中，室溫離心10 000 g， 30sec， 取出吸附柱，倒掉離心管屮的濾液。吸附柱中加入750uL洗脫緩沖 液I，室溫離心10 000 g， 30sec，取出吸附柱，倒掉離心管中的濾 液。吸附柱屮加入500 y L洗脫緩沖液II，室溫離心10 000 g， 30sec， 取出吸附柱，倒掉離心管中的濾液，重復(fù)一次。最后加入30uL的 DEPC水，放入新的1.5mL離心管中，室溫離心10 000 g， lmin,所 獲洗脫液即為提取的RNA。
歩驟(2)實(shí)驗(yàn)過程如下
(a)設(shè)計(jì)兩條上游簡并引物P33A和P39A，進(jìn)行所述稻瘟病菌ZC13 生現(xiàn)小種總RNA的3， RACE,得到CSB I基因cDNA的3，端的片段。 見附圖1 ZC13CSB I激發(fā)子cDNA序列3，RACE第--'次擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖， 其屮M: DNA Marker (標(biāo)志)，3， RACE第-？欠擴(kuò)增產(chǎn)物，不同退火溫 度條件摸索1、 60.8°C、 2: 60. 5°C、 3: 59.8°C、 4: 59.0°C、 5: 58. 2°C、 6: 57. 8°C、 7: 57. 5°C、 8: 56. 9°C。
質(zhì)譜測得的CSB I激發(fā)子肽段氨基酸序列，在GenBank屮杏找 同源序列，根據(jù)同源序列的氨基酸密碼子的偏好性，同吋考慮稻瘟 菌密碼子使用頻率，利用01igo6軟件設(shè)計(jì)兩條上游簡并引物P33A 和P39A，進(jìn)行3， RACE。
P33A: 5， - GYATYAACTACGARWCCGAYCGC-3， P39A: 5， - CARCARGCBTGGGTBATYCGTC _3， Ml3 Primer M4: 5， - GTTTTCCCAGTCACGAC -3， 首先合成cDNA的第一鏈，在200 u L PCR管屮配制卜'列反應(yīng)液: luL總RNA， 1pL IOX反轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mM的dNTPs luL, 40units/uL的RNA酶抑制劑0. 25uL， 2. 5pmo1 >L的Oligo dT-Adaptor反轉(zhuǎn)錄引物0. 5pL， 5 units 的AMV反轉(zhuǎn)達(dá)錄酶
0. 5uL， 25mmol/L的MgCl2 2uL，加DEPC處理ddH20至總體積 10uL?；旌暇鶆蚝笾肨aKaRa PCR Thermal Cycler Dice上，30°C 反應(yīng)IO min， 42。C保溫60 min， 99。C反應(yīng)5 min， 5。C冷卻5 min。 然后以P33A和3，端錨定引物M13 Primer M4進(jìn)行第一輪RT-PCR，
在冰上準(zhǔn)備下列反應(yīng)物5units/uL的ExTaqHS0. 25uL， 5XPCR 緩沖液10"， 20 umol/L的上游引物P33A 0.5"L， 20umol/L 的M13 Primer M4 0. L，加入火菌d孤0至總體積40"?；靹?后加入到上述反應(yīng)完成的10 u L cDNA模板屮，置TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice上進(jìn)行擴(kuò)增:94°C， 2min預(yù)變性;94°C， 30sec變性; 59. 0°C， 30sec退火；72°C， 2min延仲；35個(gè)重復(fù)循環(huán)，設(shè)后72 °C，延仲7min。反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測到約1400bp 的特異性最強(qiáng)的條帶。
然后將第-'輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍用于第二輪巢式PCR擴(kuò)增。見附 圖2ZC^CSBI激發(fā)子cDNA序列3， RACE巢式擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其屮 M: DNAMarker， 3， RACE巢式擴(kuò)增產(chǎn)物，不同退火溫度條件摸索1: 55.7°C、 2: 56.4°C、 3: 57.2°C、 4: 58.0°C、 5: 58.9°C、 6: 59.7 °C、 7: 60. 6°C、 8: 61.6°C。巢式PCR的反應(yīng)體系為1 u L第一輪 擴(kuò)增產(chǎn)物，5units/uL的rTaq 0. 25liL， 10XPCR緩沖液5 ti L， 2. 5腿ol/L的dNTPs4u L， 25腿ol/L的MgCl2 3 u L， 20umol/L的上 游引物P39A 1pL， 20umol/L的下游引物M13 Primer M4 1 u L， 加入滅菌ddH20至總體積50 uL?；靹蚝笤赥aKaRa PCR Thermal Cycler Dice上，進(jìn)行擴(kuò)增94°C， 2min預(yù)變性；94°C， 30sec變 性；61.6°C， 30sec退火；72°C， lmin30sec延伸；35個(gè)重復(fù)循環(huán)， 最后72°C，延仲7min。反應(yīng)結(jié)束后在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測到一 條約900bp的特異DNA條帶，用北京天根生化科技有限公口'J的 TIANgel Mini普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，將該片段與首
輪擴(kuò)增特異性最強(qiáng)的片段克隆、交上海英駿生物技術(shù)有限公司測序 后，發(fā)現(xiàn)首輪擴(kuò)增特異性條帶全長1362bp，巢式擴(kuò)增序列特異性條 帶全長907bp。分析后發(fā)現(xiàn)，巢式擴(kuò)增片段與首輪擴(kuò)增片段的下游 部分完全重合，首輪擴(kuò)增的特異性片段編碼序列包含CSBI激發(fā)子 用于設(shè)計(jì)簡并引物的兩肽段。在片斷中還包括 "個(gè)終止密碼子TGA。 在終止密碼子下游包含一個(gè)長139bp的3'端非編碼區(qū)，含16個(gè)腺 苷酸的poly (A)，由此證實(shí)得到的片段為CSB I基因的3'端的片段。
(b)在cDNA的3，端設(shè)計(jì)一特異引物P5B，并根據(jù)3'端序列與稻 瘟菌全基因組數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果，在同源性最高的假定蛋白 hypothetical protein MG07877. 4的cDNA編碼序列的5，端設(shè)計(jì)一 特異引物P5endA，將其分別作為下游和上游引物擴(kuò)增cDNA的5，端，
得到CSB I基因cDNA的5，末端片段；見附圖3 ZC13CSB I激發(fā)子 cDNA序列5， RACE產(chǎn)物電泳圖，其屮，M: DNAMarker， 1、 2: cDNA5， 末端擴(kuò)增產(chǎn)物。
根據(jù)3， RACE克隆測序結(jié)果在cDNA的3，端設(shè)計(jì)一特異引物 P5B，并根據(jù)3'端序列與稻瘟菌全基因組數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果，在同 源性最高的假定蛋白(hypothetical protein MG07877. 4)的cDNA 編碼序列的5'端設(shè)計(jì)一特異引物P5endA，將其分別作為下游和上 游引物擴(kuò)增cDNA的5，端
P5B: 5， -CTGCAAACACCCTCGAATGACCC- 3，
P5endA: 5， -GCTTGTTCCGACGAGTCCTTGT- 3，
首先合成cDNA的第一鏈，在200 u L PCR管中配制下列反應(yīng)液
luL總RNA， luL IOX反轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mM的dNTPs 1pL， 40units/ti L的RNA酶抑制劑0. 25"， 2. 5pmo1 /叱的P5B反轉(zhuǎn) 錄引物0. 5uL， 5 units/uL的AMV反轉(zhuǎn)達(dá)錄酶0. 5 " L， 25mmol/L 的MgCl2 2 " L，加DEPC處理ddH20至總體積10 u L?；旌暇鶆蚝笾?TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice上，30。C反應(yīng)10 min， 42。C保溫 30 min， 99。C反應(yīng)5 min， 5。C冷卻5 min。
然后進(jìn)行RT-PCR，在冰上準(zhǔn)備下列反應(yīng)物5units/' y L的Ex Taq HS 0. 25u L, 5XPCR緩沖液10 y L， 20 y mol/L的上游引物P5endA 0.5uL,加入滅菌ddH20至總體積40uL?；靹蚝蠹尤氲绞?述反應(yīng)完 成的10 uL cDNA模板屮，置TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice上 進(jìn)行擴(kuò)增94°C， 2min預(yù)變性;94°C， 30sec變性;55.3。C， 30sec 退火；72°C， 1 min30sec延伸；35個(gè)重復(fù)循環(huán)，最后72°C，延伸 7min。反應(yīng)結(jié)束后在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測到一條約1200bp的特 異DNA條帶，用北京天根生化科技有限公司的TIANgel Mini普通瓊 脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收，將該片段克隆、交上海英駿生物技 術(shù)有限公司測序后，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增特異性條帶全長1158bp。序列分析后 發(fā)現(xiàn)，除掉它與3'端重疊片段后，還包含969nt序列，其中包含 N-端全部已測出氨基酸序列和1個(gè)起始密碼子ATG。起始密碼子前 有35nt的5'端非編碼區(qū)。從序列分析結(jié)果可以證實(shí)，片段為CSB I基因的5'末端片段。
(c) 3'和5'末端拼接得到序列；用3'端序列設(shè)計(jì)特異引物 P3endB，與P5endA擴(kuò)增由P3endB反轉(zhuǎn)錄稻瘟菌ZC13生理小種總
RNA得到的cDNA，驗(yàn)證拼接得到序列。
用3'端序列設(shè)訃特異引物P3endB，與P5endA擴(kuò)增由P3endB 反轉(zhuǎn)錄稻瘟菌ZC13生現(xiàn)小種總RNA得到的cDNA，驗(yàn)證拼接得到序
P3endB: 5， -GGCGCATTACAGGTAGCTAGTCA- 3，
合成cDNA的第一鏈，在200uLPCR管屮配制下列反應(yīng)液1" 總RNA， 1 u L IOX反轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mM的dNTPs 1 y L， 40units/u L 的腿酶抑制劑0.25"， 2. 5pmo1 /叱的P3endB反轉(zhuǎn)錄引物 0. 5 u L， 5 units / u L的AMV反轉(zhuǎn)達(dá)錄酶0. 5 u L， 25,1/L的MgCl2 2 p L，力口 DEPC處理ddH20至總體積10 u L?；旌暇鶆蚝笾肨aKaRa PCR Thermal Cycler Dice上，3CTC反應(yīng)10 min， 42。C保潟.60 min， 99 。C反應(yīng)5 min， 5。C冷卻5 min。
然后進(jìn)行RT-PCR，在冰上準(zhǔn)備下列反應(yīng)物5units/ u L的Ex Taq HS0.25uL, 5XPCR緩沖液10uL， 20 u mol/L的上游引物P5endA 0.5"，加入火菌ddH20至總體積40uL?；靹蚝蠹尤氲缴鲜龇磻?yīng)完 成的10uL cDNA模板中，置TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice上 進(jìn)行擴(kuò)增94°C， 2min預(yù)變性;94°C， 30sec變性；55°C， 30sec 退火；72°C， 2min30sec延伸；35個(gè)重復(fù)循環(huán)，最后72°C，延伸7min。 反應(yīng)結(jié)束后在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測到一條約2200bp的特異DNA 條帶，用北京天根生化科技有限公司的TIANgel Mini普通瓊脂糖凝 膠DNA回收試劑盒回收，將該片段克隆、交上海英駿生物技術(shù)有限 公司測序后，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增特異性條帶大小為2281bp。
測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列與由3'和5'末端拼接得到的序列吻合。
CSB I cDNA序列全長2331bp，包含 一個(gè)2157bp的0RF，編碼含有718 個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。附圖4為ZC13 CSB I激發(fā)子cDNA推導(dǎo)序列 巢式擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其屮M: DNAMarker， 1、 2: cDNA序列巢式擴(kuò) 增產(chǎn)物。SEQUENCE LISTING
<110> 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
<12()〉稻瘟菌激發(fā)子CSB I基因及其克隆方法
<130〉
<160〉 2
<170> Patemtln version 3,2
〉1
> 2:348
> DNA 〉人丄序列
>
〉CDS
〉(36). (2192) <40()> 1
gcttgttccg acgagtcct.t gtcgaactat caatc atg cat gtt acc agg age 53
Met His Val Thr Arg Ser 1 5
ttg ttg gcg gcg gtc gcc ctg ccc gtc gcc tgg gcc a.ta acc cca gag 101 Leu Lmi Ala Ala Val Ala Leu Pro Val Ala Trp Ala lie Thr Pro Glu 10 15 20
get at,g ctg tea gca aac egg tat tct gat gcc gtg ccc a.at ccg tea 149 Ala Met Leu Ser Ala Asn Arg Tyr Ser As()人la Val Pro Asn Pro Ser 25 30 35
gga gaa ttt get etc ttc a.ca gcc aac aag tac tct ttc gag teg ggt 197 Gly Glu Phe Ala Leu Phe Thr Ala Asn Lys Tyr Ser Phe Glu Sei. Gly 40 45 50
tct cga tag aa.c tgg tgg aac ate ttg gac etc a.a.g acc ggc gac ate 245 Ser Arg Gin Asn Trp Trp Asn lie Leu人sp Leu Lys Thr Gly Asp lie 55 60 65 ' 70
tct gtt tgg ttc犯c gga tec gac att tec gag gtt gtg ttt gcc ggt 293 Ser Val T丄'p Phe Asn Gly Ser Asp lie Ser Glu Val Val Phe Ala Gly 75 80 85
ccg act ccg acc age ate ate tac etc aac ggc acc aat get gaa gag 341 Pro Thr Pro Thr Ser lie lie Tyr Leu Asn Gly Thr Asn Ala Glu Glu 90 95 100
gat gga ggt gtc age ttg tac gcc gcg gat etc cac teg ccg aca aac 389 Asp Glv Gly Val Ser Leu Tvr Ala Ala Asp Leu His Ser Pro Thr Asn 105 110 115
gcc acc eta gtg gcc tec ctt ccg gcc ccc tac tec gga etc aaa gcg 437 Ala Thr Leu Val Ala Ser Leu Pro八la Pro Tyr Ser Gly Leu Lys Ala 120 125 130 '
gcg cgc aca tct tct ggc gac ate aac ttc ctg etc acc gcc aag gcg 485 Ala Arg Thr Ser Ser Gly Asp lie Asn Phe Leu Leu Thr Ala Lys Ala 135 14b 145 ' 150
tac cct aac gga act gtg tac aac gag cag ctt gcc acc aa.g gcg agg 533 Tyr Pro Asn Gly Th丄'Val Tyr Asn Glu Gin Leu Ala Thr Lys Ala Arg ]55 160 165
age txa gcc aac att tac acg teg ctg tat c(',t cgt cac tgg gac tac 581 Ser Ser Ala Asn lie Tyr Thr Ser Leu Tvr Pro Arg His Trp Asp Tyr 170 175 ' 1,80 '
tgg ctg acc ccc cag aaa a.at gcc gtt ttc gga, ggt gtc etc sag tct 629 Trp Leu Thr Pro Gli Lys Asn Ala Val Phe Glv Glv Val Leu Lvs Ser 185 190 195
ggt age age ggc tac tec etc tct ggc aac etc acc aac tac gtc act 677
J 2 C
2 2Gly Scr Scr Glv Tyr Scr Leu Ser Gly Asn Leu Thr Asn Tyr Val Thr '200 205 ' 210 '
gga 8t,a tgc gac gtt att tgc gcc gag age ccg tac gac etc aac ggt 725
Gly lie Cys Asp Val lie Cys Ala Glu Ser Pro Tvr Asp Leu Asn (;lv 2L5 220 225 23b
get age gac tac gag ctt tec ccc gac ggc age aag gtt get ttc atg 773
Ala Ser Asp Tyr Glu Leu Ser Pro Asp Gly Ser Us Val Ala Phe Met
235 24b 245
a.cc aag gat att gga ct.t exc etc gcc aac acg acg age acc cag ate 821
Thr Lys八sp Ilo Gly Leu Pro Ltni人la Asn Thr Thr Ser Thr Gin lie 250 255 260
tac ctt gtc ccc ttc acc ggt acc gcc aag gat get gtc ccc ate aac 869
Tyr Leu Val Pro Phc Thr Gly Thr Ala Lys Asp Ala Val Pro lie Asn 265 270 275
ccc cgt age age age gcc aag tac ccc gag gcc cag ggc get tcg gcg 917
卩丄'o A丄'g Ser Ser Sor Ala Lvs Tyr Pro Glu Ala Gin Gly Ala Sei' Ala ， 2b5 290
age ccc ttt ttc tct ccc gac age age aag att gca tac gtg cag atg 965
Ser Pro Phe Phe Ser Pro Asp Ser Scr Lys lie Ala Tyr Val Gin Mel; 295 300 305 310
aat ggc ate aac tac gag tec gac cgc tec 3tc ctg tac gtc gcc gac 1013
Asn Giy lie Asn Tyr Glu Scu' Asp Arg Ser lie Leu Tyr Val /Ua Asp
315 320 325
gcc aac ggt gac aag gag aag ggc ttc aac at,c acc a.gg ctg get ggt 1061
Ala Asn Gly Asp Lys Glu Lvs Gly Phe Asn lie Thr Arg Lou Ala Gly 330 335 340
gac tgg gac cgc gca cca ggc tcg gcc aag tgg tcg cac gac ggc gag 1109
Asp Trp A叩A(chǔ)rg Ala Pro 6ly Sei' Ala Lys Trp Ser IUs Asp Gly Glu 345 350 355
acc ata tat gcc gac gcc gcg gac ctg ggt cat tcg agg gtg ttt gca 1157
Thr lie Tvr Ala Asp Ala Ala Asp Leu Gly Ilis Ser Arg Val Phe Ala 360 365 370
gta ccc ctg aca get ggc gat tcg tat gtg ccc aag aac ate acc gac L205
Val Pro L^u Thr人la Gly Asp Ser Tyr Val Pro Lys Asn lie Thr Asp 375 380 385 ' 390
cag ggt tec gtt get gga ttc tac cca ctt ccg gat ggc tct gtg etc 1253
Gin Gly Ser Val Ala Gly Phc Tyr Pro Leu Pro Asp Gly Ser Val Uu
395 400 405
gtc tec gac tec aag ata tgg tcg age egg gac att cac aca gtg tcg 1301
Val Ser人sp Ser Lys lie Trp Ser Ser Arg Asp lie His Thr Val Ser 410 415 420
ggc gag ggc aag ggg tct acc aag gtt tac ttc cag gcc aac etc gcc 1349
Gly Glu Gly Lys Gly Ser Tlu' Lys Val Tyr Phe Gin Ala Asn Uu Ala 425 430 435
gat tcg gag cU get ggc etc age tcg gcc gac gtg tec gag ttt tac 1397
八sp Ser Glu Uu Ala Gly Leu Ser Ser Ala Asp Val Ser Glu Phe Tyr 440 445 450
tac age age aac acc acc gag aac aag cag cag get tgg gtg att cgt 1445
Tyr Ser Ser Asn Thr Th丄'Glu Asn Lys Gin Gin Ala Trp Val lie Arg 455 460 465 470
ccg gcc gga. ttt gac age aca aag aag tat ccc ttg get ttc ate acc 1493
Pro Ala Gly Phe Asp Ser Thr Lys Lys Tyr Pro Uu Ah Phe lie Thr
475 * 485
ca,c gga. gga ccg ca,a gga gcg cac age aac a_cg tgg age acc cgc tgg 1541
His Gly Gly Pro Gin Gly Ala His Ser Asn Thr Trp Ser Thr Arg Trp 490 495 500
aac ttt aag gtg tgg gcc gac cag ggc tac gtt gtc gtt gcg ccc匿 1589Asn Phe Lys Val Trp Ala Asp 5*35
Gin Gly Tyr Val Val 510
Val Ala Pro 515
Asn
ccg acc gca teg act ggt t,tc Pro Thr Ala Ser Thr Gly Phe 520 525
gga. cag aac ttg acc Gly Gin Asn Leu Thr 530
gat gcc gtg Asp Ala Val
teg Ser
1637
gga. egg tgg aga. act gtg tac
(;iy Arg Trp Arg Thr Val Tyr
53.5 540 '
gtg agg gat肌c ctt gac tat
Val Arg Asp Asn Leu Asp Tyr 555
tgg gat a.tt gtg cac Trp Asp lie Val His 545
gtc gac acc gag aat Val Asp Thr Glu Asn 560
get tgg gag Ala Trp Glu
gga. ate gag Gly lie Glu 565
ta.t Tyr 550
gcc Ala
1685
1733
gga. gcg age ttt ggt ggt tac Gly Ala Ser Phe Gly Gly Tyr 570
atg acc aac ta.c ate Mot Thr Asn Tyr lie 575 '
ca.a ggt cag Gin Gly Gin 58b
ccg Pro
1781
ttg ggc cgc gag Uc sag gca. Leu ()lv Arg Glu Phc Lys Ala 585
etc gta acc cac gat Lou Thr His Asp 590
ggt gtt acc Gly Val Thr 59^
teg Ser
1829
act etc aac cag tac get a.ca Thr Leu Asn Gin Tyr Ala Thr 600 ' 605
gat gag cU tgg ttc Asp 6lu Leu Trp Phe 610
atg aac cac Met Asn His
gac Asp
1877
ttc erne ggc cct ttc aac cag Phc Asn Gly Pro Phe Asn Gin 615 620
tea tec aac gaa cct Ser Ser Asn Glu Pro 625
ggc teg ccg 61y Ser Pro
tac Tyr 630
1925
tac gac tgg aac ccg ctt cgc Tyr Asp Trp Asn Pro Leu Arg 635
tac att gac aac tgg Tyr lie Asp Asn Trp 640
gcc a.cg ccg Ala Thr Pro 645
His
i973
ttt gtc ate cac aac gac etc Phd Val lie His Asn Asp Leu 650
gac tac cgt ctt ccc Asp Tyr Arg Lcni Pro 655
gtg tec gag Val Sor Glu 660
ggc Gly
2021
gtc atg ctg ttc aac ctg etc Val Met Leu Phe Asn Leu Leu 665
cag gtc a.a.g gga gU Gin Val Lys Gly Val 670
ccc age aag Pro Ser Lys 675 '
Uc Phe
2069
ctg aac ttc cca gac gag aac Leu Asn Phe Pro Asp Glu Asn 680 685
cac tgg gtc acc肪g ll丄s Trp Val Thr Lys 6§0
cct gag肌c Pro Glu Asn
age Ser
2117
ctg gtc tgg cac acg gag ate Lgu Val Trp His Thi' Glu lie 695 700
ttt aac ttt 2itc aac Phe Asn Phe lie Asn 705
tac ta.c age Tyr Tyr Ser
ggt Gly 7L0
2165
gtc gat aac teg act agt ccg Val Asp Asn Ser Thr Ser Pro 715
ttt tg￡i aaeictaggtt ga.ggttta.gg Phe
2212
a.aggatataa cgagatccca ggtcttggat taatgtacat gtgatatga.c tagctacctg 2272 tfmtgcgccei taccaiga.taa. t朋cgacgit8肪tgtctcgc gtceiaiei^aB Et犯a朋a^g 2332 tcgtgactgg gaaaac 2348
<210> 2
<211> 718
<212> PRT <213〉人工序列
<400〉 2
Met, His Val Thr Arg Ser Leu Ala Ala Val Ala. Leu Pro Val Ala 15 10 15
Trp Ala. Jle Thr Pro Glu Ala Met Leu Ser Ala Asn Arg Tyr Ser Asp 20 25 3b
Ala Va丄Pro Asn Pro Ser Glv Glu Phe A—la Leu Phe Thr Ala Asn L\'s 35 ."10 45
Tyr Ser Phe Glu Ser Gly Ser Arg Gin Asn Trp Trp Asn lie L_eu Asp
50
55 .60
Leu Lys Thr GLy Asp lie Ser V'ai Ti'p Phe Asn Gly Ser .Asp lie Ser
65
70
75 . . 80
G"i VaL Val Phe Ala Gly Pro Tlir Prcr Thr Ser lie lie Tyi' Leu Asn
85
90 95
Gly Thi' Asn Ala Ghi Glu Asp Gly Gly Val Ser Leu Tyr Ala Ala Asp
100
105 110
Leu His Ser Pro Thr Asn Ala Thr I.,eu Val Ala. Set' Leu Pro Ala Pro
115
120 125
Tyr Set- Gly Leu Lys Ala ALa Arg Thi' Ser Ser Gly Asp lie Asn Plie
130
135 140
Leu Leu Thr Ata Lys Ala Tyr Pi.o Asn Gly Thr Val Tyr Asn Ghi Glri
145
■150
155 160
Leu A.la Thr Lys Ala Arg Ser Ser Ala Asn [Le Tyr Tlir Ser Leu Tyr
165
170 175
Pi;o Avg His. Tvp Asp Tn' Trp 1—eu Tlvt. Pi'o Gh、 Lys Asii Ala Val Pl'ie 180 185 190
Gly Gly Val, Leu Lys Ser Gly Ser Ser GW Tyr Ser Leu Ser Gly Asn 195 200 205
Leu Thr Asi Tyr Val Thr GI.y [le Cys Asp VaL [le Cys Ala Glu Ser 210 215 220
Pi-o Tyr Asp l,eu Asn Gly Ala Ser Asp Tyr Glu Leu Ser Pro Asp Gly
225 230
235
240
Sei' Lvs VaL Ala Phe Met Tlir Lvs Asp lie Gly Leu Pro Leu Ala Asn 245 250 255
Thr Tlir Ser Thr G:ln lie Tyr Leu Val Pro Phe Thi' Giy Thr A丄a Lys
260 265
270
Asp Ala VaL Pi.o [Le Asri Pro Arg Sei' Set' Ser Ala Lys Tyr Pro Glu
275 280
285
Ala Gin Gly Ala Ser Ala Ser Pro Phe Phe Ser Pto Asp Ser Ser Lys
290 295
300
lie Ala Tyr Val Gin Met Asn Gly lie Asn Tyr Glu Ser Asp Arg Ser
305
310 315
320
ILe Leu Tyr Val Ala Asp Ala Asn Gly Asp Lys Glu Lys Gly Phe Asn
325 330
335
:le Thr Arg Leu Ala. Giv Asp Trp Asp Arg Ala Pro Gly Ser Ala Us 340 345 350
Trp Ser His Asp G:l.y G].u Thr lie Tyi' Ala Asp Ala AJa Asp Leu Gly 355 360 365
His Ser Ai'g Val Phe Ala Val Pro Leu Thr A.la Gly Asp Ser Tyr VaJ 370 375 38i)
Pro Lys Asn lie Thr Asp G:l" GIt Ser Val A]a Gl.v Phe Tyr Pro Leu 385 390 395 400
Pro Asp Gly Ser Va'l L,eu Val Ser Asp Ser l,ys Ue Trp Ser Ser Arg 405 410 415
Asp lie His Tlir Val SeT' Gly Glu Gly l,ys Glv Ser Thr Lys Val Tyr 420 42^ 4i30
Phe G]n Ala Asn Leu A]a. Asp Ser Glu l'eu A.a G〗y(tǒng) Leu Ser Ser Ala 435 440 445
Asp Va.l Ser Glu Phe Tyr Tvr Ser Ser Asn Thr Thr Glu Asn Lys Gin 450 455 460
Gin Ala. 'hp Va.l lie Arg Pro Ala, Gly Phe Asp Ser Thr Lys Lys Tyr 465 470 475
Pro Leu Ala Phe lie Thr His Gly G丄v Pro Gin Gly Ala His Ser Asii 485 490 495
Thr Trp Ser Thr Arg Trp Asn Phe Lvs Val Trp Ala. Asp G.ln G]v Tyr 500 5i)5 510
Val Val Val Ala Pro Asn Pro Thr Ala Ser Thr Gly Phe Gly Gin Asn 515 520 525
Leu Thr A印Ala Val Ser Gly Arg Trp Arg Thr Va.l Tyr Trp Asp lie 530 540
Val His Ala Trp Glu Tyr Val Arg A印Asn Leu Asp Tyr Val Asp Thr
545 550 555
560
Glu Asn G].y lie Glu Ala G丄y Ala Ser Phe Gly Gly Tvr Met Thr Asn 565 570 575
Tyr Ue Gin G.l.y Gin Pro Leu Gly Arg Glu Phe Lys Ala Leu Val Thr 580 585 590
His Asp Gly Val Thr Ser Thr Leu Asn Gin Tvr Ala Thr Asp Glu Leu 595 600 605
Trp Phe Met Asn His Asp Phe Asn Gly Pro Phe Asn GJti Ser Ser Asn 610 615 620
Glu Pro Gly Ser Pro Tyr Tvi' Asp Trp Asn Pro Leu Arg T，,r lie Asp 625 6i30 635 640Asn Tip Ala Thr Pro His Phe Val lie His Asn Asp Leu Asp Tvr Arg 645 650 655
Leu Pro Val Ser Glu Gly Val Met Leu Phe Asn Leu Leu Gn Val L,ys 660 665 670
Gly Val Pro Ser Lys Phe l,eu Asn Phe Pro Asp Glu Asn His Trp Va] 675 680 685
Thr Lys Pro G]u Asn Sei' Leu Val Trp His Thr Glu lie Plie Asn Phe
695 700
lie Asn Tyr Tvr Ser Gly Val Asp Asn Ser Thr Ser Pro Phe 705 7li) 71權(quán)利要求
1、一種稻瘟菌激發(fā)子CSB I基因，其特征在于所述基因編碼的核苷酸序列，cDNA全長序列如SEQ ID NO1，氨基酸序列如SEQ IDNO2。
2、 權(quán)利要求1所述稻瘟菌激發(fā)子CSBI基因的克隆方法，其特 征在于包括以下步驟(1) 稻瘟病菌生理小種菌株培養(yǎng)后提取總RNA;(2) 以(1)總RNA為模板，釆用RT-PCR法合成cDNA第一鏈； 利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)克隆得到稻瘟病菌生理小種CSB I激發(fā) 子的推導(dǎo)cDNA序列。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述稻始:菌激發(fā)子CSB I基因的克隆方法， 其特征在于步驟(1)所述稻瘟病菌生理小種菌株為稻媼病菌ZC13 生理小種。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述稻瘟菌激發(fā)子CSB I基因的克隆方法， 其特征在于步驟(1)所述菌株培養(yǎng)為在培養(yǎng)基中25"C培養(yǎng)4天。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述稻瘟菌激發(fā)子CSB I基因的克隆方法， 其特征在于所述培養(yǎng)基為采用酵母浸膏5g和葡萄糖22g用水定容至 lOOOmL，于121。C滅菌20min。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所述稻瘟菌激發(fā)子CSB I基因的克隆方法， 其特征在于步驟(2)包括以下步驟(a)設(shè)計(jì)兩條上游簡并引物P33A和P39A，進(jìn)行所述稻瘟病菌 ZC13生理小種總RNA的3， RACE,得到CSB I基因cDNA的3，端的片段；(b) 在cDNA的3，端設(shè)計(jì)一特異引物P5B，并根據(jù)3'端序列 與稻瘟菌全基因組數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果，在同源性最高的假定蛋白 hypothetical protein MG07877. 4的cDNA編碼序列的5，端設(shè)計(jì)一 特異引物P5endA，將其分別作為下游和上游引物擴(kuò)增cDNA的5'端, 得到CSB I基因cDNA的5，末端片段;(c) 3'和5'末端拼接得到序列；用3'端序列設(shè)計(jì)特異引物 P3endB，與P5endA擴(kuò)增由P3endB反轉(zhuǎn)錄稻瘟菌ZC13生理小種總 RNA得到的cDNA，驗(yàn)證拼接得到序列。
7、 根據(jù)權(quán)利要求7所述稻瘟菌激發(fā)子CSB I基因的克隆方法， 其特征在于步驟(a)所述引物分別為<formula>formula see original document page 3</formula>.
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述稻瘟菌激發(fā)子CSB I基因的克隆方法， 其特征在于歩驟(b)所述特異引物分別為<formula>formula see original document page 3</formula>.
9、 根據(jù)權(quán)利要求7所述稻瘟菌激發(fā)子CSB I基因的克隆方法， 其特征在于步驟(c)所述引物為<formula>formula see original document page 3</formula>.
全文摘要
本發(fā)明公開了一種稻瘟菌激發(fā)子CSB Ⅰ基因及其克隆方法，所述基因編碼的核苷酸序列，cDNA全長序列如SEQ ID NO1，氨基酸序列如SEQ ID NO2。根據(jù)已測的CSB Ⅰ激發(fā)子的肽端編碼序列設(shè)計(jì)引物，以稻瘟病菌ZC₁₃生理小種總RNA為模板，采用RT-PCR方法，合成cDNA第一鏈，利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)克隆得到了稻瘟病菌ZC₁₃生理小種CSB Ⅰ激發(fā)子的推導(dǎo)cDNA序列。本發(fā)明能作為廣泛、大量研究激發(fā)子誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生抗病性的機(jī)制的基礎(chǔ)，并供研究水稻轉(zhuǎn)基因育種使用。
文檔編號(hào)C12N15/29GK101186917SQ20071003205
公開日2008年5月28日 申請日期2007年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月4日
發(fā)明者李云鋒, 王振中, 童英林, 紀(jì)春艷, 董章勇 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)