專利名稱：一種云芝多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的云芝多糖的制備方法。
背景技術(shù)：
云芝(CorioA^^rw'cWor)是我國珍貴的中草藥資源，云芝菌絲體內(nèi)和體外均可以產(chǎn) 生云芝多糖(Coriolus versciolor polysaccharides, CVP)，這是一種含蛋白質(zhì)的糖肽復(fù)合 物，主要成分是以》(1， 4)、 " (1， 3)或"(1， 4)、萬(1， 6)為主的葡聚糖復(fù)合物， 上有- (1， 3)或"(1， 6)結(jié)合的發(fā)分支，多糖含量30% 60%，結(jié)合蛋白15%。
云芝多糖能激活免疫細(xì)胞，提高機(jī)體免疫功能，明顯改善機(jī)體炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度，具有抗 腫瘤、抗?jié)儭⒔笛?、保肝等多種生物活性，具有抗細(xì)菌、霉菌及病毒的功能，可刺激巨 噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，增加血液里的白細(xì)胞介素l，干擾素Y及腫瘤壞死因子的作用，能抑制癌細(xì)胞 生成，是安全性高，生物活性強(qiáng)的人或動(dòng)物的免疫增強(qiáng)劑，更可作為健康食品的添加劑。
目前云芝多糖提取的方法按提取溶劑的不同主要分為水浸提法、酸提法、堿提法等，雖 然酸提法和堿提法提取云芝多糖的最高得率與水浸提法相比差別不大，但是會(huì)嚴(yán)重地污染環(huán) 境，而水浸提法則在生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)成本、產(chǎn)品安全性以及環(huán)保等方面有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。
目前的水浸提法常采用加熱煮沸云芝子實(shí)體的方法來提取云芝多糖，僅此過程需要5 10h，甚至更長(zhǎng)的時(shí)間，浸提液用量較大，有時(shí)高達(dá)30倍，在提取過程中要消耗大量能源， 且云芝多糖的得率只有7. 81%左右。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于開發(fā)出一種能獲得高產(chǎn)率高含量的云芝多糖的新的制備方法。 我們通過將云芝菌絲體浸入4倍熱水中浸提至少兩次，再用乙醇沉淀得到粗多糖，再除
蛋白，脫色，干燥，得到的云芝多糖的得率至少在8%以上，提純后的多糖含量在40%以上，
從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
本發(fā)明的一種云芝多糖的制備方法，包括以下的步驟
(1) 將云芝菌絲體按質(zhì)量比1:4，浸入加了質(zhì)量分?jǐn)?shù)2. 0%船20)3的90°C熱水中，浸提l 2h ,反復(fù)浸提過濾2 3次，然后合并浸提液并濃縮至原體積的1/5 1/3;
(2) 步驟(1)得到的濃縮提取液中加入體積為濃縮提取液3 4倍的乙醇，靜置沉淀 24h后過濾，沉淀部分25T烘干得到粗多糖；
(3) 步驟(2)得到的粗多糖用7(TC熱水溶解，加入其水溶液體積的1/5氯仿和氯仿體 積l/5的正丁醇，劇烈振蕩至生成凝膠物，離心分離收集上清液，除去下層變性蛋白和氯仿；
(4) 將步驟(3)得到的上清液調(diào)制至含粗多糖5%的水溶液，用NaOH調(diào)到PH=9. 0，于50°C 水浴中，滴入體積為粗多糖水溶液的15%,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的比02溶液，保持pH為8. 0 9. 0， 持續(xù)水浴4h后終止反應(yīng)，緩緩加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%乙醇，置冰箱過夜，次日收集沉淀，干燥， 得到產(chǎn)物。
步驟(1)所述的云芝菌絲體可以通過過濾云芝菌絲發(fā)酵液得到，最好浸入熱水中2h,所 述的熱水中加入Na2C03，可防止多糖降解。
步驟(3)所述的振蕩時(shí)間最好是20 30min，所述的離心分離條件最好是轉(zhuǎn)速4000r/min， 持續(xù)15min。
步驟(4)所述的干燥最好釆用真空冷凍干燥。
本發(fā)明的制備方法能顯著提高云芝多糖的得率，并明顯縮短操作時(shí)間，降低能源的消耗， 在較小的生產(chǎn)成本下可保證大批量生產(chǎn)獲得活性較高的云芝多糖，從而使云芝多糖能在較大 的工業(yè)化程度上實(shí)現(xiàn)商品化。


圖l:云芝菌絲體提取物的紫外吸收光譜。 圖2:葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:
稱取云芝菌絲體凈重122. 13g (烘干重16.22g)，加入125mL純凈水后粉碎，添加水至 350niL，然后加入7gNa2C03， 9(TC水浴2h后，反復(fù)浸提過濾2次，然后取浸提液濃縮至原體 積的1/5。將得到的濃縮液200mL加入3倍體積的95W乙醇進(jìn)行沉淀，靜置24h后過濾，沉淀 部分烘千得到粗多糖。加入70。C熱水200mL溶解粗多糖，加入40mL氯仿，8mL正丁醇，劇烈 振蕩20min，生成凝膠物，在離心機(jī)上4000r/min離心過濾15min，收集上清液，除去下層變 性蛋白和上層氯仿，得到溶液130mL。用NaOH調(diào)節(jié)pH值至9. 0，加入15%H20220mL，然后再 50。C水浴4h，并緩慢加入95%乙醇150mL。 4'C冰箱過夜，次日4000r/min， 20min離心過濾， 收集沉淀，真空干燥，得到白色粉末1.432g，得率8.83%。
實(shí)施例2:實(shí)施例1得到的產(chǎn)物的紫外吸收光譜測(cè)定
紫外掃描儀HITACHI (日本)對(duì)樣品水溶液進(jìn)行190~360nm的紫外掃描，以確定是否是 蛋白結(jié)合多糖，測(cè)定結(jié)果見附圖1，云芝多糖是一種含蛋白質(zhì)的糖肽復(fù)合物。從上圖可以看 出在260nm處無吸收，在270-280nra左右有一肩形峰，這是蛋白結(jié)合多糖的特征吸收。 實(shí)施例3:實(shí)施例1得到的產(chǎn)物的云芝多糖含量測(cè)定 準(zhǔn)確稱取標(biāo)樣葡萄糖20mg于50(kL容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2、 1.4、 1.6、 1.8mL，分別以水補(bǔ)至2.0mL，然后加入5%苯酚1. OmL及濃硫酸 5.0mL，靜置10min，搖勻，30。C水浴20min。后于490nm測(cè)光密度值(OD)， 2.0mL水為空白。
橫坐標(biāo)為葡萄糖濃度，縱坐標(biāo)為0D值，繪標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(見附圖2)，進(jìn)行線形回歸，得回歸 方程式y(tǒng)=0.0146x+0.0103， R2=0.9984。吸取樣液1.0ml，操作步驟同上，重復(fù)三次，測(cè)0D 值分別為0.2983、 0.2901、 0.2956，取其平均值，査標(biāo)準(zhǔn)曲線。云芝多糖與葡萄糖含量的校 正系數(shù)為2.5，經(jīng)計(jì)算，提純后多糖含量為48.69%。
權(quán)利要求
1.一種云芝多糖的制備方法，包括以下的步驟(1)將云芝菌絲體按質(zhì)量比1∶4，浸入加了質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0％Na2CO3的90℃熱水中，浸提1～2h，反復(fù)浸提過濾2～3次，然后合并浸提液并濃縮至原體積的1/5～1/3；(2)步驟(1)得到的濃縮提取液中加入體積為濃縮提取液3～4倍的乙醇，靜置沉淀24h后過濾，沉淀部分25℃烘干得到粗多糖；(3)步驟(2)得到的粗多糖用70℃熱水溶解，加入其水溶液體積的1/5氯仿和氯仿體積1/5的正丁醇，劇烈振蕩至生成凝膠物，離心分離收集上清液，除去下層變性蛋白和氯仿；(4)將步驟(3)得到的上清液調(diào)制至含粗多糖5％的水溶液，用NaOH調(diào)到pH＝9.0，于50℃水浴中，滴入體積為粗多糖水溶液的15％，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15％的H2O2溶液，保持pH為8.0～9.0，持續(xù)水浴4h后終止反應(yīng)，緩緩加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)95％乙醇，置冰箱過夜，次日收集沉淀，干燥，得到產(chǎn)物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種云芝多糖的制備方法，其特征在于步驟(1)熱水中浸提 的時(shí)間為2h，步驟(3)所述的振蕩時(shí)間是20 30min，所述的離心分離條件是轉(zhuǎn)速4000r/min ， 持續(xù)15min，步驟(4)所述的干燥采用真空冷凍干燥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的云芝多糖的制備方法，其特征是將云芝菌絲體按質(zhì)量比1∶4浸入熱水中，反復(fù)浸提過濾2次，然后合并浸提液并濃縮至原體積的1/3～1/5，然后加入乙醇，靜置沉淀后過濾，沉淀部分烘干得到粗多糖，粗多糖用熱水溶解后加入氯仿和正丁醇，劇烈振蕩至生成凝膠物，離心分離收集上清液，用NaOH調(diào)到pH＝9.0，于50℃水浴中，滴入H₂O₂，保持pH為8.0～9.0，持續(xù)水浴4h后終止反應(yīng)，緩緩加入乙醇，置冰箱過夜，次日收集沉淀，干燥，得到產(chǎn)物。本發(fā)明的能顯著地提高云芝多糖的得率，并明顯縮短操作時(shí)間，降低能源的消耗，在較小的生產(chǎn)成本下可保證大批量生產(chǎn)獲得活性較高的云芝多糖，從而使云芝多糖能在較大的工業(yè)化程度上實(shí)現(xiàn)商品化。
文檔編號(hào)A23L1/28GK101181052SQ20071003247
公開日2008年5月21日 申請(qǐng)日期2007年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月14日
發(fā)明者付天璽, 吳月嫦, 鵬 孟, 江永明, 許國煥, 全 龔 申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所;廣東碧德生物科技有限公司