專利名稱：：一種具有抗白血病作用的miR-21反義寡核苷酸及其應(yīng)用的制作方法1451122.36812.23680.524.47362.101145366.3526.63520.513.27041.695146977.0327.70320.515.40641.453147174.9687.49680.514.99361.3611473240.10424.01040.548.02081.452147437.363.7360.57.4721.185147584.1448.41440.516.82881.2721481128.88812.88880.525.77761.4561482132.15213.21520.526.43041.501148495.4569.54560.519.09121.561148891.6169.16160.518.32321.546148981.7128.17120.516.34241.3151492261.78426.17840.552.35681.21495132.26413.22640.526.45281.303149656.5445.65440.511.30881.4461503300.430.040.560.081.147150439.2563.92560.57.85121.132150754.1285.41280.510.82561.432151498.7529.87520.519.75041.397151773.7047.37040.514.74081.2841530341.18434.11840.568.23681.2210810.80.521.61.3761536106.55210.65520.521.31041.52154249.2724.92720.59.85441.212154688.6888.86880.517.73761.056154766.2086.62080.513.24161.3725,-tcaac^ltcagtctg^ltaaLgcta-3,(22bp)s所述的具有抗白血病作用的miR-21反義寡核苷酸可以經(jīng)過不同的化學修飾，如甲氧修飾、硫代修飾等。本發(fā)明的另一目的是提供這種具有抗白血病作用的miR-21反義寡核苷酸在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用。所述的應(yīng)用是將所述的核苷酸按本領(lǐng)域常用的方法制成各種制劑。本發(fā)明所述的具有抗白血病作用的miR-21反義寡核苷酸的序列是根據(jù)白血病細胞K562中的miR-21序列設(shè)計的反義寡核苷酸序列(Antisense-micro,s-oIigo歐leotides，AMO)。所以相對應(yīng)地，5'-tcaacatcagtctgataagcta-3'在本發(fā)明中稱為扁-miR-21。本發(fā)明所述的具有抗白血病作用的miR-21反義寡核苷酸能夠有效地抑制白血病細胞中的miR-21和miR-181a這兩種基因的表達，促迸白血病細胞凋亡，從而能夠有效地治療白血病。并且抑制效果呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，經(jīng)實驗證明，AMO濃度為0.6nmol/L時對白血病細胞生長的抑制效果為最佳。圖1為不同濃度AM0對白血病細胞K562的生長抑制作用(72h)圖。圖2至圖5為AM)(0.6nmol/L)作用于白血病細胞K56224h對細胞周期的影響圖(其中p2:subG1;P3:GQ/G1;P4:S;P5:G2/M，圖2為隨機對照組，圖3為空白對照組，圖4為AMO-miR-181a組，圖5為AMO-miR-21組)。圖6至圖9為AM0(0.6iimol/L)作用于白血病細胞K56248h對細胞周期的影響圖(其中P2:subG1;P3:G。/G1;P4:S;P5:G2/M，圖6為AMO-mfR-21組，圖7為AMO-miR_181a組，圖8為空白對照組，圖9為隨機對照組)。圖10為miR-21的標準曲線圖(CT值為8.30、13.00、17.07、20.98、25.36、28.57)。圖11是不同時間AMO對白血病細胞K562的生長抑制作用(0.6umol/L)圖。具體實施方式實施例1本發(fā)明的具有抗白血病作用的miR-21反義寡核苷酸(以下簡稱AMO)的制得白血病細胞K562的miR-21序歹寸為5'-uagcu腳cag腦gaugu卿c-3'(23bp);miR-181a序歹ij為5,-aaceiuucaacgcugucggugagu-3'(23bp)。針對白血病細胞K562的miR-21設(shè)計其反義寡核苷酸，并采用BLAST軟件進行分析，比對后得序列如SEQM).1所示5'-tcaacatcagtctgataagcta-3'(22bp)(以下稱為AMO-miR-21)，針對白血病細胞K562的miR-181a設(shè)計其反義寡核苷酸，并采用BLAST軟件迸行分析，比對后得序列如SEQNO.2所示5'-actcaccgacagcgttgaatgtt-3'(23bp)(以下稱為層(HidR-181a)0以上兩種反義寡核苷酸序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，全硫代修飾，PAGE純化，于-2(TC保存。用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基溶解配制成100umol/L儲存溶液，置-20°(:備用，用時稀釋成所需的使用濃度。實施樹2本發(fā)明的miR-21和miR-18Ia反義核苷酸對白血病細胞K562的抑制作用和誘導凋亡作用1、主要試劑Lipofectamine2000invi加gen公司美國antisensemicroRNAs上海生工生物工程有限公司中國瓊脂糖Promega公司美國羥乙基哌嗪乙磺酸Gibco公司美國RPMI-1640培養(yǎng)基粉Gibco公司美國RPMI-1640液體培養(yǎng)基展晨生物公司中國新生牛血清杭州四季青生物工程公可中國青霉素、鏈霉素華北制藥公司中國胰酶(Trypsin)Sigma公司美國CCK-8細胞計數(shù)試劑盒曰本同仁化學研究所曰本臺盼藍(TypanBlue)&靜3公司美國1000jiL,200nL，10nLTipsAxygen公司美國1.5mL，0.2mLEP管Axygen公司美國RNA酶Sigma公司美國碘化丙錠(PI)Sigma公司美國2.試劑配制2.1Lipofectamine2000:4。C保存。2.2Antisense-microRNAs-oligo羅leotides(腦)設(shè)計實施例1中所述的針對白血病細胞K562中miR-21和miR-181a的反義寡核苷酸序列AMO-miR-21和AMO-miR-181a:序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，全硫代修飾，PAGE純化，于-2CTC保存。用無血清的RPMT-1640培養(yǎng)基溶解配制成100nmol/L儲存溶液，置-2CTC備用，用時稀釋成所需的使用濃度。2.3含酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基RPMI-16鄰干粉(10.4g/包)，用三蒸水溶解，加入碳酸氫鈉2.0g，HEPES5.0g，磁力攪拌儀充分攪拌，定容至I000mL，過濾除菌，分裝，4。C保存。2.4RPMI-1640液體培養(yǎng)基過濾除菌，分裝。2.5新生牛血清56eC、30min滅活，分裝于25mL小瓶中，-20°C保存。配制新鮮RPMI-1640液時，每180mL培養(yǎng)液加入血清20mL，使最終細胞培養(yǎng)液中血清的體積分數(shù)為10%。2.60.2%臺盼藍工作液稱取0.2g臺盼藍粉，用100mLPBS(pH7.2)溶解。2.7■酶配制成10mg/mL的儲存液，-2(TC保存，使用時配制成工作液濃度。2.8碘化丙啶(PD染液稱取20pg碘化丙啶，加入IOOOmL生理鹽水，即20ug/L濃度，分裝，4°C避光保存。3主要儀器3.1DL-2型臺式低速離心機(北京醫(yī)用離心機廠)3.2C02培養(yǎng)箱(ThermoForma,美國)3.3超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)3.4微量加樣器(0.5-10uL,1-20uL,10-100"L,50-200iiL，200-1000PL，Eppendorf,德國)3.5DS-IB倒置顯微鏡(重慶光學儀器廠)3.6NeubauerImproved細胞計數(shù)板(CarlRothGmbH&Co.KG，德國)3.7流式細胞儀(Elite,Coulter公司，美國)4實驗方法(1)細胞培養(yǎng)白血病細胞K562用含10%新生牛血清RPMT-1640培養(yǎng)基于37°C、體積分數(shù)為5%0)2培養(yǎng)箱，飽和濕度條件下培養(yǎng)，0.25%的胰酶常規(guī)消化傳代，2-3天傳代一次。實驗選用對數(shù)生長期、0.2%臺盼藍拒染率>95%的細胞接種于培養(yǎng)板，加入Lipofectamine"2000-AM0反義核酸，每組藥物均設(shè)3個復孔。(2)Lipofectamine2000與AM0復合物的配制單獨的AM0-miR對細胞的轉(zhuǎn)染效率不高，需要一種合適的轉(zhuǎn)染載體介導才能提高AMO-miR的作用效果使之進入細胞發(fā)揮更好的作用效果。我們采用Lipofectamine2000來作為轉(zhuǎn)染載體。Lipofectamine2000與AMO按質(zhì)量比為2.5:1配制，即取所需AMO量，計算所需Lipofectamine2000的量，分別用無血清培養(yǎng)液配制，將Lipofectamine2000緩慢加入AMO中，充分混勻，室溫靜置30min，即得Lipofectamine2000-AMO復合物。(3)臺盼藍拒染法檢測AMO對白血病細胞K562生長的抑制作用取對數(shù)生長期白血病細胞K562，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為5X104cells/mL接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100(每孔5000個細胞)，加入藥物后終體積為150piL。實驗分為4組AMO-miR-2I組、AMO-miR-181a組、隨機對照組組、空白對照組Lipofectamine2000與AMO的質(zhì)量比為2.5:1，白血病細胞株K562每組AMO終濃度均分別為0.1拜ol/L、0.2拜ol/L、0.3nmoi/L、0.6nmoI/L,空白對照組加入與藥物同體積的血清RPMI-1640培養(yǎng)基，脂質(zhì)體對照組加入與藥物同體積同濃度的Lipofectamine2000，置37°C，體積分數(shù)為5%C02培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)染6h，加入含血清培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24h、48h、72h。選AMO終濃度均為0.6pimol/L，空白對照組加入與藥物同體積的血清RPMI-1640培養(yǎng)基，脂質(zhì)體對照組加入與藥物同體積同濃度的Lipofectamine2000，置37。C，體積分數(shù)為5%C02培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)72h。(4)PI單染流式細胞儀檢測經(jīng)AMO作用后，K562細胞周期及亞二倍體峰百分率變化情況取對數(shù)生長期白血病細胞K562用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1.2X105cellS/mL，接種于24孔培養(yǎng)板，各組均設(shè)四復孔。加入無血清含AMO的RPMI-1640培養(yǎng)液后，每孔終體積500nL，置孵箱轉(zhuǎn)染6h后，每孔加入500uL含20%血清RPMI-1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。共設(shè)4組AMO-miR-181a、AMO-miR-21組、隨機對照組和空白對照組。Lipofectamine2000與AMO的質(zhì)量比為2.5:1，每組AMO終濃度為0.6umol/L，空白對照組加入與藥物同體積的血清RPMI-1640培養(yǎng)基，脂質(zhì)體對照組加入與藥物同體積同濃度的LipofectamineTlt2000，分別培養(yǎng)24h、48h、72h，倒置顯微鏡下觀察后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化收集細胞，預冷PBS洗滌3次后，用70%(v/v)乙醇于4T固定過夜。上機前用預冷PBS洗滌3次后，加入碘化丙錠染色液(含RM酶)，終濃度50Pg/mL,避光染色30min,流式細胞儀分析細胞DNA含量的變化，每個樣本隨機分析5000個細胞，得到各組細胞亞二倍體峰百分率和各組細胞生長周期比樹。(5)統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)土標準差(x土s)表示，使用統(tǒng)計軟件SPSS11.5，各組均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-wayAN0VA)。p〈0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。(6)實驗結(jié)果實驗發(fā)現(xiàn)，對于白血病細胞K562，AMO-miR-21和AMO-miR-181a在濃度為0.2pM時即發(fā)揮了抑制作用；0.3拜ol/L，0.6^mol/L時抑制效果更明顯，最佳作用濃度為0.6拜ol/L，呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。終濃度0.6拜ol/L的AMO-miR-21和AMO-miR-181a轉(zhuǎn)染白血病細胞K56272h時，與隨機對照組相比較，對細胞生長產(chǎn)生明顯的抑制作用，且隨著作用時間的增加，其抑制效果逐漸增強(如圖1所示)。終濃度為0.6拜ol/L的AMO作用于白血病細胞K562，AMO-miR-21和AMO-miR-181a在培養(yǎng)48h時開始對細胞的生長出現(xiàn)抑制作用，且隨著作用時間的增加，其抑制效果逐漸增強。72h時作用效果十分明顯，有明顯的時效關(guān)系(如圖II所示)。流式細胞儀分析各組DNA含量的細胞周期分析圖中，P2峰代表亞二倍體峰，代表DNA含量不足二倍體的細胞，用來估計凋亡細胞的比例;P3峰代表處于G。/G,期的細胞，P4峰代表處于S期的細胞，P5峰代表處于G2/M期的細胞。AMO轉(zhuǎn)染白血病細胞K56224h、48h、72h后(AMO終濃度為0.6Pmol/L),與隨機對照組相比，AMO-miR-21組和AMO-miR-181a組凋亡峰十分明顯，有顯著的統(tǒng)計學差異(尸〈0.05)(見表l)，細胞周期中各時期所占細胞周期的比例如表2所示。表IAMO(0.6umol/L)作用于白血病細胞K562不同時間亞二倍體峰所占細胞周期的比例(％，5±S，77=3)空白對照組隨機對照組AMOmiR-21組AMO-miR-181a組*與隨機對照組相比較，尸<0.05表2AM0(0.6ymol/L)作用于白血病細胞K562不同時間對細胞周期的影響(％,^土S,/7=3)分組subGi(p2)Go/Gi(P3)S(P4)G2/M(M)24h空白對照組12.66±0.6552.24±2.7927.67±1.477.63±0.41隨機對照組15.39±0.8152.43±2.8125.94±1.326.72±0.36AMO-miR-21組19.68±1.01*49.39±2.6523.55±1.258.12±0.46AMO-miR-181a組22.39±1.16*51.27士2.7020.96±1.115.11±0.2748h空白對照組32綠1.6749.12±2.6323.65±1.267.99±0.45隨機對照組33.27±1.7650.61±2.6819.87±1.015.68±0.31AMO-miR-21組44.39±2.30*47.64±2.5215.58±0.814.33±0.26AMO-miR-181a組38.62±2.01*46.59±2.4715.01±0.783.39±0.1972h空白對照組18.52±0.9440.01±2.1221.31±1.096.57±0.37隨機對照組24.03±1.2340.24±2.1318.38±0"86.34±0.36AMOmiR-21組32.33±1.68*38.16±2.0214.65±0.782.67±0.14AMO-miR-181a組35.17±1.83*34.61±1.8918.13±0.988.04±0.45從上述結(jié)果可以看出AMO-miR-21與AMO-miR-181a可以有效促進白血病細胞K562的凋亡，從而抑制白血病細胞的生長。實施例3實時定量PCR技術(shù)檢測AM0作用腫癍細胞后microRNA的水平一實驗材料1主要試劑Lipofectamine2000Invitrogen公司美國antisensemicroRNAs上海生工生物工程有限公司中菌羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)Gibco公司美國RPMI-1640培養(yǎng)基粉Gibco公司美國RPMI-1640液體培養(yǎng)基展晨生物公司中國新生牛血清杭州四季青生物工程公司中國青霉素、鏈霉素華北制藥公司中國胰酶(Trypsin)Sigma公司美國臺盼藍(TypanBlue)公司美國1OOOnL,200nL,1OpLTipsAxygen公司美國1.5mL，0.2mLEP管Axygen公司美國實時定量PCR管Sigma公司美國DEPCSigma公司美國TrizolInvftrogen公司美國MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶Promega公司美國RnaseInhibitorPromega公司美國d證(10mM)Takara公司財RNase-fteeH20Takara公司日本Hairpin-it窗miRNAsReal-Time±^*瑪制，技術(shù)有^么、司中國PCRQuantitationKit2試劑配制2.ILipofectamine2000:4。C保存。2.2Antisense—micro咖As-oligonucleotides(AMO):AM)序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，全硫代修飾，PAGE純化，于-20。C保存。用無血清的RPMT-1640培養(yǎng)基溶解配制成100wmol/L儲存溶液，置-20nc備用，用時稀釋成所需的使用濃度。2.3含酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基RP1I-1640干粉(10.4g/包)，用三蒸水溶解，加入碳酸氫鈉2.0g，HEPES5.0g，磁力攪拌儀充分攪拌，定容至mOOmL，過濾除菌，分裝，4。C保存。2.4RPMI-1640液體培養(yǎng)基過濾除菌，分裝。2.50.2%臺盼藍工作液稱取0.2g臺盼藍粉末，用100mLPBS(pH7.2)溶解。2.60.25%胰酶-0.02%EDTA混合消化液稱取0.5g胰酶于燒杯中，用100mLD-Hanks液溶解，稱取EDTA0.04g于燒杯中，用100mLD-Hank，s液溶解，將溶解的胰酶-EDTA液體等體積混合。在超凈臺內(nèi)用0.20陶濾器過濾除菌，分裝至小瓶，-20。C凍存。2.7Hairpin_itmi腿sReal-TimePCRQuantitationKit-20°C保存。3主要儀器3.1DL-2型臺式低速離心機(北京醫(yī)用離心機廠)3.2C02培養(yǎng)箱(ThermoForma，美國)3.3超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)3.4微量加樣器(O.5-10yL，1-20uL，10-100uL，50-200uL，200-1000yL，Eppendorf，德國)3.5DS-IB倒置顯微鏡(重慶光學儀器廠)3.6NeubauerImproved細胞計數(shù)板(CarlRothGmbH&Co.KG，德國)3.7實時定量PCR擴增儀(Bio-rad公司，美國)3.8紫外分析儀(UVP叩land，美國)3.9超低溫冰箱(Forma702，美國)二實驗方法I實時定量PCR檢測方法(Hairpin-itmiRMsReal-TimePCRQuantitationKit):實驗選用針對miR-21設(shè)計的實時定量PCR檢測試劑盒，該試劑盒能夠高度特異地檢測miR-21在腫瘤細胞中的表達水平。Hairpin-itmiRNAsqPCRQuatitationAssay包括兩步①Stem-loopRT②Real—timePCR。在Stem-loopRT這一步中，Stem-loopRTprimer與miRNA分子的3'端結(jié)合，然后用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。Stem-lo叩RTprimer是針對miR-21特殊設(shè)計的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RT引物，由于設(shè)計的專一性，它只與miR-21結(jié)合而不與其他miRNA結(jié)合，保證了檢測的高特異性。而且這種莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RT引物只與成熟的miRNA結(jié)合，消除了miRNA前體的非特異性擴增。得到的RT產(chǎn)物與miR-21特異引物以及熒光標記的探針一起迸行優(yōu)化的Real-timePCR反應(yīng)，根據(jù)標準曲線可以定量分析PCR反應(yīng)中模板的拷貝數(shù)，從而反應(yīng)miR-21的表達水平。2細胞培養(yǎng)白血病細胞K562用含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37°C、體積分數(shù)為5%0)2培養(yǎng)箱，飽和濕度條件下培養(yǎng)，0.25%的胰酶常規(guī)消化傳代，2-3天傳代一次。實驗選用對數(shù)生長期、0.2%臺盼藍拒染率〉95%的細胞接種于培養(yǎng)板，加入LipofectamineTM2000-AM0反義核酸，每組藥物均設(shè)3個復孔。3Lipofectamine2000與AMO復合物的配制Lipofectandne2000與AM0按質(zhì)量比為2.5:1配制，即取所需AMO量，計算所需Lipofectamine2000的量，分別用無血清培養(yǎng)液配制，將Lipofectamine2000緩慢加入AMO中，充分混勻，室溫靜置30min，即得Lipofectamine2000-AMO復合物。4實時定量PCR技術(shù)檢測經(jīng)AMO作用不同時間，白血病細胞K562中microRNA的水平①細胞培養(yǎng)取對數(shù)生長期白血病細胞K562，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1.2X10Scells/mL，接種于24孔培養(yǎng)板，各組均設(shè)六復孔。24h后細胞貼壁達50%-70%時，吸盡培養(yǎng)液上清，更換無血清含AM0的RPMI-1640培養(yǎng)液，所有AM0復合物都是按質(zhì)量比2.5:1比例制備。每孔終體積500nL，置孵箱轉(zhuǎn)染6h后，每孔加入500PL含2(m血清RPMI-l:6鄰培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。共設(shè)4組AM0-miR-21組、AMO-miR-18la組、隨機對照組和空白對照組。Lipofectamine2000與AM0的質(zhì)量比為2.5:1，每組AMO終濃度為O.6umol/L，空白對照組加入與藥物同體積的血清RPMI-1640培養(yǎng)基，脂質(zhì)體對照組加入與藥物同體積同濃度的Lipofectamine1112000。②RNA提取分別培養(yǎng)48h、72h收集細胞，預冷D-hank，s液洗滌2次后，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化收集細胞，將每組細胞懸液收集到同一離心管中。1000r/min，離心8min，PBS洗二次，同樣條件離心，去上清，每管加入TRIzol1mL，加入200"L氯仿，充分震蕩，室溫靜止放置10min，12000/轉(zhuǎn)離心10min，吸取809&上清于另一EP管中，加入500uL異丙醇，混合均勻，10000r/min離心6分鐘，去上清，沉淀用1mL75%(v/v)乙醇洗滌后，10000r/min離心6分鐘，去上清，沉淀于超凈臺內(nèi)干燥3-5min，加入20-50iiLRNasefreeH20。提取后的各組總RNA經(jīng)紫外分析儀測吸光度并計算濃度后，調(diào)整成相同的濃度用來迸行下一步的RT反應(yīng)。提取的RNA均放入超低溫冰箱保存。③RT反應(yīng)合成cDNA:按照Hairpin-itmiRNAsReal-TimePCRQuantitationKit提供的說明書進行操作，反應(yīng)為25nL體系。5Xbuffer5uL;dNTPMixture(10mM)0.75yL;MIR-RTPrimers(1PM)1.25uL;RNasin(40U/PL)0.25uL;亂VReverseTranscriptase(200U/uL)0.5yL;RNAsample2yL;RNasefreeH2015.25PL。反應(yīng)參數(shù)16。C30min—42°C30min—85。C5min。反應(yīng)產(chǎn)物于-20。C保存。Real-TimePCR檢測各組cDNA樣品中miR-21，miR-181a的表達情況按照Hairpin-itmiRNAsReal-TimePCRQuantitationKit提供的說明書進行操作，反應(yīng)為20uL體系。2XReal-TimePCRMasterMix10uL;miRspecificPrimerset(5yM)0.8yL;micro,RTproduct2uL;TaqDNApolymerase(5U/uL)0.2uL;ddEA7uL。PCR反應(yīng)參數(shù)1.Incubateat94&Cfor00:03:002.Incubateat94°Cfor00:00:203.Incubateat50°Cfor00:00:254.PlateRead5.Incubateat72°Cfor00:00:206.Gotoline2for45moretimes7.Incubateat37&Cforever5統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)土標準差(矛土s)表示，使用統(tǒng)計軟件SPSS11.5，各組均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-wayAN0VA)，尸〈0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。6實驗結(jié)果終濃度為0.6umol/L的AM0作用于白血病細胞K56248h和72h，將所得到的模板同一批反應(yīng)進行實時定量PCR檢測。miR-21的標準曲線如圖IO所示，標準品的CT值分別為8.30、13.00、17.07、20.98、25.36、28.57，相關(guān)系數(shù)為0.998,相關(guān)性很好。均以miR-21的標準曲線為參照，K562細胞中不同AMO組raiR-21Ct僮如表3所示。經(jīng)統(tǒng)計學分析，與隨機對照組相比較，AMO作用于白血病細胞K56248h和72h時，miR-21在白血病細胞K562中的表達量有顯著的統(tǒng)計學差異(尸〈0.05)，K562細胞中不同AMO組miR-21分子相應(yīng)的摩爾數(shù)參看表4。表3AMO作用于白血病細胞K562不同時間miR-21的Ct僮比校Table3ComparisononmiR—21CTvalueofLeukemiacellsaftertreatmentwithAJK)atdifferenttimespoints(^土s,/7=3〉<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>*與隨機對照組組比，*P<0.05表4AM0作用于白血病細胞K562不同時間miR-21分子摩爾數(shù)比較Table4ComparisononmiR-21molesofLeukemiacellsaftertreatmentwithAMOatdifferenttimespoints(i±s,/=3)wmoles<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>*與隨機對照組組比，*尸<0.05從表3和表4的實驗結(jié)果可以看出，AMO-miR-21和AM0-miR-181a能夠顯著抑制白血病細胞K562的生長。SEQUENCELISTING〈110〉暨南大學〈120〉一種具有抗白血病作用的miR-21反義寡核苷酸及其應(yīng)用<160>2<170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉22<212>DNA〈213〉A(chǔ)MO-miR-21序列〈400〉1tcaacatcagtctgataageta22<210〉2〈211〉23<212>DNA<213〉A(chǔ)MO-miR-181a序列〈400〉2actcaccgacagcgttgaatgtt2權(quán)利要求1、一種具有抗白血病作用的miR-21反義寡核苷酸，其特征是，包含如下所示堿基序列5′-tcaacatcagtctgataagcta-3′。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有抗白血病作用的miR-21反義寡核苷酸，其特征是，所述反義寡核苷酸經(jīng)過化學修飾。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種具有抗白血病作用的miR-21反義寡核苷酸，其特征是，所述的反義寡核酸經(jīng)過硫代修飾。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種具有抗白血病作用的miR-21反義寡核苷酸，其特征是，所述的反義寡核酸經(jīng)過甲氧修飾。5、權(quán)利要求14任意一項所述的具有抗白血病作用的miR-21反義寡核苷酸在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種具有抗白血病作用的miR-21反義寡核苷酸及其應(yīng)用，本發(fā)明所述的具有抗白血病作用的miR-21反義寡核苷酸，包含如下所示堿基序列之一5′-tcaacatcagtctgataagcta-3′。本發(fā)明所述的具有抗白血病作用的microRNA反義寡核苷酸能夠有效地抑制白血病細胞K562中的miR-21和miR-181a這兩種基因的表達，促進白血病細胞凋亡，從而能夠有效地治療白血病。并且對白血病細胞K562的抑制效果呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。文檔編號C12N15/11GK101215560SQ200710032809公開日2008年7月9日申請日期2007年12月26日優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日發(fā)明者蘭菲菲,譽劉,嘉費申請人:暨南大學