專利名稱：苯致再生障礙性貧血相關(guān)抗原特異TCR Vα19亞家族的Y基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個(gè)T細(xì)胞受體(TCR)的核苷酸序列，特別是指一種苯致再生障礙性貧血(AA)相關(guān)抗原特異TCRVα19亞家族的Y基因序列。

背景技術(shù)：
苯是目前應(yīng)用最為廣泛的化工原料和工業(yè)溶劑之一。我國(guó)職業(yè)接苯工人達(dá)50萬以上，占各種化學(xué)物職業(yè)接觸人數(shù)之首。國(guó)際癌癥研究署(IARC)和美國(guó)環(huán)境保護(hù)局(EPA)都將苯列為確證的人類致癌物。我國(guó)學(xué)者與美國(guó)國(guó)家癌癥研究所(NCI)合作對(duì)中國(guó)74828名接苯工人和3580名對(duì)照工人進(jìn)行的隊(duì)列研究證明，接苯工人發(fā)生血液淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤，如再生障礙性貧血(AA)、骨髓增生異常綜合征MDS)或白血病的相對(duì)危險(xiǎn)性明顯增加。
再生障礙性貧血是血液系統(tǒng)的一種常見病，由多種因素引起骨髓造血功能衰竭，以全血細(xì)胞減少為主要臨床表現(xiàn)的綜合征。其病因及發(fā)病機(jī)制至今雖未完全闡明，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為AA的病理機(jī)制高度異質(zhì)，大致歸為以下三點(diǎn)1、造血干細(xì)胞本身缺陷；2、造血微環(huán)境的損傷；3、機(jī)體異常免疫對(duì)造血的損傷。研究表明再生障礙性貧血患者發(fā)病的免疫機(jī)制中T淋巴細(xì)胞是主要效應(yīng)細(xì)胞。分子免疫學(xué)證據(jù)表明AA患者存在T細(xì)胞克隆性或寡克隆性活化增殖。國(guó)內(nèi)外對(duì)AA患者淋巴細(xì)胞異?？寺U(kuò)增的研究主要是集中在TCRβ亞家族的錄用情況，認(rèn)為多克隆淋巴細(xì)胞被高度擴(kuò)張的寡克隆淋巴細(xì)胞取代是再障發(fā)病起始階段主要致病原因之一。
上世紀(jì)90年代中期，第一個(gè)特異性CDR3單抗成功應(yīng)用于治療I型糖尿病小鼠。目前，國(guó)外已將針對(duì)CDR3的特異性單抗的應(yīng)用于自身免疫性疾病的治療中。但有關(guān)職業(yè)接苯人群中TCRα亞家族及其互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)，即與抗原特異性識(shí)別結(jié)合的部位的研究資料較少。進(jìn)一步了解苯致AA患者細(xì)胞免疫紊亂的始動(dòng)因素為AA免疫方面的研究提供新思路，同時(shí)可將所獲得的T細(xì)胞克隆作為阻斷靶點(diǎn)，為AA免疫抑制治療提供依據(jù)。


發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種苯致再生障礙性貧血相關(guān)抗原特異TCRVα19亞家族的Y基因序列。
本發(fā)明從苯致再生障礙性貧血患者外周血中存在T細(xì)胞受體(TCR)Vα亞家族的克隆性T細(xì)胞，經(jīng)序列分析顯示其特異性TCR序列的高度可變區(qū)V-N-J區(qū)，即互補(bǔ)決定區(qū)3(CDR3)，與抗原特異性識(shí)別結(jié)合的部位，表明該克隆性T細(xì)胞所表達(dá)的TCR為苯致再生障礙性貧血相關(guān)抗原刺激所產(chǎn)生的特異性TCR，獲得了苯致再生障礙性貧血相關(guān)的TCR基因序列。
本發(fā)明公開了針對(duì)苯致再生障礙性貧血相關(guān)抗原的特異性TCR的基因序列，尤其是TCR的高度可變區(qū)即CDR3，后者是T細(xì)胞表面受體識(shí)別抗原的特異區(qū)域，針對(duì)于不同抗原，除了機(jī)體所選用的TCRVα亞家族T細(xì)胞不同，更為關(guān)鍵的是其TCR基因的CDR3序列的差異，該部位決定了所屬T細(xì)胞所能識(shí)別的抗原。本發(fā)明提供了一種識(shí)別苯致再生障礙性貧血相關(guān)抗原的TCRVα19基因序列，由于其CDR3的特異性，僅來自于單一克隆的T細(xì)胞，是一高度特異的序列。同時(shí)，根據(jù)CDR3的基因序列編碼的蛋白質(zhì)，可用來了解職業(yè)接苯后的相關(guān)抗原肽，為了解苯致再生障礙性的生物學(xué)特性提供資料。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述基因序列的應(yīng)用，通過苯致再生障礙性貧血相關(guān)抗原特異的TCR基因制備對(duì)抗確定的特異性抗原的單抗，從而具備了發(fā)揮相應(yīng)特異性去除苯致再生障礙性貧血中異常增殖的T細(xì)胞克隆。
根據(jù)所獲得的接苯后相關(guān)抗原的特異性TCR的核苷酸序列，可以用于(1)了解職業(yè)接苯人群所存在的TCRVα19亞家族T細(xì)胞的情況，用于評(píng)價(jià)病人的免疫功能狀態(tài)，早期發(fā)現(xiàn)可能的不良效應(yīng)、篩檢易感人群等方面及時(shí)提供信息。(2)借助所獲得的T細(xì)胞克隆，尋找接苯后引起AA的抗原，并采用TCR特異性單抗及TCR DNA疫苗選擇性地取出異常T細(xì)胞克隆從而靶向治療AA。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種苯致再生障礙性貧血相關(guān)抗原特異TCRVα19亞家族的Y基因序列，所述基因序列如下所示 GTAAGTGCCGCCAAAAATGAAGTGGAGCAGAGTCCTCAGAACCTGACTGCCCAGGAAGGAGAATTTATCACAATCAACTGCAGTTACTCGGTAGGAATAAGTGCCTTACACTGGCTGCAACAGCATCCAGGAGGAGGCATTGTTTCCTTGTTTATGCTGAGCTCAGGGAAGAAGAAGCATGGAAGATTAATTGCCACAATAAACATACAGGAAAAGCACAGCTCCCTGCACATCACAGCCTCCCATCCCAGAGACTCTGCCGTCTACATCTGTGCTGTGAATTATGGAGGAAGCCAAGGAAATCTCATCTTTGGAAAAGGCACTAAACTCTCTGTTAAACCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATG。
其中，Y基因序列為507個(gè)bp1-276bp為V區(qū)；277-279bp為N區(qū)，280-343bp為J區(qū)；344-507bp為C區(qū)。
上述苯致再生障礙性貧血相關(guān)抗原特異TCRVα19亞家族的Y基因序列翻譯的蛋白質(zhì)如下 VSAAKNEVEQSPQNLTAQEGEFITINCSYSVGISALHWLQQHPGGGIVSLFMLSSGKKKHGRLIATINIQEKHSSLHITASHPRDSAVYICAVNYGGSQGNLIFGKGTKLSVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSM。
上述苯致再生障礙性貧血相關(guān)抗原特異TCRVα19亞家族的Y基因序列的制備方法，包括如下步驟 A、收集苯致再生障礙性貧血患者外周血，F(xiàn)icoll分層法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞； B、提取外周血單個(gè)核細(xì)胞的RNA，RT-PCR合成cDNA第一鏈； C、在NCBI的Genebank中查找TCRα鏈的基因序列，并標(biāo)出各亞家族的V區(qū)及C區(qū)在基因組中的位置； D、設(shè)計(jì)29個(gè)Vα特異性上游引物及Cα下游引物； E、PCR擴(kuò)增29個(gè)Vα亞家族TCR重排時(shí)產(chǎn)生的V-N-JC區(qū)； F、Cα-Fam標(biāo)記PCR產(chǎn)物，基因掃描分析T細(xì)胞亞家族的表達(dá)和克隆性； G、將呈單克隆或寡克隆掃描圖的亞家族PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化序列分析。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果 (1)本發(fā)明制備得到了一種獨(dú)特的苯致再生障礙性貧血抗原的相關(guān)TCRVα19基因序列，該序列可以作為一種新的抗原識(shí)別TCR基因(主要變化區(qū)在于CDR3序列)補(bǔ)充人類基因庫資料。
(2)該TCR基因可用于研究苯致再生障礙性貧血的特異性免疫診斷和治療。
上述苯致再生障礙性貧血相關(guān)抗原特異TCRVα19亞家族的基因序列一方面可用于進(jìn)一步檢測(cè)病人體內(nèi)所存在的TCRVα19亞家族T細(xì)胞的情況，以評(píng)價(jià)其細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，另一方面應(yīng)用是制備選擇性地去除苯致再生障礙性貧血中異常增殖的T細(xì)胞克隆靶向免疫治療研究方面。
前者的檢測(cè)所采用技術(shù)與上述檢測(cè)TCR基因的技術(shù)相同，通過不同時(shí)間點(diǎn)的分析，可以了解病人所存在的TCRVβ13亞家族T細(xì)胞的情況，用于了解病人的免疫狀態(tài)。
后者主要通過苯致再生障礙性貧血相關(guān)抗原特異的TCR基因制備對(duì)抗確定的特異性抗原的單抗，從而具備了發(fā)揮相應(yīng)特異性去除苯致再生障礙性貧血中異常增殖的T細(xì)胞克隆。本發(fā)明所提供的TCR基因的應(yīng)用最終目的是通過對(duì)苯致再生障礙性貧血患者進(jìn)行特異性免疫治療，從而提高療效，改善病人的生存質(zhì)量等，是具有很大的市場(chǎng)推廣應(yīng)用價(jià)值和和較大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。



圖1為苯致再生障礙性貧血相關(guān)抗原特異TCRVα19亞家族的基因掃描圖。
其中，A為TCRVα19亞家族多克隆圖；B為TCRVα19亞家族寡克隆圖。

具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
實(shí)施例 (一)抗原特異性TCR基因序列的分析 分析TCRVα基因譜的CDR3的長(zhǎng)度和堿基序列的方法很多，常用的方法是利用RT-PCR-基因掃描方法分析TCRVα29個(gè)亞家族的CDR3長(zhǎng)度。首先收集苯致再生障礙性貧血患者外周血，F(xiàn)icoll分層法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，留取1*107個(gè)PBMCs(外周血單個(gè)核細(xì)胞)提取RNA，RT-PCR合成cDNA。同時(shí)，在NCBI的基因庫中查找出TCRα鏈的基因序列，并標(biāo)出各亞家族的V區(qū)及C區(qū)在基因組中的位置。根據(jù)Vα29個(gè)亞家族基因的cDNA設(shè)計(jì)相應(yīng)的29個(gè)Vα特異性上游引物，并在Cα區(qū)設(shè)一Cα下游引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增患者29個(gè)Vα亞家族TCR重排時(shí)產(chǎn)生的V-N-JC區(qū)。如圖1所示，熒光素Fam標(biāo)記各亞家族PCR產(chǎn)物的Cα區(qū)，基因掃描分析T細(xì)胞各亞家族的表達(dá)，根據(jù)不同位置，高度和形態(tài)的峰，表示產(chǎn)物的大小、量和均一性，從而確定T細(xì)胞克隆性(一般情況下，正常轉(zhuǎn)錄的每個(gè)Vα亞家族包含8～10個(gè)峰，即8～10個(gè)不同克隆的T細(xì)胞；主峰的出現(xiàn)表明相同大小cDNA的過度擴(kuò)增，單峰表明產(chǎn)物中DNA片斷大小相同，均存在寡克隆或單克隆T細(xì)胞群，三者分別提示產(chǎn)物來自多克隆、寡克隆和單克隆的T細(xì)胞)。基因掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者的Vα19亞家族T細(xì)胞呈明顯單克?。粚α19亞家族的PCR產(chǎn)物切膠純化，序列分析發(fā)現(xiàn)了Vα19亞家族TCR的基因序列及其CDR3區(qū)(V-N-J區(qū))，即為與苯致再生障礙性貧血相關(guān)抗原特異性結(jié)合的部位。
苯致再生障礙性貧血相關(guān)抗原特異TCRVα19亞家族的Y基因序列的制備方法 1、分離外周血單個(gè)核細(xì)胞 (1)取淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll，密度1.077)4mL加入離心管內(nèi)，將稀釋后的抗凝外周血標(biāo)本混懸液平鋪于分離液之上，以水平離心機(jī)，2000rpm，離心15分鐘。
(2)吸取中間單個(gè)核細(xì)胞層轉(zhuǎn)移至另一離心管內(nèi)，再加入5mL 1640液，輕輕吹打，以1500rpm，離心洗滌10分鐘，棄上清，加入1640液至2mL，混勻后計(jì)數(shù)，并用同樣的方法洗滌兩次，按2×107/mL調(diào)整細(xì)胞濃度備用。2、RNA提取(TRIzol試劑盒方法提取法) (1)將已加入TRIzol試劑-20℃凍存的細(xì)胞取出，置冰上解凍，混勻后加入0.2mL氯仿，充分混勻，4℃，14000rpm離心30分鐘。
(2)吸取上層液至另一離心管，加入0.5mL異丙醇并混勻，室溫靜置10分鐘后4℃，14000rpm離心30分鐘。
(3)去上清，并用1mL75％乙醇(-20℃)洗兩次(2～8℃，14000rpm)，每次混勻30秒后，離心10分鐘。
(4)去上清，再離心2～3分鐘，去除剩余的乙醇，置于超凈臺(tái)上自然干燥1～1.5小時(shí)。加入超凈水(20～50μL)溶解。
(5)于紫外線分光光度儀中檢測(cè)樣品的純度和含量，0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性和質(zhì)量。
(6)RNA保存RNA樣品加入其0.1倍容積的3mol/LNaAC(醋酸鈉)和2倍容積的乙醇后，保存于-80℃?zhèn)溆谩?br> 3、cDNA合成 (1)應(yīng)用六聚體隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒合成cDNA第一鏈。1μgRNA加入16.5μL預(yù)先配制的混合液其中包括7μL H2O、2μL 10×PCR-Buffer、2μL0.1mmol/L DTT、5μL 2.5mmol/L dNTP和0.5μL Rand.Hexmer。
(2)于73℃3分鐘后，置于冰中30秒。低溫高速離心30秒置于冰中2～3分鐘。
(3)加入0.6μL Rnasin(33U/μL)和0.5μL Superscript(200U/μL)后，低溫高速離心30秒。
(4)室溫靜置10分鐘；42℃，40分鐘以上；83℃，5分鐘，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 4、cDNA合成質(zhì)量檢測(cè) 將所有樣本的cDNA經(jīng)PCR檢測(cè)β2M基因(引物序列見表1)而確定其合成質(zhì)量。總反應(yīng)體系20μL，其中上下游引物0.5μmol/L，dNTP 0.1mmol/L，Taq聚合酶1.0U，MgCL2 1.5mmol/L，10×PCR緩沖液2μL，cDNA產(chǎn)物1μL和dH2O，同時(shí)設(shè)置陽性和陰性對(duì)照。在德國(guó)Biometra PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)。
反應(yīng)條件94℃1分鐘(首次3分鐘)，58℃1分鐘，72℃1分鐘(末次6分鐘)，共35個(gè)循環(huán)，最后保存于4℃中。取8μL PCR產(chǎn)物以1.5％(w/v)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，β2M陽性者可進(jìn)一步研究，陰性者視為無cDNA合成，棄去不用。
5、PCR擴(kuò)增TCRVα29個(gè)亞家族 以29個(gè)TCRVα亞家族基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性上游引物，并在Cα區(qū)設(shè)計(jì)一下游引物(引物序列見表1)。PCR按常規(guī)方法進(jìn)行?？偡磻?yīng)體系20μL，其中含任一Vα引物(29個(gè)Vα亞家族之一)和Cα引物0.5μmol/L，余同上。
反應(yīng)條件94℃、1分鐘(首次3分鐘)，60℃、1分鐘和72℃、1分鐘(末次6分鐘)，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后PCR產(chǎn)物保存于4℃中。取8μLPCR產(chǎn)物電泳分析結(jié)果。
6、T細(xì)胞克隆性分析 (1)標(biāo)記PCR產(chǎn)物 10μL的反應(yīng)體系含2.5μL未標(biāo)記的PCR產(chǎn)物、0.15μmol/L Cβ-fam引物、1.5mmol/L MgCl2，0.1mmol/L dNTP，0.75U Taq聚合酶，1μL 10×PCR緩沖液和dH2O。PCR共進(jìn)行35循環(huán)，每一循環(huán)包括94℃、1分鐘(首次3分鐘)，66℃、1分鐘和72℃、1分鐘(末次6分鐘)，最后PCR產(chǎn)物保存于4℃中。
(2)基因掃描樣品配制 熒光素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物(2μL)加入高質(zhì)量的去離子甲酰胺(Hi-DiFormamide)與Genescan-500 LIZ分子量標(biāo)準(zhǔn)品按20∶1比例配好的10μL混合液中。
(3)基因掃描(按操作指南進(jìn)行) 1)按操作指南準(zhǔn)備好儀器并更換水和緩沖液。
2)灌膠灌膠前2小時(shí)從4℃冰箱取出POP-4(Performance OptimizedPolymer-4)膠回溫1～2小時(shí)，把膠液抽進(jìn)貯膠5mL針筒中(抽取的mL數(shù)約為0.5+0.07x做樣次數(shù))，倒置排出針筒內(nèi)氣泡，裝緊針筒。
3)上樣將備好的樣品于94℃變性4分鐘，然后立即放置冰上冷卻2分鐘。變性后的樣品加入96孔板，直接裝載到3100遺傳分析儀進(jìn)行電泳。
4)運(yùn)行自動(dòng)進(jìn)樣器會(huì)自動(dòng)把樣品板移到要分析的4個(gè)樣品的位置，電泳過程中CCD檢測(cè)器把熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)并把它傳送給安裝了3100數(shù)據(jù)采集軟件的計(jì)算機(jī)工作站。
5)數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理完成后就存貯在計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)庫里并以電泳信號(hào)圖的形式顯示出來。電泳信號(hào)圖的X軸表示時(shí)間，Y軸表示相對(duì)熒光強(qiáng)度，每個(gè)圖中同時(shí)畫出幾種用于標(biāo)記DNA片斷的熒光素信號(hào)，電泳信號(hào)圖中的每個(gè)峰代表一個(gè)DNA片斷。完成處理的數(shù)據(jù)被自動(dòng)地從數(shù)據(jù)庫中提取并進(jìn)行分析。
6)結(jié)果分析打開GeneMapper SoftwareTM v3.5，將保存于計(jì)算機(jī)硬盤數(shù)據(jù)庫中的原始數(shù)據(jù)加進(jìn)分析軟件，分析產(chǎn)物的長(zhǎng)度和熒光素強(qiáng)度。
7、核苷酸序列分析 (1)E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物 1)切膠將PCR產(chǎn)物全部加入1～2％的瓊脂糖凝膠的加樣孔，當(dāng)電泳至足以分離目的DNA時(shí)，于紫外燈下用干凈的手術(shù)刀切下含有目的條帶的瓊脂糖凝膠塊，切下的凝膠塊置于1.5mL離心管中。
2)按E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒說明進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化，先加入500μLBinding Buffer，55～65℃孵育至凝膠塊完全溶解；凝膠溶解液加入HiBind DNAspin-column中高速離心去廢液后，再依次加入300μL Binding Buffer、700μLSPW Buffer洗膜；高速離心甩干spin-column的濾膜后，加入30μL DNA ElutionBuffer(加于濾膜上)，室溫靜置5min，高速離心1min后可得純化的PCR產(chǎn)物。
3)取3μL純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，觀察純化效果；剩余的PCR純化產(chǎn)物真空冷凍干燥濃縮約20min至10μL左右。
(2)BigDye標(biāo)記 用BigDyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing kit標(biāo)記純化后的PCR產(chǎn)物，反應(yīng)體系為BigDyeTerminator 1μL、相應(yīng)單向引物(2μmol/L)1.6μL、純化后PCR產(chǎn)物2.4μL，反應(yīng)條件96℃1min，(96℃ 10sec、50℃ 5sec、60℃4min)25個(gè)循環(huán)。
(3)測(cè)序 將標(biāo)記好BigDye的5μL體系的測(cè)序產(chǎn)物補(bǔ)水至20μL，轉(zhuǎn)入1.5ml的離心管，再依次加入2μL 3M NaAc(pH5.2)、2μL 125mM EDTA-Na2、50μL 95％乙醇，旋渦振蕩后室溫下避光放置15min；5415型高速臺(tái)式離心機(jī)2800g離心20min，沿離心沉淀物的對(duì)側(cè)小心吸取上清并棄去，加入250μL70％冰凍乙醇，2800g離心5min，棄上清；將管蓋打開置于加熱板上，94～95℃1min使其干燥。加入10μL高質(zhì)量的去離子甲酰胺，反復(fù)吹打混勻，轉(zhuǎn)入0.2μL的PCR管內(nèi)，在PCR儀上95℃變性4min，然后迅速置冰中冷卻至少4min后，裝載到3100 DNA序列分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳。
表1 RT-PCR實(shí)驗(yàn)所涉及的引物序列 (二)抗原特異TCR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù) 1、重組質(zhì)粒TCRVα19(Y)-pIRES的構(gòu)建* (1)目的基因的擴(kuò)增 根據(jù)苯致再生障礙性貧血相關(guān)TCRVα19亞家族基因序列(包括完整的CDR3區(qū))設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增病人樣本中的TCRVα19基因序列的上游引物上帶有XhoI酶切位點(diǎn)、下游引物上帶有EcoRI酶切位點(diǎn)(與真核表達(dá)載體pIRES中的插入位點(diǎn)A的酶切位點(diǎn)相對(duì)應(yīng))。按BD AdvantageTM 2PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)PCR總反應(yīng)體系50μL，其中含10×BD Advantage 2PCRBuffer、上下游引物各0.5μmol/L、dNTP Mix 0.2mmol/L、50×BD Advantage2Polymerase Mix、超純水和1μL cDNA模板，同時(shí)設(shè)置陽性和陰性對(duì)照。反應(yīng)條件94℃1min(首次為3min)、60℃1min、72℃2min(末次為7min)，共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。
(2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建 A、E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒純化目的基因TCRVα19的PCR產(chǎn)物(同第一部分，步驟7)； B、將真核表達(dá)載體pIRES與純化后的TCRVα19PCR產(chǎn)物分別用XhoI酶切，體系為①TCRVα19 PCR產(chǎn)物28μL、TangoTMbuffer 8μL、XhoI內(nèi)切酶1μL、超純水3μL；②pIRES載體4μL、TangoTMbuffer 8μL、XhoI內(nèi)切酶1μL、超純水27μL；混勻后置于37℃水浴3h； C、純化XhoI酶切后的pIRES載體和TCRVα19PCR產(chǎn)物； D、將已純化好的XhoI酶切后的pIRES載體和TCRVα19PCR產(chǎn)物分別再用EcoRI酶切，體系為①TCRVα19PCR產(chǎn)物(XhoI)28μL、TangoTMbuffer8μL、EcoRI內(nèi)切酶1μL、超純水3μL；②pIRES載體(XhoI)28μL、TangoTMbuffer 8μL、EcoRI內(nèi)切酶1μL、超純水3μL；混勻后置于37℃水浴3h； E、雙酶切后的pIRES載體和TCRVα19PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)體系為10×T4 buffer1μL、T4 DNA酶1μL、雙酶切后的pIRES載體2μL、雙酶切后的TCRVβ13 PCR產(chǎn)物6μL，混勻后置于16℃過夜； F、轉(zhuǎn)化①將連接產(chǎn)物(10μL)加入感受態(tài)大腸桿菌DH5α(1.5mL離心管，100μL菌液，-70℃保存，北京Tiangen公司)中，輕輕混勻，置冰中30min；②42℃熱休克90s，迅速置冰中3min；③加入SOC培養(yǎng)基800μL，置干燥恒溫振蕩箱中37℃180～200rpm振搖60min；④菌液用玻璃推鋪于1.5％LB固體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100μg/mL)上，置37℃孵箱過夜培養(yǎng)； G、隨機(jī)挑選10個(gè)菌落，分別接種于5mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃180rpm振搖培養(yǎng)過夜，PureLinkTM超純質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒(5415型臺(tái)式高速離心機(jī))①3000rpm室溫下離心菌液15min，去上清；②加入250μL含RNase A的Resuspension Buffer，重懸細(xì)菌；③加入250μL Lysis Buffer，輕輕混勻，室溫下放置5min；④加入350μL Precipitation Buffer，立即振蕩混勻；⑤以11400rpm離心10min后，將上清液轉(zhuǎn)移至Mini column中，11400rpm離心1min，去廢液；⑥加入700μL Wash Buffer，11400rpm離心1min，去廢液；⑦再以11400rpm離心1min后，將Mini column放入一新的1.5mL離心管中，加入75μL預(yù)熱65℃的TE Buffer，室溫下放置3min，11400rpm離心2min，所收集的溶液即為富含質(zhì)粒溶液； H、提取質(zhì)粒DNA后用XhoI和EcoRI雙酶切鑒定，同時(shí)在pIRES載體的IRES區(qū)設(shè)計(jì)一下游引物IRES-R(5’-TATAGACAAACGCACACCGG-3’)，結(jié)合pIRES載體上游的T7公共引物(5’-TACGACTCACTATAGGCTAG-3’)進(jìn)行PCR鑒定，PCR反應(yīng)體積為25μL，包括0.1mmol/L dNTP、1.5UTaq聚合酶、10×PCR緩沖液、1.5mmol/L MgCl2和超純水，引物濃度均為0.4μmol/L，以1∶500稀釋的質(zhì)粒DNA1μL作為模板。PCR擴(kuò)增條件為94℃3min，(94℃30s，60℃1min，72℃2min，35個(gè)循環(huán))，72℃5min；酶切產(chǎn)物及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。篩選出陽性克隆，再對(duì)其進(jìn)行雙向測(cè)序鑒定，證實(shí)為本研究特異基因序列后擴(kuò)增陽性克隆并提取質(zhì)粒，從而獲得特異性苯致再生障礙性貧血相關(guān)的TCRVα19-pIRES質(zhì)粒。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定重組質(zhì)粒的濃度。
2、脂質(zhì)體介導(dǎo)的重組質(zhì)粒TCRVα19-pIRES轉(zhuǎn)染 (1)脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞株、Molt4細(xì)胞株 轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞株①將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞株以4×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度，加入2mL無血清無抗生素的IMDM培養(yǎng)基，接種6孔培養(yǎng)板；②取TCRVα19-pIRES重組質(zhì)粒(4μg)置于1.5mL離心管中，加入無血清無抗生素的IMDM培養(yǎng)基至250μL，輕輕混勻；③取15μL脂質(zhì)體LipofectamineTM2000置于1.5mL離心管中，加入無血清無抗生素的IMDM培養(yǎng)基至250μL，輕輕混勻后室溫下孵育5min；④將②和③混勻后，室溫下孵育20min；⑤將④加入①的A549細(xì)胞培養(yǎng)基中(轉(zhuǎn)染平行2孔)，另設(shè)1孔轉(zhuǎn)染pIRES空載體作為陰性對(duì)照，具體操作方法同轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒；置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后全量換液為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)72h后加G418進(jìn)行篩選(終濃度600μg/mL)，每4天換一次培養(yǎng)基，同時(shí)加入相同濃度的G418，在此篩選條件下培養(yǎng)20d可得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。
轉(zhuǎn)染Molt4細(xì)胞株將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Molt4細(xì)胞株以2×106個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種6孔板，取4μg TCRVα19-pIRES重組質(zhì)粒和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000混合后轉(zhuǎn)染Molt4細(xì)胞株，方法同轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞株。
3、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后TCRVα19基因表達(dá)的鑒定 (1)RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TCRVα19mRNA的表達(dá) 轉(zhuǎn)染7天后，各孔收集3×106細(xì)胞，用TRIZol試劑盒和SurperScript II逆轉(zhuǎn)錄試劑盒分別提取總RNA、合成cDNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增管家基因β2M檢測(cè)cDNA的合成質(zhì)量(同第一部分，步驟7)；用相應(yīng)的TCRVα19引物以及相應(yīng)的Cβ引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，轉(zhuǎn)染空載體組作為陰性對(duì)照，PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件同前所述。
(2)間接免疫熒光法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)重組質(zhì)粒的表達(dá) 轉(zhuǎn)染10天后，收集1×106細(xì)胞，用0.1mol/L的PBS洗滌細(xì)胞兩次后，標(biāo)記大鼠抗人TCRVα單抗(一抗，1∶100稀釋)，37℃孵育1h；PBS洗滌細(xì)胞三次后，標(biāo)記FITC-兔抗大鼠IgG抗體(二抗，1∶50稀釋)，37℃孵育1h；PBS洗滌細(xì)胞三次后，在熒光顯微鏡下觀察重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株中的表達(dá)情況；或直接用FITC-大鼠抗人TCRVα19單抗標(biāo)記，37℃孵育30min，PBS洗滌細(xì)胞一次后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式檢測(cè)重組質(zhì)粒的表達(dá)。
(3)點(diǎn)印記雜交和Western Blot檢測(cè)TCRVα19蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染20天后，收集2×106穩(wěn)定表達(dá)重組質(zhì)粒的細(xì)胞，用RIPA蛋白提取試劑盒提取總蛋白，真空冷凍干燥濃縮后考馬斯亮蘭法定量；同樣提取臍血細(xì)胞(TCRVα19亞家族表達(dá)均陽性)的蛋白作為陽性對(duì)照，轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞的蛋白為陰性對(duì)照。
1)點(diǎn)印記雜交 A、取NC膜2cm×4cm，劃分小格，用微量加樣槍分別點(diǎn)膜，重組質(zhì)粒組、陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組的蛋白樣品分別點(diǎn)3次，每次1μL；進(jìn)行2個(gè)平行反應(yīng)； B、用blocking Reagent封膜4h后用wash buffer洗滌2次，每次5min； C、加入1∶500的大鼠抗人TCRVα19單抗(用blocking Reagent稀釋)，4℃孵育過夜后用wash buffer洗滌2次，每次5min； D、加入1∶500的HRP-兔抗大鼠IgG抗體(用blocking Reagent稀釋)室溫孵育2h，用wash buffer洗滌3次，每次5min； E、將NC膜浸入DAB底物液(避光)顯色。
2)Western Blot A、SDS-PAGE電泳將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組的濃縮蛋白樣品、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照分別加樣于15％SDS-PAGE膠(每孔上樣約100μg)，以PageRulerPrestained Protein Ladder為預(yù)染marker，進(jìn)行3個(gè)平行反應(yīng)；用恒壓60V電泳30min后，改恒壓100V1h； B、分離其中1個(gè)平行反應(yīng)的SDS-PAGE膠，用考馬斯亮蘭染色后，用冰乙酸甲醇洗脫液反復(fù)漂洗直至有清晰條帶顯出； C、轉(zhuǎn)膜PVDF膜預(yù)先用甲醇浸泡1min，再浸泡到轉(zhuǎn)膜液中備用；切好的濾紙和海綿也浸泡到轉(zhuǎn)膜液中10min；將切下的另2個(gè)平行反應(yīng)的SDS-PAGE膠與相應(yīng)的PVDF膜放入轉(zhuǎn)膜液中浸泡片刻；將海綿-濾紙-PVDF膜-SDS-PAGE膠-濾紙-海綿依次放到陽極板上，膠大小＝膜＞濾紙；用4℃預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜液，恒壓40V，90min(濕轉(zhuǎn))； D、封膜用blocking Reagent封膜4h后用wash buffer洗滌2次，每次5min； E、檢測(cè)人β-actin蛋白(內(nèi)參照)的表達(dá)將其中1個(gè)平行反應(yīng)的PVDF膜加入1∶800的小鼠抗人β-actin單抗(用blocking Reagent稀釋)，4℃孵育過夜后用wash buffer洗滌2次，每次5min；加入1∶1000的HRP-羊抗小鼠IgG抗體(用blocking Reagent稀釋)室溫孵育2h，用wash buffer洗滌3次，每次5min； F、檢測(cè)目的蛋白TCRVα19的表達(dá)將另1個(gè)平行反應(yīng)的PVDF膜加入1∶800的大鼠抗人TCRVα單抗(用blocking Reagent稀釋)，4℃孵育過夜后用washbuffer洗滌2次，每次5min；加入1∶1000的HRP-兔抗大鼠IgG抗體(用blockingReagent稀釋)室溫孵育2h，用wash buffer洗滌3次，每次5min； G、化學(xué)發(fā)光法顯影在暗室中將PVDF膜轉(zhuǎn)入LumiGLO Working Reagent中，室溫孵育3min；用鑷子將PVDF膜取出，瀝去多余的試劑；將PVDF膜放入塑料薄膜中，要保證PVDF膜與塑料薄膜之間沒有氣泡；將含有PVDF膜的塑料薄膜放入X線曝光暗盒中，壓上X線膠片(曝光30s)，常規(guī)顯影、定影后得到顯影的X線膠片。
4、重組質(zhì)粒TCRVα19-pIRES轉(zhuǎn)染正常人T細(xì)胞，免疫小鼠制備單克隆抗體 (1)重組質(zhì)粒TCRVα19-pIRES轉(zhuǎn)染正常人T細(xì)胞 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的正常人T細(xì)胞以2×106個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種6孔板，取4μgTCRVα19-pIRES重組質(zhì)粒和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000混合后轉(zhuǎn)染正常人T細(xì)胞，操作方法同前所述，培養(yǎng)擴(kuò)增后得到表達(dá)抗原特異性相關(guān)TCRVα19基因的T細(xì)胞，并檢測(cè)驗(yàn)證重組質(zhì)粒的表達(dá)(方法同前)。
(2)免疫小鼠制備特異性單抗 體外大量培養(yǎng)特異性表達(dá)TCRVα19的T細(xì)胞，收集特異性表達(dá)TCRVα19T細(xì)胞后腹腔注射小鼠，根據(jù)單克隆抗體制備相關(guān)技術(shù)制備針對(duì)苯致再生障礙性貧血的單抗。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
SEQUENCE LISTING
<110>暨南大學(xué)
<120>苯致再生障礙性貧血相關(guān)抗原特異TCRVα19亞家族的Y基因序列
<130>40
<160>2
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>507
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>苯致再生障礙性貧血相關(guān)抗原特異TCRVα19亞家族的Y基因序列
<400>1
gtaagtgccg ccaaaaatga agtggagcag agtcctcaga acctgactgc ccaggaagga60
gaatttatca caatcaactg cagttactcg gtaggaataa gtgccttaca ctggctgcaa120
cagcatccag gaggaggcat tgtttccttg tttatgctga gctcagggaa gaagaagcat180
ggaagattaa ttgccacaat aaacatacag gaaaagcaca gctccctgca catcacagcc240
tcccatccca gagactctgc cgtctacatc tgtgctgtga attatggagg aagccaagga300
aatctcatct ttggaaaagg cactaaactc tctgttaaac caaatatcca gaaccctgac360
cctgccgtgt accagctgag agactctaaa tccagtgaca agtctgtctg cctattcacc420
gattttgatt ctcaaacaaa tgtgtcacaa agtaaggatt ctgatgtgta tatcacagac480
aaaactgtgc tagacatgag gtctatg507
<210>2
<211>169
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>苯致再生障礙性貧血相關(guān)抗原特異TCRVα
19亞家族的Y基因序列翻譯的蛋白質(zhì)
<400>2
Val Ser Ala Ala Lys Asn Glu Val Glu Gln Ser Pro Gln Asn Leu Thr
1 5 10 15
Ala Gln Glu Gly Glu Phe Ile Thr Ile Asn Cys Ser Tyr Ser Val Gly
20 25 30
Ile Ser Ala Leu His Trp Leu Gln Gln His Pro Gly Gly Gly Ile Val
35 40 45
Ser Leu Phe Met Leu Ser Ser Gly Lys Lys Lys His Gly Arg Leu Ile
50 55 60
Ala Thr Ile Asn Ile Gln Glu Lys His Ser Ser Leu His Ile Thr Ala
65 70 75 80
Ser His Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Ile Cys Ala Val Asn Tyr Gly
85 90 95
Gly Ser Gln Gly Asn Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val
100 105 110
Lys Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp
115 120 125
Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser
130 135 140
Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp
145 150 155 160
Lys ThT Val Leu Asp Met Arg Ser Met
16權(quán)利要求
1、一種苯致再生障礙性貧血相關(guān)抗原特異TCRVα19亞家族的Y基因序列，其特征在于所述基因序列如下
GTAAGTGCCGCCAAAAATGAAGTGGAGCAGAGTCCTCAGAACCTGACTGCCCAGGAAGGAGAATTTATCACAATCAACTGCAGTTACTCGGTAGGAATAAGTGCCTTACACTGGCTGCAACAGCATCCAGGAGGAGGCATTGTTTCCTTGTTTATGCTGAGCTCAGGGAAGAAGAAGCATGGAAGATTAATTGCCACAATAAACATACAGGAAAAGCACAGCTCCCTGCACATCACAGCCTCCCATCCCAGAGACTCTGCCGTCTACATCTGTGCTGTGAATTATGGAGGAAGCCAAGGAAATCTCATCTTTGGAAAAGGCACTAAACTCTCTGTTAAACCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCCGTGTACCAGCTGAGAGACTCTAAATCCAGTGACAAGTCTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAATGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACAGACAAAACTGTGCTAGACATGAGGTCTATG。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種苯致再生障礙性貧血相關(guān)抗原特異TCRVα19亞家族的Y基因序列，其特征在于所述苯致再生障礙性貧血相關(guān)抗原特異TCRVα19亞家族的Y基因序列翻譯的蛋白質(zhì)如下
VSAAKNEVEQSPQNLTAQEGEFITINCSYSVGISALHWLQQHPGGGIVSLFMLSSGKKKHGRLIATINIQEKHSSLHITASHPRDSAVYICAVNYGGSQGNLIFGKGTKLSVKPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSM。
全文摘要
本發(fā)明公開了針對(duì)苯致再生障礙性貧血相關(guān)抗原的特異性T細(xì)胞受體的核苷酸序列。通過RT-PCR基因掃描分析發(fā)現(xiàn)苯致再生障礙性貧血患者外周血中TCR Vα19亞家族呈明顯單克隆，其PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)了特異性TCR序列的V-N-J區(qū)，即互補(bǔ)決定區(qū)3，是和抗原特異性識(shí)別結(jié)合的部位，表明該克隆性T細(xì)胞的TCR為苯致再生障礙性貧血相關(guān)抗原刺激所產(chǎn)生的特異性TCR。它是進(jìn)行苯致再生障礙性貧血免疫靶向治療的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。該特異性TCR的核苷酸序列為進(jìn)一步開展針對(duì)苯致再生障礙性貧血的特異性細(xì)胞免疫治療提供條件。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101250526SQ20071003281
公開日2008年8月27日 申請(qǐng)日期2007年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日
發(fā)明者李揚(yáng)秋, 萡 李, 陳少華, 楊力建 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)