專(zhuān)利名稱(chēng)：：鑒別蜂頭蟲(chóng)草的特征性核苷酸序列和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于利用分子生物學(xué)方法檢測(cè)中藥材真?zhèn)蔚?br>技術(shù)領(lǐng)域：
。具體的說(shuō)，是用于鑒別蜂頭蟲(chóng)草[CoWj;ce戸"tecocep/zato(Klotzsch)Sacc]的特征性核苷酸序列以及核酸分子探針和鑒別蜂頭蟲(chóng)草的方法。
背景技術(shù)：
：蜂頭蟲(chóng)草[Cw辦ce戸^/zecoce;^a/a(Klotzsch)Sacc]是屬于蟲(chóng)草屬(Ow辦ce/w)的一種蟲(chóng)生真菌，該屬真菌還包括冬蟲(chóng)夏草[Cor辦ce/ww'"m^(Berk)Sacc]以及蛹蟲(chóng)草[Confyce/w(L.)Link]。野生冬蟲(chóng)夏草用于中藥已有兩千年的歷史，普通民眾俗稱(chēng)的蟲(chóng)草即為冬蟲(chóng)夏草，具有保肺腎、補(bǔ)精髓、化痰止勞咳的作用，常食可促進(jìn)消化、調(diào)節(jié)免疫功能，增強(qiáng)人體抵抗力。冬蟲(chóng)夏草產(chǎn)于青藏高原，產(chǎn)量相對(duì)較大，但隨著逐年的瘋狂采挖，導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境遭到破壞，引起國(guó)家重視，現(xiàn)己禁止采挖，引起價(jià)格的大幅上漲。但由于人工發(fā)酵菌絲生產(chǎn)冬蟲(chóng)夏草菌粉周期長(zhǎng)達(dá)40天以上，且條件苛刻，成本很高，同時(shí)子實(shí)體至今仍然無(wú)法人工栽種，故尋找和開(kāi)發(fā)冬蟲(chóng)夏草的替代品成為蟲(chóng)草資源開(kāi)發(fā)與應(yīng)用的重要方向。蛹蟲(chóng)草又稱(chēng)北蟲(chóng)草或北冬蟲(chóng)夏草，具有益肺腎，補(bǔ)精髓，止血化痰的功能，與冬蟲(chóng)夏草具有相似的溫補(bǔ)特性，同時(shí)含有冬蟲(chóng)夏草中含量極低的蟲(chóng)草素。由于蛹蟲(chóng)草菌絲的發(fā)酵生產(chǎn)以及子實(shí)體的栽培均比冬蟲(chóng)夏草容易，故蛹蟲(chóng)草的生產(chǎn)與栽培已形成相當(dāng)?shù)囊?guī)模，市場(chǎng)銷(xiāo)售有了突破性的增長(zhǎng)。蜂頭蟲(chóng)草與前面兩者具有相似的功能，而且菌絲發(fā)酵與子實(shí)體栽培都很容易，完全具有開(kāi)發(fā)為蟲(chóng)草新產(chǎn)品的價(jià)值。因此可以快速而準(zhǔn)確的鑒別蜂頭蟲(chóng)草菌絲、子實(shí)體以及相關(guān)制品真?zhèn)蔚姆椒ê图夹g(shù)將對(duì)于蜂頭蟲(chóng)草生產(chǎn)相關(guān)企業(yè)以及相關(guān)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)具有重要的意義。DNA是生物儲(chǔ)存遺傳信息的物質(zhì)，每個(gè)生物物種乃至個(gè)體均具有獨(dú)特的特征性核苷酸序列，可以作為該生物物種或個(gè)體區(qū)別與其他物種或個(gè)體的標(biāo)志。DNA是細(xì)胞生物的基本組成部分，作為遺傳信息的載體，具有一定的穩(wěn)定性，不會(huì)受表形的影響而改變，是用來(lái)鑒別物種、個(gè)體的可靠依據(jù)。通過(guò)生物信息學(xué)的分析可以找到不同物種或個(gè)體的特征性核苷酸序列，利用分子生物學(xué)的手段對(duì)該序列進(jìn)行探測(cè)即可快速、準(zhǔn)確的對(duì)物種或個(gè)體進(jìn)行鑒別。目前，已有用于鑒別冬蟲(chóng)夏草的核苷酸特征性序列獲得專(zhuān)利，但并未見(jiàn)與蜂頭蟲(chóng)草鑒別相關(guān)的核苷酸特征性序列的專(zhuān)利。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供利用分子生物學(xué)手段鑒別蜂頭蟲(chóng)草的特征性核苷酸序列以及方法，它可以直接從遺傳本質(zhì)上鑒別蜂頭蟲(chóng)草菌絲、子實(shí)體以及相關(guān)制品的真?zhèn)?。具體包括1、用于分子鑒別蜂頭蟲(chóng)草的特征性核苷酸序列；2、來(lái)源于上述特征性序列的蜂頭蟲(chóng)草專(zhuān)一性核苷酸分子探針；3、包含上述分子探針的用于鑒別蜂頭蟲(chóng)草的試劑盒；4、利用上述特征性核苷酸序列、核苷酸分子探針以及試劑盒鑒別蜂頭蟲(chóng)草的方法。本發(fā)明提供的用于分子鑒別蜂頭蟲(chóng)草的特征性核苷酸序列來(lái)源于蜂頭蟲(chóng)草核糖體rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)ITS)以及5.8SrRNA基因(核糖體rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)以及5.8SrRNA基因合并簡(jiǎn)稱(chēng)ITS區(qū))，其序列(SEQIDNO.l)所在位置以及特征見(jiàn)圖1、圖2及序列表，該序列包含蜂頭蟲(chóng)草的ITSl、5.8SrDNA以及ITS2的序列。該序列(SEQIDNO.1)可通過(guò)實(shí)施例1所述方法獲得，亦可通過(guò)人工合成的方法在商業(yè)化的DNA合成儀器上按照發(fā)明人提供的核苷酸順序合成。本發(fā)明的蜂頭蟲(chóng)草專(zhuān)一性核苷酸分子探針是以上述蜂頭蟲(chóng)草的特征性核苷酸序列(SEQIDNO.1)為模板而設(shè)計(jì)得到的全長(zhǎng)序列或不少于16個(gè)核苷酸組成的寡核苷酸序列，以及在上述全長(zhǎng)序列或寡核苷酸序列的基礎(chǔ)上經(jīng)修飾、加工、變化而獲得核苷酸序列，也包括在上述全長(zhǎng)序列或寡核苷酸序列的基礎(chǔ)上在5'端添加或改變10個(gè)核苷酸以下或改變?cè)泻塑账嵝蛄袛?shù)量小于10%以及3'端6個(gè)核苷酸改變不足1個(gè)核苷酸的核苷酸序列。上述序列可通過(guò)DNA自動(dòng)合成儀等DNA合成裝置按照設(shè)計(jì)好的順序合成而獲得，并可以通過(guò)酶、同位素、生物素、化學(xué)熒光素、熒光劑等方式進(jìn)行標(biāo)記。本發(fā)明提供了優(yōu)選的兩個(gè)蜂頭蟲(chóng)草專(zhuān)一性核苷酸分子探針ProbeI及ProbeII，其序列分別為SEQIDN0.2和SEQIDNO.3,其具體位置見(jiàn)圖2。該序列同樣適用于上述修飾、加工與變化、添加酶切位點(diǎn)、改變部分核苷酸序列以及標(biāo)記等操作。本發(fā)明提供的上述探針具有極高的專(zhuān)一性，可以與蜂頭蟲(chóng)草發(fā)生專(zhuān)一性的反應(yīng)而不與其他種類(lèi)的蟲(chóng)草或其他真菌發(fā)生反應(yīng)。利用上述探針通過(guò)PCR的方法或核酸雜交的方法可以快速的對(duì)蜂頭蟲(chóng)草的菌絲、子實(shí)體以及相關(guān)的制品進(jìn)行檢測(cè)，從而快速鑒別蜂頭蟲(chóng)草。本發(fā)明還提供一種有蜂頭蟲(chóng)草專(zhuān)一性核酸分子探針和相關(guān)PCR引物及試劑組成的蜂頭蟲(chóng)草專(zhuān)一性鑒定試劑盒，包括1、兩個(gè)優(yōu)選的蜂頭蟲(chóng)草專(zhuān)一性核苷酸分子探針(ProbeI及ProbeII);2、兩個(gè)蟲(chóng)草菌ITS通用引物；3、蜂頭蟲(chóng)草DNA提取試劑。其中，兩個(gè)蟲(chóng)草菌的通用引物是CorF(SEQIDNO.4)和CorR(SEQIDNO.5)。所述的蜂頭蟲(chóng)草DNA提取試劑為尿素提取液，其成分含有SDS1.5%,尿素7mol/L，Tris-HClpH8.00.05mol/L，NaCl0.5mol/L。利用本試劑盒通過(guò)常規(guī)的PCR方法即可準(zhǔn)確、快速的鑒定蜂頭蟲(chóng)草。本發(fā)明提供的蜂頭蟲(chóng)草鑒定方法包括核酸雜交以及PCR的方法。核酸分子雜交發(fā)采用前面所述的蜂頭蟲(chóng)草專(zhuān)一性的核酸分子探針，通過(guò)核酸分子雜交的方式(例如Southern雜交或點(diǎn)雜交)對(duì)蜂頭蟲(chóng)草及相關(guān)制品進(jìn)行鑒定。具體步驟和過(guò)程(包括探針的制備、標(biāo)記以及待測(cè)樣品的處理)按照常規(guī)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行。其中，蜂頭蟲(chóng)草的菌絲、子實(shí)體以及相關(guān)制品可以直接進(jìn)行檢測(cè)也可以先進(jìn)行DNA的提取與擴(kuò)增后再進(jìn)行檢測(cè)。PCR方法采用前面所述的蜂頭蟲(chóng)草專(zhuān)一性的核酸分子探針ProbeI及ProbeII作為一組PCR引物，以如前所述蟲(chóng)草菌ITS區(qū)通用引物CorF及CorR作為陽(yáng)性對(duì)照組的PCR引物，分別利用上述兩組引物按照常規(guī)的PCR方法擴(kuò)增待測(cè)樣品，兩者均能擴(kuò)增到特異性DNA片段的樣品即為蜂頭蟲(chóng)草，其中利用ProbeI及ProbeII獲得的DNA片斷長(zhǎng)為290bp，利用CorF及CorR獲得的DNA片斷長(zhǎng)為600bp左右。僅蟲(chóng)草菌ITS通用引物CorF及CorR能夠得到特異性片段而本發(fā)明提供的蜂頭蟲(chóng)草專(zhuān)一性的核酸分子探針組成的PCR引物ProbeI及ProbeII不能擴(kuò)增到特異性DNA片段的樣品則不是蜂頭蟲(chóng)草樣品。其中，PCR反應(yīng)可以利用本發(fā)明所述的試劑盒中的試劑或按照常規(guī)的分子生物學(xué)方法提取的蜂頭蟲(chóng)草樣品總DNA作為模板，也可以直接挑取少量的蜂頭蟲(chóng)草樣品加入PCR反應(yīng)體系作為模板。本發(fā)明由于有采用DNA序列作為檢測(cè)標(biāo)志，因此可以準(zhǔn)確快速檢測(cè)未知樣品是否為或含有蜂頭蟲(chóng)草，其中樣品可以為菌絲體、子實(shí)體及其粉碎加工產(chǎn)品以及包含有蜂頭蟲(chóng)草的中成藥制劑、保健品。采用PCR方法檢測(cè)時(shí)，所需樣品量極少，方法簡(jiǎn)單，半天內(nèi)可完成檢測(cè)。圖l是核糖體rRNA基因結(jié)構(gòu)示意圖，其中標(biāo)示為ITS區(qū)的范圍為本發(fā)明涉及的DNA序列，即核糖體rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)以及5.8SrRNA基因；圖2是本發(fā)明所述的蜂頭蟲(chóng)草特征性核苷酸序列全序列以及優(yōu)選的兩個(gè)蜂頭蟲(chóng)草專(zhuān)一性核苷酸分子探針ProbeI及ProbeII的位置圖，該圖顯示ITS區(qū)正鏈序列，左側(cè)為5'端，右側(cè)為3'端，其中加粗及下劃線部分分別為ProbeI(46bp-64bp，位于正鏈上)及ProbeII(337bp-316bp,位于負(fù)鏈上)；圖3是實(shí)施例3中的PCR反應(yīng)結(jié)果示意圖，其中l(wèi)為蟻蟲(chóng)草，2為古尼蟲(chóng)草，3為蛹蟲(chóng)草，4為尖頭蟲(chóng)草，5為蜂頭蟲(chóng)草，M為1Kb+100bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，一為空白對(duì)照；圖4是實(shí)施例4中的PCR反應(yīng)結(jié)果示意圖，其中l(wèi)為蟻蟲(chóng)草，2為古尼蟲(chóng)草，3為蛹蟲(chóng)草，4為尖頭蟲(chóng)草，5為蜂頭蟲(chóng)草，M為1Kb+100bpDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，一為空白對(duì)照。具體實(shí)施方式實(shí)施例1蜂頭蟲(chóng)草rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)以及5.8SrRNA基因的制備取蜂頭蟲(chóng)草樣品0.1-0.5g，液氮中研磨成粉，加入300nl尿素提取液(SDS1.5%,尿素7mol/L，Tris-HClpH8.00.05mol/L，NaCl0.5mol/L)，移入1.5ml微型離心管中，在液氮中冷卻，迅速移到65。C融化。反復(fù)凍融35次后，加入等體積的酚氯仿異戊醇(25:24:1)，震蕩，13000r/min離心10min，上清移入新管中加入等體積氯仿異戊醇(24:1)，震蕩，13000r/min離心10min，上清移入新管中加入微量RnaseA，37。C保溫30min，加入3倍體積無(wú)水乙醇，3MNaAc(pH5.2)，-20。C放置至少30min后，13000rpm離心15min，回收DNA沉淀，用70%乙醇和無(wú)水乙醇洗漆，抽干或風(fēng)干，每管加入50ulTE(100mmol/LTris-C1,10mmol/LEDTA，pH8.0)回溶，獲得總DNA。取0.2mlPCR管一支，加入20ulPCR反應(yīng)液(包括10xPCR緩沖液2ul，引物CorF、CorR各40ng，2mmol/LdNTPlul，Taq酶l個(gè)單位，加超純水至20ul)，加入0.5ul蜂頭蟲(chóng)草總DNA提取液，閉緊管蓋，置于PCR儀上按以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)94。C預(yù)變性3min，然后93°C變性lmin，55。C復(fù)性lmin，72°C延伸2min，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10min。反應(yīng)完成后利用商業(yè)化的純化試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物的純化并直接在DNA測(cè)序儀上測(cè)序。獲得核苷酸序列除去18SrRNA基因以及28SrRNA基因序列后所得到的序列即為蜂頭蟲(chóng)草rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)以及5.8SrRNA基因的序列如序列表1所示。實(shí)施例2蜂頭蟲(chóng)草專(zhuān)一性探針(引物)ProbeI及ProbeII的制備將蜂頭蟲(chóng)草的ITS區(qū)序列與其他蟲(chóng)草菌的同源序列進(jìn)行比較，獲得最適于鑒別蜂頭蟲(chóng)草寡核苷酸片段組成與排列順序，即ProbeI及ProbeII(如圖2所示ProbeI位置是46bp-64bp,位于正鏈上，ProbeII位置是337bp-316bp，位于負(fù)鏈上)。根據(jù)ProbeI及ProbeII的核苷酸排列和組成可以在商業(yè)化的DNA合成儀上通過(guò)化學(xué)合成的方法合成如序列表2、序列表3所載序列，即可用作專(zhuān)一性PCR引物。再此基礎(chǔ)上，可以利用常規(guī)的分子生物學(xué)方法利用酶、同位素、生物素、化學(xué)熒光素、熒光劑等對(duì)ProbeI及ProbeII進(jìn)行標(biāo)記，即可用做雜交用探針。實(shí)施例3鑒定蜂頭蟲(chóng)草的正對(duì)照試驗(yàn)本試驗(yàn)用以確定DNA樣品符合PCR要求可獲得特異性PCR產(chǎn)物。方法l:總DNA提取以及PCR反應(yīng)皆參照實(shí)施例l進(jìn)行，對(duì)不同的樣品分別提取DNA，并在同一條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中包括不添加模板的空白實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增的產(chǎn)物在2"M)的含有DNA染料的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，在適當(dāng)?shù)墓庠聪聳丝匆约芭恼?。方?:用牙簽直接挑取適量樣品(菌絲、粉碎子實(shí)體、粉碎的相關(guān)制品)在裝20ul超純水的0.2mlPCR管種攪動(dòng)，并取少量分別稀至0.1倍以及0.01倍，取2ul上述三個(gè)濃度的樣品懸濁液加入含有20ulPCR反應(yīng)液(包括10xPCR緩沖液2ul，引物CorF、CorR各40ng，2mmol/LdNTPlul，Taq酶l個(gè)單位，加超純水至20ul)的0.2mlPCR管中，充分混勻閉緊管蓋，其中包括不添加樣品的空白實(shí)驗(yàn)，全部PCR管置于PCR儀上進(jìn)行如下PCR反應(yīng)94°C預(yù)變性3min，然后93°C變性lmin，55°C復(fù)性lmin,72°C延伸2min，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10min。擴(kuò)增的產(chǎn)物在2%的含有DNA著色劑的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，在適當(dāng)?shù)墓庠聪聳丝匆约芭恼?。圖3為按方法1進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示五種蟲(chóng)草(l為蟻蟲(chóng)草，2為古尼蟲(chóng)草，3為蛹蟲(chóng)草，4為尖頭蟲(chóng)草，5為蜂頭蟲(chóng)草)均可正常的擴(kuò)增得到ITS區(qū)DNA特異性片段，該結(jié)果表明五種待測(cè)蟲(chóng)草提取的總DNA符合PCR擴(kuò)增的要求，可以用作專(zhuān)一性檢測(cè)的待測(cè)樣品，空白實(shí)驗(yàn)結(jié)果排除了假陽(yáng)性的可能。實(shí)施例4蜂頭蟲(chóng)草專(zhuān)一性鑒別用以從符合PCR要求的樣品中專(zhuān)一性的擴(kuò)增蜂頭蟲(chóng)草，從而鑒別蜂頭蟲(chóng)草。方法1:使用實(shí)施例3中符合PCR反應(yīng)要求的樣品如實(shí)施例1中方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增(包括不添加模板的空白實(shí)驗(yàn))，其中引物替換為ProbeI及ProbeII，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min，然后93°C變性lmin，60°C復(fù)性lmin，72°C延伸2min，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10min。擴(kuò)增的產(chǎn)物在2%的含有DNA染料的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，在適當(dāng)?shù)墓庠聪虏榭匆约芭恼?。方?:使用實(shí)施例3中符合PCR反應(yīng)要求的樣品懸濁液如實(shí)施例3中方法2所述進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中引物替換為ProbeI及ProbeII,反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min，然后93°C變性lmin，60°C復(fù)性lmin，72°C延伸2min，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10min。擴(kuò)增的產(chǎn)物在2%的含有DNA染料的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，在適當(dāng)?shù)墓庠聪虏榭匆约芭恼?。圖4為按方法1進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示五種蟲(chóng)草(l為蟻蟲(chóng)草，2為古尼蟲(chóng)草，3為蛹蟲(chóng)草，4為尖頭蟲(chóng)草，5為蜂頭蟲(chóng)草)中蜂頭蟲(chóng)草被專(zhuān)一性的擴(kuò)增獲得290bp左右的特異性DNA片段，而其他蟲(chóng)草均無(wú)A特異性DNA片段被擴(kuò)增，該結(jié)果表明，蜂頭蟲(chóng)草專(zhuān)一性探針(引物)ProbeI及ProbeII可以從多種蟲(chóng)草中準(zhǔn)確的鑒別出蜂頭蟲(chóng)草，同時(shí)根據(jù)實(shí)施例3排除了假陰性(不符合PCR擴(kuò)增條件而造成的陰性結(jié)果)的可能。序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><160>5〈210>3<211>21<212>腿<213〉蜂頭蟲(chóng)草(Cor辦cepssp/zecoc—a/a)<400〉3CAGCTTTGCGCGTCACTATCA21SEQIDNO.4<160〉5<210>4<211〉23<212>DNA<2〗.3>人工序列<220>〈223〉根據(jù)蟲(chóng)草屬(Cw4，c印i')rRNA保守序列設(shè)計(jì)合成<400>4CGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT23SEQIDNO.5<160>5<210>5<211>23<212〉DNA<213〉人工序列<220><223〉根據(jù)蟲(chóng)草屬(Cw辦ce/w)rRNA保守序列設(shè)計(jì)合成〈400>5TTGCCGCTTCACTCGCCGTTACT2權(quán)利要求1.一種用于鑒別蜂頭蟲(chóng)草Cordycepssphecocephala的特征性核苷酸序列，其特征是該序列是來(lái)源于蜂頭蟲(chóng)草核糖體rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)以及5.8SrRNA基因的核苷酸序列，具體序列為CAGAGAGTGAAAACTCCCTAACCCACTGTGAACCATACCTATAATCTGCCTCGGCGGGTCTTTTAGGCCTGCCAAAGGAACCCAAACTCGTTTTATACCTAGTCTTCTGAGTTTTTCAAAAATATCAAAACTTTTAGCAACGGATCTCTTGGCTCTAGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGCGAATTGCAGATTTTAGTGAGTCATCGAGTTTTTGAACGCATATTGCGCCTGCTGGCTATTCTAGCAGGCATGCCTGTCCGAACGTTATTTACAGTACTAGAGGCTGCTATAGTAGGGTGTTGATAGTGACGCGCAAAGCTGTGTAGTGTTTTGCACTAACCTTTGCTCGTTACTCCACCCACTATATGTCTCTCTGTTGGAGCCTGGCTAAGCGGCCATCTCTTAAATCTAGTGGCGGCGGTTGCTCTTATTTCCCCTGACAAGTAGACTTTTACTCGCCATGTGGAGGATTAGCAGCCCCCCTGAAAATTCCATCTA。2.—種以權(quán)利要求1的核苷酸序列為模板而設(shè)計(jì)的用于鑒別蜂頭蟲(chóng)草的專(zhuān)一性核酸分子探針，其特征是其核苷酸序列為ProbeI:5'-TGCCTCGGCGGGTCTTTT-3'及ProbeII:5,-CAGCTTTGCGCGTCACTATCA-3，。3.—種鑒別蜂頭蟲(chóng)草的試劑盒，其特征是包括兩個(gè)權(quán)利要求2所述核苷酸分子探針，一對(duì)蟲(chóng)草屬核糖體rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物，以及DNA提取試劑；所述的蟲(chóng)草屬核糖體rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物是CorF:5,-CGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT-3，及CorR:5，-TTGCCGCTTCACTCGCCGTTACT-3，；所述的DNA提取試劑為尿素提取液，其成分含有SDS1.5%，尿素7mol/L，Tris-HClpH8.00.05mol/L,NaC10.5mol/L。4.一種鑒別蜂頭蟲(chóng)草的方法，其特征是采用權(quán)利要求2所述的核苷酸分子探針，通過(guò)核酸雜交的方式鑒定蜂頭蟲(chóng)草，具體步驟按照常規(guī)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行。5.—種鑒別蜂頭蟲(chóng)草的方法，其特征是采用權(quán)利要求2所述的核苷酸分子探針作為PCR引物，利用PCR方法鑒定蜂頭蟲(chóng)草，具體步驟按照常規(guī)PCR方法進(jìn)行。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于還包括利用權(quán)利要求3所述引物CorF和CorR作為PCR引物進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)的方法。全文摘要本發(fā)明提供一種鑒別蜂頭蟲(chóng)草的特征性核苷酸序列和方法，屬于利用分子生物學(xué)方法檢測(cè)中藥材真?zhèn)蔚?br>技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明提供了用于鑒定蜂頭蟲(chóng)草的來(lái)自蜂頭蟲(chóng)草核糖體rRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的特征性核苷酸序列及在其基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的核酸分子探針和包含該探針的蜂頭蟲(chóng)草鑒定試劑盒，以及利用該序列、探針或試劑盒通過(guò)PCR或核酸雜交的方式鑒別蜂頭蟲(chóng)草的方法。利用本發(fā)明，可以方便、快速、準(zhǔn)確的進(jìn)行蜂頭蟲(chóng)草(包括菌絲體、子實(shí)體以及相關(guān)的制品)的鑒定，本發(fā)明使用分子生物學(xué)手段排除了鑒定中的人為影響、鑒定結(jié)果客觀準(zhǔn)確，鑒定時(shí)間短，半天即可完成。文檔編號(hào)C12R1/645GK101255457SQ20071003287公開(kāi)日2008年9月3日申請(qǐng)日期2007年12月26日優(yōu)先權(quán)日2007年12月26日發(fā)明者李浩華,潘清靈,磊王,章衛(wèi)民,陶美華申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所