專(zhuān)利名稱(chēng)：鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)中色素蛋白質(zhì)材料領(lǐng)域，具體涉及鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素 (PEB)的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)的制備方法。
背景技術(shù)：
藻膽蛋白(phycobiliproteirO是藍(lán)藻和紅藻光合作用捕光復(fù)合物的功能組分。根據(jù)其 吸收光譜和熒光光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin，簡(jiǎn)稱(chēng)CPE)、藻紅 藍(lán)蛋白(phycoerythrocyanin，簡(jiǎn)稱(chēng)PEC)、藻藍(lán)蛋白(phycocyanin，簡(jiǎn)稱(chēng)CPC)和變?cè)逅{(lán)蛋 白(allophycocyanin，簡(jiǎn)稱(chēng)APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含alpha和beta亞基，每個(gè)亞基 中藻膽色素(phycobilin)通過(guò)硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白(apo-phycobiliprotein)半 胱氨酸殘基的巰基共價(jià)結(jié)合，其種類(lèi)及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白的光譜性質(zhì)。 藻膽色素與脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合形成特定的構(gòu)象，使得CPE主要吸收約560nm的可見(jiàn)光，發(fā) 射約580nm的熒光；PEC吸收約570nm的可見(jiàn)光，發(fā)射約630nm的熒光；CPC吸收約620nm的 可見(jiàn)光，發(fā)射約640nm的熒光；APC吸收約650 660咖的可見(jiàn)光，發(fā)射約660 670nm的熒 光。CPE結(jié)合的輔基色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡(jiǎn)稱(chēng)PEB); PEC的alpha亞基結(jié) 合的輔基色素為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡(jiǎn)稱(chēng)PVB); PEC的beta亞基結(jié)合的輔基色素 為藻藍(lán)膽素(phycocyanobilin，簡(jiǎn)稱(chēng)PCB); CPC和APC結(jié)合的輔基色素都為藻藍(lán)膽素PCB。
鏈霉親和素可以跟生物素特異結(jié)合，通過(guò)鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大作 用，提高檢測(cè)靈敏度。目前鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)檢測(cè)和醫(yī)療檢測(cè)等 領(lǐng)域。目前主要是通過(guò)化學(xué)交聯(lián)實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素對(duì)目標(biāo)的標(biāo)記。
CPC的alpha亞基可以通過(guò)大腸桿菌基因工程菌來(lái)生產(chǎn)(Tooley A J， Cai Y A, Glazer A N. Biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial C-phycocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001， 98(19) : 10560 10565)。與 前人的方法不同，我們發(fā)現(xiàn)Anabaena sp. PCC7120中aZrt^77基因編碼beta裂合酶，在其 它藍(lán)藻中也存在同源的beta裂合酶。這類(lèi)beta裂合酶不僅能催化藻藍(lán)膽素PCB與CPC的beta 亞基及其同源蛋白質(zhì)的84位半胱氨酸巰基(或同源的半胱氨酸巰基)共價(jià)結(jié)合生成藻藍(lán)蛋白 類(lèi)熒光蛋白質(zhì)，還能催化藻紅膽素PEB與CPC的beta亞基及其同源蛋白質(zhì)的84位半胱氨酸 巰基(或同源的半胱氨酸巰基)共價(jià)結(jié)合生成一種新型的結(jié)合了PEB的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白 質(zhì)。
4藻紅膽素PEB可由HOl、 PebA、 PebB協(xié)同催化生成(Alvey, R. M., Karty， J. A. etc. Lesions in Phycoerythrin Chromophore Biosynthesis in Fremyella diplosiphon Reveal Coordinated Light Regulation of Apoprotein and Pigment Biosynthetic Enzyme Gene Expression. Plant Cell 15 (10), 2448-2463 (2003))。通過(guò)基因工程技術(shù)，把鏈霉親和素 基因和藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白基因拼接后克隆于表達(dá)載體，可以在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)得到鏈 霉親和素和藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白的融合蛋白，直接實(shí)現(xiàn)鏈鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白亞基脫 輔基蛋白的連接，而不需要通過(guò)化學(xué)交聯(lián)等方法實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素標(biāo)記。
藻膽蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)可以應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域。藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒 光蛋白質(zhì)具有優(yōu)良的熒光性質(zhì)，通過(guò)直接實(shí)現(xiàn)鏈鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白亞基脫輔基蛋白的連 接，可用于生物學(xué)檢測(cè)以及醫(yī)療檢測(cè)領(lǐng)域。這種結(jié)合PEB的新型藻藍(lán)蛋白，為開(kāi)發(fā)新型熒光 探針提供了更多的選擇。本方法為藻藍(lán)蛋白類(lèi)色素蛋白質(zhì)功能材料應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī) 藥和生物工程領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)的 制備方法。它是應(yīng)用beta裂合酶催化PEB與鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白共價(jià)結(jié) 合，從而制備新型藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)(天然狀態(tài)下藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白是與PCB結(jié)合)。 將含有beta裂合酶基因、鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因拼接的基因、PEB生 物合成酶基因的表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入宿主菌，得到相應(yīng)的工程菌，通過(guò)如此設(shè)計(jì)的基因工程菌 生產(chǎn)新型鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的 一種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋 白質(zhì)的制備方法，包括下述步驟
(1) 用基因工程方法，將beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表達(dá)載體中，得到beta 裂合酶表達(dá)質(zhì)粒；
(2) 用基因工程方法，將藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因或其同源基因與鏈霉親和素基因拼 接后克隆于第二個(gè)表達(dá)載體中，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；
(3) 用基因工程方法將藻紅膽素生物合成酶基因力o7和peZ^或其同源基因克隆于第三 個(gè)表達(dá)載體中，得到力o7和peM表達(dá)質(zhì)粒；
(4) 用基因工程方法將藻紅膽素生物合成酶基因/^似或其同源基因克隆于第四個(gè)表達(dá) 載體中，得到； eW表達(dá)質(zhì)粒；
(5) 將beta裂合酶表達(dá)質(zhì)粒、鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、力W和peZ^表 達(dá)質(zhì)粒及/ e^表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌，應(yīng)用此工程菌通過(guò)發(fā)酵工程生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒 光蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽 素的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案也可以是這樣的 一種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類(lèi) 熒光蛋白質(zhì)的制備方法，包括下述步驟
(1) 用基因工程方法，將beta裂合酶基因或其同源基因、藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因 或其同源基因與鏈霉親和素基因拼接后同時(shí)克隆于表達(dá)載體中，得到beta裂合酶和鏈霉親和 素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；
(2) 用基因工程方法將藻紅膽素生物合成酶基因力o/和/ e/^或其同源基因克隆于第二 個(gè)表達(dá)載體中，得到力o7和peM表達(dá)質(zhì)粒；
(3) 用基因工程方法將藻紅膽素生物合成酶基因pe似或其同源基因克隆于第三個(gè)表達(dá) 載體中，得到； eW表達(dá)質(zhì)粒；
(4) 將beta裂合酶和鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、Ao7和/ e65表達(dá)質(zhì)粒及 pe^表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌， 應(yīng)用此工程菌通過(guò)發(fā)酵工程生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)； 發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋 白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)。
上述鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)的制備方法中，所述的宿 主菌為大腸桿菌；所述的beta裂合酶基因是指與^ a/we朋sp. PCC7120中alrW77基因同 源的基因；所述的藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因是指與^ a^e/7S sp. PCC7120或?qū)碸啦';7M^ sp. PCC7603中cpcS基因同源的基因。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)
1、 不使用藻類(lèi)為原料而是利用大腸桿菌生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)， 大腸桿菌繁殖快，可以大大縮短周期；
2、 與藻類(lèi)相比，大腸桿菌細(xì)胞壁容易破碎，純化過(guò)程中可節(jié)省能源；
3、 通過(guò)大腸桿菌生產(chǎn)，目標(biāo)蛋白含量高，有His-tag標(biāo)記，且體系中幾乎沒(méi)有性質(zhì)類(lèi)似 的蛋白，提取方便；
4、 生成結(jié)合PEB的新型藻藍(lán)蛋白，具有與天然藻藍(lán)蛋白不同的光譜特性，為發(fā)展熒光藻 膽蛋白類(lèi)色素蛋白質(zhì)功能材料提供更多選擇。


圖1為本發(fā)明中Alr0617催化下生成的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)的吸收與熒光光譜；其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地詳細(xì)說(shuō)明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。 實(shí)施例1
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種力朋Z 譜a sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測(cè)定完成， ^ Z3肌7 aws sp. PCC7603和CWot/^i義sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測(cè)定。^朋力ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(c/ c^、 WrW77、力o7); 必^j啦'/7os^sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(c/x^); Ca"t力rix sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因。eW和peM)。通過(guò)基因工程方法，將」朋6朋朋 sp.PCC7120中的aZrt^77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-a^^W7，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過(guò)上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將^朋Z^e朋sp.PCC7120中的藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因cpc^和鏈霉親和素基因 (簡(jiǎn)稱(chēng)sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-sa-cpcA
鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素 和藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。 鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號(hào)為AF283893，通過(guò)全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o 和pe/^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-p^^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即鏈霉親和素基因幼在pET30中在j/wi和^wn兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，脫輔基蛋白基因
印Ci9在pET30中是在fcoRV和J力o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因a7r^W7在pETDuet-1 中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)和Z力o I之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o厶peZ^和peM)， 力o7和peM在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，Zw7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)tVco I禾卩Af I之間，peM 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)We I和i7 o I之間，peZ^在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)A^II和 i7wl之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet-aZrt^77、 pET30_sa~cpc& pCDFDuet-力o卜/ eZ^和pACYCDuet-轉(zhuǎn) 入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至OD,為0.5至0.8，加入異丙基硫代i3-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡(jiǎn)稱(chēng)IPTG)至終濃度為l鵬ol/L， 20。C至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收 集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過(guò)附2+親和層析，可提純得到 相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B。其吸收與熒光光譜見(jiàn) 附圖1中所示，其中實(shí)線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。 將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式如下
從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基，37°C 振蕩培養(yǎng)過(guò)夜;取100pL飽和培養(yǎng)物，無(wú)菌轉(zhuǎn)接至5mL LB培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)至OD6。。=0. 3 0.4時(shí)，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無(wú)菌離心管中，冰上放置10min;離心lmin (10000g， 4'C)棄去 上清，收集沉淀菌體;用lmL預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2無(wú)菌溶液重懸菌體，離心30s(10000g， 4°C) 去上清，菌體沉淀用100pL預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置于冰上，加入一定量的構(gòu)建好 的質(zhì)粒，混勻后冰浴放置30min， 42。C熱休克90s，冰浴5min后加入300pL LB培養(yǎng)基，37'C 低速振蕩培養(yǎng)45min，無(wú)菌涂布在含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基平板上，倒置于37"C培養(yǎng)箱至
形成可見(jiàn)的單克隆菌斑。
提取3個(gè)左右菌落，分別接種到5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和；分 別從中取10(VL轉(zhuǎn)接至5ml含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中；37。C振蕩培養(yǎng)至0D6。。=0. 5-0. 7時(shí)， 冰浴約30min，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；避光、2(TC、 150轉(zhuǎn)/分，表達(dá)約12小時(shí)。離心收集細(xì) 胞，細(xì)胞加入緩沖液重懸；通過(guò)光譜儀測(cè)其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌株進(jìn)行大量表 達(dá)。
實(shí)施例2
(1)從GeneBank中可以査到，藻種^ Wae朋sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測(cè)定完成， 7az7i"os"s sp. PCC7603和Ca7"力Wzsp. PCC7601部分序列已經(jīng)測(cè)定。^ a/we朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(cpM、 alrt W7、力o/);尨7a啦'/7os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所查到序 列中找到所需基因(cpc5); CaJo^rk sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(/^W和；^力歷。通過(guò)基因工程方法，將力朋力ae朋 sp.PCC7120中的WrW77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-s^^W;7，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過(guò)上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將z/朋力se朋sp.PCC7120中的藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因cpc^(C1551)和鏈霉親和 素基因(簡(jiǎn)稱(chēng)sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫 pET30-ss-c/xW(C1551)，鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌 中能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔 基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號(hào)為AF283893，通過(guò)全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-/w7-/ eM，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因。eW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即鏈霉親和素基因ss在pET30中在J/w I和5^11兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，脫輔基蛋白基因 c/ Ci (C155I)在pET30中是在fcoRV和i7 o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因WrW"在 pETDuet-1中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5g7II和J/wI之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o厶 peZ^和peM)，力o7和peM在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)辰o I和 尸st I之間，； eZ^在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)AWe I和J力o I之間，peM在pACYCDuet-l中第二個(gè)多 克隆位點(diǎn)和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: 1混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5 ) 將 pETDuet-aZrM77 、 pET30-sa^/ cMC1551) 、 pCDFDuet-力o卜/)eZ^和pACYCDuet-/^M轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工 程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至OD,為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thiof D-galactoside,簡(jiǎn)稱(chēng)IPTG)至終濃度為1畫(huà)1/L, 20。C至37 'C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B; 離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過(guò)N;T親和層析，可提 純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例3
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種J朋6ae朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測(cè)定完成， 7syz y/7oms sp. PCC7603和Cs7"力ri;r sp. PCC7601部分序列己經(jīng)測(cè)定。^ s力ae朋sp. PCC7120
在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(cpc5、 a〗r0577、 Zw7);
Ja肌'"os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所查到序 列中找到所需基因(cpc^); Ca"t力riz sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peM和peZ^)。通過(guò)基因工程方法，將力/7a力a朋a sp.PCC7120中的aZn9W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-^ZiY^7T;在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過(guò)上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將^7atee朋sp.PCC7120中的藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因cpc^和鏈霉親和素基因 (簡(jiǎn)稱(chēng)sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pC0LADuet中，所得質(zhì)粒叫
pC0LADuet-幼-cpcA鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能 表達(dá)得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋 白藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號(hào)為AF283893，通過(guò)全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-/w7-; e/^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即鏈霉親和素基因幼和脫輔基蛋白基因c/ c^拼接后連接到pC0LADuet的fcoR I和戶W I之間；裂合酶基因Wr(^77在pETDuet-l中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^^1I和J力oI之間；
10PEB合成酶基因是3個(gè)(力o入pe^和/jeZ^)，力o/和/ e/^在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，力W 在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)I和At I之間，peM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)yWe I和J/w I之間，pe似 在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5^711和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet-aZrW77、 pC0LADuet_sa~c; c5、 pCDFDuet-力o7-; e/^和pACYCDuet-/pe似 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于PH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (is叩rophyl thiof D-galactoside，簡(jiǎn)稱(chēng)IPTG)至終濃度為l咖ol/L， 20。C至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收 集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過(guò)Nr親和層析，可提純得到 相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例4
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種力朋6譜a sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測(cè)定完成， ^肌'/7oms sp. PCC7603和CW"/ n'xsp. PCC7601部分序列已經(jīng)測(cè)定。力朋力ae朋sp. PCC7120
在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(cpc仏a^^/A 必h/z i/30s"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所查到序 列中找到所需基因(c/ cS); 6kZot/^j';f sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peM和pe6i9)。通過(guò)基因工程方法，將^/7aZ ae朋 sp. PCC7120中的sZrt W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-WrM7 7，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過(guò)上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將^Ws朋a sp.PCC7120中的藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因cpc5 (C155I)和鏈霉親
和素基因(簡(jiǎn)稱(chēng)sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pC0LADuet中，所得質(zhì)粒叫pC0LADuet-ss-c/x^(C1551)，鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸 桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的 脫輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號(hào)為AF283893，通過(guò)全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和/7eM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-pe65，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe力A在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即鏈霉親和素基因ss和脫輔基蛋白基因cpcA(C1551)拼接后連接到pCOLADuet的fcoR I和尸"I之間；裂合酶基因WrWW在pETDuet-l中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)份7II和J力o I之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o7、 ； eM和pe/^)，力o7和peZ^在同一個(gè)載體pCDFDuet-1 中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)I和尸"I之間，peM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)yVofe I和i7 o I 之間，/ eW在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)和J/ o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5 )將pETDuet-aZrt ^/7、 pCOLADuet-stc;x^(Cl551) 、 pCDFDuet-力o7-peZ^禾口 pACYCDuet-peW轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工 程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D柳為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡(jiǎn)稱(chēng)IPTG)至終濃度為1腸1/L， 20。C至37 。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B; 離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過(guò)Ni2+親和層析，可提 純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例5
(1)從GeneBank中可以査到，藻種力朋6ae朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測(cè)定完成， 7柳i/jasiAS sp. PCC7603和CaJ"/ n>sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測(cè)定。^ a6ae/ a sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(c/ c仏a7/^W7、 Z o7);屈J柳j'y70MS sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(c/5c^); CaJ"/ ri;r sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe^和pe/^)。通過(guò)基因工程方法，將力/7a力ae朋 sp. PCC7120中的a^W77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中第二位點(diǎn)，藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫 輔基蛋白基因cpc^和鏈霉親和素基因(簡(jiǎn)稱(chēng)sa)拼接后克隆于Novagen公司的pETDuet-1 中第一位點(diǎn)，所得質(zhì)粒叫pETDuet-sa-cpc5 -^/^^7，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶以 及鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白的融合蛋白。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過(guò)上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號(hào)為AF283893，通過(guò)全基因合成得到。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和/ e/^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-peZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因cpcZ 拼接后連接到pETDuet的I和尸W I 之間，a^^W7處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^^1I禾[]i7 oI之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o入
和pe/ 5)， / o7和peM在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Afco I和 尸"I之間，peZ^在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)yWe I和I之間，在pACYCDuet-1中第二個(gè)多 克隆位點(diǎn)5WI1和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: 1混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(4) 將pETDuet-sa"C/)c5"a7^rt W7、 pCDFDuet-力o7-/ e/^和pACYCDuet-peiM轉(zhuǎn)入大腸桿 菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于PH 7.0的LB培 養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡(jiǎn)稱(chēng)IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過(guò)Ni"親和層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和 素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例6
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種力朋力朋朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測(cè)定完成， M Ja則7 as"s sp. PCC7603和CaJo^ W義sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測(cè)定。加a力3e朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(c/ M、 W/^W7、力o7); 必Ja肌'/7ows sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(cpc"); CaJoMrix sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679,可從所査到序列中找到所需基因(peM和peM)。通過(guò)基因工程方法，將力/7aZ^e/ a sp. PCC7120中的alrt W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中第二位點(diǎn)，藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫 輔基蛋白基因c/ "(C155I)和鏈霉親和素基因(簡(jiǎn)稱(chēng)sa)拼接后克隆于Novagen公司的 pETDuet-1中第一位點(diǎn)，所得質(zhì)粒叫pETDuet-sa-cpcMC155I) -a^W77，在大腸桿菌中能表 達(dá)beta裂合酶以及鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白的融合蛋白。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過(guò)上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號(hào)為AF283893，通過(guò)全基因合成得到。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和pe/^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-peZ^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因(C155I)拼接后連接到pETDuet的^boR I和之間，a^rt^ 7處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^ /II和Z/ o1之間；PEB合成酶基因是3 個(gè)(力o厶pe/W和peM)，力o7和peM在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，Z o7在第一個(gè)多克隆位 點(diǎn)yVco I和尸"I之間，pe/^在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)We I和J力o I之間，在pACYCDuet-1 中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^711和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同
樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: 1混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(4)將pETDuet-ss"c; c5(C155I)-aZrt W7、 pCDFDuet—Z o7-; eZ^和pACYCDuet—轉(zhuǎn) 入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thiof D-galactoside，簡(jiǎn)稱(chēng)IPTG)至終濃度為1腦1/L， 20。C至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收 集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過(guò)Ni2+親和層析，可提純得到 相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例7
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種力朋6ae朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測(cè)定完成， 7ayw'/70s"s sp. PCC7603和CWotAriz sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測(cè)定。力/7a6ae"a sp. PCC7120
在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(cpc5、 aJr^577、 Zw7); #. ^啦7 os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所查到序 列中找到所需基因(c/ c"); sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為
AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe^和peM)。通過(guò)基因工程方法，將勱a&朋a sp.PCC7120中的alrt^77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-WrOW 7，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過(guò)上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將#. h肌'/JO幼s sp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因c/9cS和鏈霉親和素 基因(簡(jiǎn)稱(chēng)sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-幼-cpc5， 鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素 和藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號(hào)為AF283893，通過(guò)全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(/w/和pe6幼克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-pe65，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得
質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe似，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。即鏈霉親和素基因M在pET30中在I和5g7II兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，脫輔基蛋白基因 cpM在pET30中是在fcoRV和兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因a7/^W7在pETDuet-l 中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)^§^11禾卩i7wl之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(/ o7、； eZ^和peZ^)， 力o7和peZ^在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Afco I和尸st I之間，/ eM 在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)yVA I和Z/w I之間，； eZ^在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)S《Jn和 之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet-a&W77、 pET30-sa~c;x^、 pCDFDuet-Z o卜/ e/ i9和pACYCDuet-/ eW轉(zhuǎn) 入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0仏。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thiof D-galactoside，簡(jiǎn)稱(chēng)IPTG)至終濃度為1國(guó)1/L， 20'C至37'C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收 集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過(guò)附2+親和層析，可提純得到 相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例8
(1)從GeneBank中可以查到，藻種J/7^aey a sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測(cè)定完成，
yK Ja/w'/7as"s sp. PCC7603和CaJ"力rj';f sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測(cè)定。^7aZ7朋"a sp. PCC7120
在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(c/ c仏alrt 《77、 Z o7);
尨7az i/70幼s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所査到序
列中找到所需基因(cpc扔；6k ot/jri;r sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為
AY363679，可從所查到序列中找到所需基因。aW和/ eZ^)。通過(guò)基因工程方法，將」朋6朋朋
sp.PCC7120中的a7r^77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-l中，所得質(zhì)粒叫
pETDuet-W/^W7，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通
過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過(guò)上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將必7s啦'/ o^As sp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因cpc^(C1551)和鏈霉 親和素基因(簡(jiǎn)稱(chēng)sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pET30中，所得質(zhì)粒叫 pET30-sa-c;x^(C1551)，鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌 中能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔 基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號(hào)為AF283893，通過(guò)全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和/ e力萬(wàn))克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-peM，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(/ e/W)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即鏈霉親和素基因sa在pET30中在A>71和^^1I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間，脫輔基蛋白基因 c/ Ci (C155I)在pET30中是在fcoRV和7力o I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間；裂合酶基因a7r^W7在 pETDuet-l中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5WII和J/wI之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o厶 peM和peZ^)，力o7和peM在同一個(gè)載體pCDFDuet-l中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)I和 尸"I之間，/ e^9在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)Afate I和J/ o I之間，在pACYCDuet-1中第二個(gè)多 克隆位點(diǎn)和Wo I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別
帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把
所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同
樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在
T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5 ) 將 pETDuet-alr( W;7 、 pET30-sa~c/ cMC155I) 、 pCDFDuet-力o7-/ eZ^和
pACYCDuet-v^W轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工
程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至OD腳為0. 5至0. 8,加入異丙基硫代-(3-D-
半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡(jiǎn)稱(chēng)IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37
'C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B;
離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過(guò)Ni2+親和層析，可提
純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。(1) 從GeneBank中可以査到，藻種J/7a6ae/ a sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測(cè)定完成， #. Ja/w'"osus sp. PCC7603和C^"力ri義sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測(cè)定。A atee/ a sp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(cpc5、 WrM77、力o7); M h/w'/70s^ sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(c; c^); C37"力ri;r sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679,可從所査到序列中找到所需基因。e^和pe/^)。通過(guò)基因工程方法，將力朋6ae/ja sp. PCC7120中的W/^5/7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-aJ/Y^77，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過(guò)上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將屈^M7i/7os^ sp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因cpc5和鏈霉親和素 基因(簡(jiǎn)稱(chēng)sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pCOLADuet中，所得質(zhì)粒叫 pCOLADuet-sa-c;^A鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸桿菌中能 表達(dá)得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋 白藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中査到，編號(hào)為AF283893，通過(guò)全基因合成得到。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和pe/ S)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-pe力5，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(pe/W)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe^，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即鏈霉親和素基因幼和脫輔基蛋白基因cpc5拼接后連接到pCOLADuet的I和戶" I之間；裂合酶基因W/^W7在pETDuet-l中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)i5^7ll和i7wl之間； PEB合成酶基因是3個(gè)(力o7、 pe/W和pe65)，力o7和； e/^在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o7 在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)/Vco I和尸W I之間，peM在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)AWe I和i7 o I之間，peM 在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)j5^II和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別
帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把
所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同
樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: 1混合，在T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5)將pETDuet-aZrt W7、 pC0LADuet-sa"C/ c5、 pCDFDuet-/ o/—/ eZ^禾口 pACYCDuet-pe似 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D,為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (is叩r叩hyl thio-p-D-galactoside，簡(jiǎn)稱(chēng)IPTG)至終濃度為1畫(huà)1/L， 20。C至37。C振蕩表 達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收 集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過(guò)附2+親和層析，可提純得到 相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例10
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種」/7a力ae朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測(cè)定完成， 必73/wV osiAs sp. PCC7603和CaJ"/ r&sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測(cè)定。^ 3tee/7asp. PCC7120 在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(cpM、 Wr。677、力o7);
Ja/w'/7osiAS sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(cpc幼；Ca7o^n'x sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679,可從所查到序列中找到所需基因(peM和pe力A)。通過(guò)基因工程方法，將v^a力a朋a sp.PCC7120中的WrOW7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-aJi^W7，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過(guò)上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
(2) 將J/.h犯'如幼ssp. PCC7603中的藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因cpM(C1551)和鏈 霉親和素基因(簡(jiǎn)稱(chēng)sa)拼接后克隆于Novagen公司的表達(dá)載體pCOLADuet中，所得質(zhì)粒叫 pC0LADuet-sa-c;x^(C1551)，鏈霉親和素基因和藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因拼接后，在大腸 桿菌中能表達(dá)得到鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白的融合蛋白，得到鏈霉親和素標(biāo)記的 脫輔基蛋白藻藍(lán)蛋白B。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號(hào)為AF283893，通過(guò)全基因合成得到。(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和pe6幼克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中，所得質(zhì)粒 叫pCDFDuet-力o卜pe/^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(4)將藻紅膽素生物合成酶基因(pe似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因cpc^(C1551)拼接后連接到pCOLADuet的^boR I和尸WI之間；裂合酶基因WrW77在pETDuet-1中，處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)5^711和J力o I之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o入pe似和； eM)，力o7和； eM在同一個(gè)載體pCDFDuet-l 中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)I和Af I之間，/^Z^在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)AWe I和i7 o I 之間，pe似在pACYCDuet-1中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)勘/ II和i7w I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(5 )將pETDuet-alr0^/7、 pCOLADuet-sa^c; t^(C1551) 、 pCDFDuet-力W-pe/^和 pACYCDuet-z^W轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工 程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡(jiǎn)稱(chēng)IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37 'C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B; 離心收集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過(guò)Ni2+親和層析，可提 純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
實(shí)施例11
(1)從GeneBank中可以査到，藻種七Wae朋sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測(cè)定完成，
vK 7a/w'加s〃s sp. PCC7603和CaJ"/ rj>sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測(cè)定。^朋力ae/ a sp. PCC7120
在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(c; c5、 a&W77、力o7);
必Ja/w'/7M^ sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所查到序
列中找到所需基因(cpc5); CW"力rj'義sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為
AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe^和pe/^)。通過(guò)基因工程方法，將^7a^e朋
sp. PCC7120中的aZrt W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-l中第二位點(diǎn)，將# 7柳i"os"s
sp. PCC7603中藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因cpc5和鏈霉親和素基因(簡(jiǎn)稱(chēng)sa)拼接后克隆于
Novagen公司的pETDuet-1中第一位點(diǎn)，所得質(zhì)粒叫pETDuet-sa-cpc萬(wàn)-aZrM77，在大腸桿
菌中能表達(dá)beta裂合酶以及鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白的融合蛋白。根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過(guò)上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號(hào)為AF283893，通過(guò)全基因合成得到。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和/ eM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-/w7-pe/^，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(/ e/W)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-z eM，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即鏈霉親和素基因ss和脫輔基蛋白基因c/x^拼接后連接到pETDuet的I和At I 之間，s&W77處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)《WII和i7wl之間；PEB合成酶基因是3個(gè)(力o厶
和/7eM)，力o7和peM在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個(gè)多克隆位點(diǎn)Abo I和 I之間，； e/^在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)M/e I和J力o I之間，pe^在pACYCDuet-1中第二個(gè)多 克隆位點(diǎn)i 《Jn和/力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(4) 將pETDuet-sa"cpc^"sZrt W7、 pCDFDuet-Z o7-peZ^和pACYCDuet-/ e/W轉(zhuǎn)入大腸桿 菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0的LB培 養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡(jiǎn)稱(chēng)IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)， 生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收集菌體細(xì)胞，加 入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過(guò)Ni2+親和層析，可提純得到相應(yīng)的鏈霉親和 素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。 實(shí)施例12
(1)從GeneBank中可以查到，藻種細(xì)te簡(jiǎn)sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測(cè)定完成，
髮/柳i/ M"ssp. PCC7603和CaJ"Arj> sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測(cè)定。^ atee朋sp. PCC7120
在GeneBank中編號(hào)為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(cpc仏aJr( W7、力oO;尨J柳/y7osiA9 sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(c/ Ci9); C^W/7/7> sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號(hào)為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因。eW和peZ^)。通過(guò)基因工程方法，將力/73力ae朋 sp. PCC7120中的WrW77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-l中第二位點(diǎn)，將尨/a歷i/70 ^ sp. PCC7603中藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因c;^^(C155I)和鏈霉親和素基因(簡(jiǎn)稱(chēng)sa)拼接 后克隆于N。vagen公司的pETDuet-l中第一位點(diǎn)，所得質(zhì)粒叫pETDuet-sa-cpc取C1551) -W^^77，在大腸桿菌中能表達(dá)beta裂合酶以及鏈霉親和素和藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白的融合 蛋白。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設(shè)計(jì)引物，利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板，通 過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需片段，通過(guò)上下游引物中設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)，把目標(biāo)片段轉(zhuǎn)入相應(yīng)質(zhì)粒中 同樣的酶切位點(diǎn)上。
鏈霉親和素基因可以從GeneBank中查到，編號(hào)為AF283893，通過(guò)全基因合成得到。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和pe65)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-pe65，在大腸桿菌中能同時(shí)表達(dá)H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因。e似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-; eW，在大腸桿菌中能表達(dá)PebA。
即鏈霉親和素基因sa和脫輔基蛋白基因c/ M (C155I)拼接后連接到pETDuet的fcoR I和尸WI之間，a^^《77處于第二個(gè)多克隆位點(diǎn)SWn和之間；PEB合成酶基因是3 個(gè)(力o厶/ eZ^和/ e65)， / W和； e/^在同一個(gè)載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個(gè)多克隆位 點(diǎn)yVco I禾n尸"I之間，pe6S在第二個(gè)多克隆位點(diǎn)AWe I和J/ o I之間，pe^在pACYCDuet-1 中第二個(gè)多克隆位點(diǎn)AWII和i7 o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，分上下游， 一對(duì)；上游下游引物分別 帶有酶切位點(diǎn)；利用相應(yīng)的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增得到所需基因片段，把 所得基因片段進(jìn)行電泳，回收；所得片段用設(shè)計(jì)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，同時(shí)把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時(shí)間(一般4 6小時(shí))；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗(yàn)證正確即可。
(4) 將pETDuet-stcpc》(C155I)-a7/^W7、 pCDFDuet-力o7-/ e65和pACYCDuet-/ eM轉(zhuǎn) 入大腸桿菌，當(dāng)這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷
(isoprophyl thio-卩-D-galactoside，簡(jiǎn)稱(chēng)IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達(dá)約12小時(shí)，生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B;離心收 集菌體細(xì)胞，加入緩沖液、破碎細(xì)胞后，離心收集上清液，通過(guò)Ni2+親和層析，可提純得到 相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻藍(lán)蛋白B。 將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實(shí)施例1相同。
上述制備方法適用于采用各種藍(lán)藻中的beta裂合酶、藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白、藻紅膽素 生物合成酶基因或其同源基因來(lái)制備鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)， 但涉及到微生物菌種公開(kāi)的問(wèn)題，本發(fā)明只選用了 GenBank中已公開(kāi)全序列的藍(lán)藻A7a&e朋 sp. PCC7120和已經(jīng)部分測(cè)序的尨J柳i/ ows sp. PCC7603和(^Jo^ n> sp. PCC7601為例對(duì) 本發(fā)明方法加以說(shuō)明，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述公開(kāi)的內(nèi)容采用其它原料實(shí)施本發(fā)明。
權(quán)利要求
1. 一種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于包括下述步驟(1)用基因工程方法，將beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表達(dá)載體中，得到beta裂合酶表達(dá)質(zhì)粒；(2)用基因工程方法，將藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因或其同源基因與鏈霉親和素基因拼接后克隆于第二個(gè)表達(dá)載體中，得到鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；(3)用基因工程方法將藻紅膽素生物合成酶基因hol和pebB或其同源基因克隆于第三個(gè)表達(dá)載體中，得到hol和pebB表達(dá)質(zhì)粒；(4)用基因工程方法將藻紅膽素生物合成酶基因pebA或其同源基因克隆于第四個(gè)表達(dá)載體中，得到pebA表達(dá)質(zhì)粒；(5)將beta裂合酶表達(dá)質(zhì)粒、鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、hol和pebB表達(dá)質(zhì)粒及pebA表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌，應(yīng)用此工程菌通過(guò)發(fā)酵工程生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)。
2. —種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在 于包括下述步驟(1) 用基因工程方法，將beta裂合酶基因或其同源基因、藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因 或其同源基因與鏈霉親和素基因拼接后同時(shí)克隆于表達(dá)載體中，得到beta裂合酶和鏈霉親和 素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒；(2) 用基因工程方法將藻紅膽素生物合成酶基因力o7和；^/^或其同源基因克隆于第二 個(gè)表達(dá)載體中，得到力W和peM表達(dá)質(zhì)粒；(3) 用基因工程方法將藻紅膽素生物合成酶基因或其同源基因克隆于第三個(gè)表達(dá) 載體中，得到peW表達(dá)質(zhì)粒；(4) 將beta裂合酶和鏈霉親和素標(biāo)記的脫輔基蛋白表達(dá)質(zhì)粒、力W和/^Z^表達(dá)質(zhì)粒及 peM表達(dá)質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當(dāng)這些表達(dá)質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應(yīng)的工程菌， 應(yīng)用此工程菌通過(guò)發(fā)酵工程生產(chǎn)鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)； 發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應(yīng)的鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋 白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的宿主菌為大腸桿菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的beta裂合酶基因是指與力朋&e朋sp. PCC7120中aZrt W7基因同源的基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白基因是 指與力y a6ae朋sp. PCC7120或M ^/w';70幼s sp. PCC7603中c; c5基因同源的基因。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合藻紅膽素的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)的制備方法，通過(guò)應(yīng)用藻膽蛋白beta裂合酶催化藻紅膽素與鏈霉親和素標(biāo)記的藻藍(lán)蛋白類(lèi)脫輔基蛋白共價(jià)結(jié)合，制備鏈霉親和素標(biāo)記的結(jié)合PEB的藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)。本發(fā)明的方法應(yīng)用生物過(guò)程生產(chǎn)藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)，是一種環(huán)境友好的生產(chǎn)方法。藻藍(lán)蛋白類(lèi)熒光蛋白質(zhì)能應(yīng)用于食品、保健與醫(yī)藥功能材料領(lǐng)域，特別是應(yīng)用為生物和醫(yī)學(xué)分子監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的熒光探針。
文檔編號(hào)C12N15/60GK101469332SQ20071003293
公開(kāi)日2009年7月1日 申請(qǐng)日期2007年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月27日
發(fā)明者佟順剛, 明 周, 坤 夏, 趙開(kāi)弘 申請(qǐng)人:廣州天寶頌原生物科技開(kāi)發(fā)有限公司;華中科技大學(xué)