專利名稱：：轉(zhuǎn)基因陰溝腸桿菌GEI-tcdA1B1及其構(gòu)建方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體來說是涉及一種轉(zhuǎn)基因陰溝腸桿菌菌株、其構(gòu)建方法及其用途。技術(shù)背景白蟻在昆蟲分類系統(tǒng)上屬于比較原始的等翅目(Isoptera)，是一類營群體生活的社會性昆蟲。其作為世界性的重要害蟲之一而對經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生的危害，已逐步被人類所重視。在我國其活動分布遍布28個省(自治區(qū)或地區(qū))，特別是淮河以南地區(qū)，白蟻對堤壩、建筑物、農(nóng)作物和林木的危害尤為嚴(yán)重。但由于它的危害隱蔽，不易被人們及早發(fā)現(xiàn)，往往造成嚴(yán)重破壞，產(chǎn)生重大損失。我國曾于1985年調(diào)査統(tǒng)計，在24個地區(qū)因白蟻危害造成的直接經(jīng)濟(jì)損失就達(dá)19億元人民幣；日本每年因白蟻危害造成的損失相當(dāng)于其國內(nèi)每年因火災(zāi)造成的損失量；在美國，因臺灣乳白蟻(Copto^roes/o;7wora"^Shiraki,Isoptera:Rhinotermitidae)造成的直接損失和用于防治其危害的經(jīng)費每年高達(dá)10億美元。白蟻的危害雖然引起了廣泛的關(guān)注，但白蟻群往往占據(jù)非常大的區(qū)域和有數(shù)目眾多的家庭成員，并且通常很難找到包括生殖蟻的精確位置(特別是對地棲白蟻)，所以白蟻防治面臨巨大的挑戰(zhàn)(黃蔚蓉，安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，32:252-253)。目前，對白蟻的防治有物理性預(yù)防措施，化學(xué)措施和生物防治措施，盡管物理預(yù)防措施能形成有效的、較為長期的屏障，但是一旦發(fā)生白蟻侵入危害，由于白蟻巢區(qū)和種群數(shù)量大、采食范圍廣，通過有翅生殖蟻擴(kuò)散或工蟻穿過未處理或處理不透的部位也可再次造成危害，使防治極為困難。而化學(xué)措施普遍采用持效殺蟲劑處理土壤來預(yù)防白蟻危害，其主要成份是氯丹和其它環(huán)戊二烯類，大量地使用殘效期長久的殺蟲劑溶液來阻止地下白蟻的侵害，對環(huán)境和非目標(biāo)生物體造成極大的潛在危害。與化學(xué)防治相比，生物防治具有更好的環(huán)境接受性。如果成功地實行，可獲得對環(huán)境影響最小、經(jīng)濟(jì)實用的持久防治效果。雖然傳統(tǒng)的生物防治措施已用于多種害蟲的防治，但由于捕食性天敵、擬寄生物和病原微生物自身的局限，如環(huán)境耐受范圍窄、其它生物之間的頡抗作用、活動范圍小、毒力低及白蟻的天然防衛(wèi)行為，傳統(tǒng)的生物防治措施大多未能形成持久的、自身維持白蟻種群數(shù)量在經(jīng)濟(jì)損失水平之下的控制因子(CullineyandGrace,5"http://.五"tomo.ies.,2000,90:9-21)。就是其中最有前景的病原微生物(包括線蟲、病毒、細(xì)菌和真菌)作為生物防治機(jī)制的成功應(yīng)用也受到很多問題的限制。例如，病原性微生物本身通常具有很小的或沒有流動性，蟻群對感染的白蟻個體的隔離行為也限制了它們在白蟻群體內(nèi)的分布與擴(kuò)散；排斥性或太快的白蟻死亡率將引起對接種源的規(guī)避行為，極大地限制了病原菌在蟻群中的傳播。而且，正與化學(xué)殺蟲劑一樣，病原微生物在整個種群中的傳播需要很多被接種的個體和大劑量的接種物，這對不容易接近的地棲白蟻而言是很難達(dá)到要求的(Lai，D.Z)/饑，t/m'vera/(yo///awa".,1977,140pp;Grace,C2Xf/KiVocee^>zg&f/m'vera/^o/他而仏，1995,166-167)。因此，要達(dá)到長久防治白蟻的目的必須探索新的途徑，在方法上有所突破。眾所周知白蟻腸腔中具有數(shù)量眾多的腸道微生物群(如大量的鞭毛蟲和細(xì)菌)，并且二者存在著互惠共生關(guān)系。一方面這些微生物將白蟻取食的食物轉(zhuǎn)化為可利用的營養(yǎng)，同時也可利用白蟻排泄的廢物，是白蟻必不可少的"生活伙伴"；另一方面，這些微生物也有特異的生存需求和對某些物種的高度特異性，在環(huán)境中或非目標(biāo)生物中存活率低。目前，有關(guān)利用白蟻腸道共生微生物來防治白蟻的報道較少，但隨著分子生物學(xué)和基因重組技術(shù)的發(fā)展，殺蟲蛋白基因的分離、重組蛋白的功能鑒定，轉(zhuǎn)基因抗蟲作物及殺蟲蛋白作用機(jī)制的研究也促進(jìn)了這一方面工作的進(jìn)展。2005年，Husseneder等在臺灣乳白蟻體內(nèi)用重組大腸桿菌表達(dá)了綠色熒光蛋白(GFP)基因，盡管重組菌很快被白蟻取食進(jìn)入后腸，但由于宿主的抗性和免疫反應(yīng)重組菌在白蟻腸道存活了不到一周，所以利用外源微生物在白蟻體內(nèi)表達(dá)外源基因存在能否適應(yīng)白蟻腸道的生存環(huán)境和選擇壓力的問題(HussenederWa/.，CwArAfcroWo/.，2005，50:119-123)。接著Husseneder等就選用了白蟻腸道共生菌——陰溝腸桿菌(五"teratocterc/o化ae)在白蟻體內(nèi)來表達(dá)綠色熒光蛋白基因，并估定了陰溝腸桿菌攜帶外源基因在白蟻群體中傳送、表達(dá)和傳播的效率，結(jié)果顯示重組陰溝腸桿菌在宿主中繁殖存活了三個月，并且工程菌可在群體成員間傳播(HussenederandGrace,Jpp/M/croWo/A'ofec/wo/.,2005，68:360—367)。因為陰溝腸桿菌容易被分離、培養(yǎng)和轉(zhuǎn)移外源基因，所以在病蟲害防治中有廣泛的應(yīng)用。Watanabe等就曾經(jīng)用表達(dá)冰核基因的陰溝腸桿菌成功地降低了桑樹螟蛾幼蟲的過冷卻點(WatanabeWa/.，J々p/MZcroWo/.，2000,88:90-97)。張新建等也用表達(dá)冰核基因的陰溝腸桿菌成功地降低了玉米螟幼蟲的過冷卻點(張新建等，中國農(nóng)業(yè)科學(xué).2004,37:227-232)。所以選擇陰溝腸桿菌這樣的白蟻腸道共生微生物作為載體在白蟻種群中傳送和表達(dá)殺蟲基因?qū)前紫伔乐沃械囊环N新方法。通過其喂食機(jī)制，殺蟲毒素可作為持續(xù)的資源在群體中保持，能逐漸消除白蟻種群，并能避免對環(huán)境的危害。在有關(guān)殺蟲基因的研究方面，無疑從昆蟲病原線蟲共生菌中克隆新的殺蟲毒素基因是近幾年的熱點。目前已從昆蟲病原線蟲共生菌中克隆出與口服活性有關(guān)的多個毒素基因，1998年，Bowen首次報道在發(fā)光桿菌屬(尸totor/jaMus/wm'"esce"s)W14中存在4個編碼昆蟲毒素蛋白復(fù)合體的基因簇(Bowenefa/，々少/.五謂'ro".M/croWo/.，1998，64:3029-3035)，使昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌殺蟲毒素蛋白基因成為微生物殺蟲蛋白基因家族中的一員。Morgan等從致病桿菌屬(^eTO^Wrf^)H31和173菌株中分離到高活性殺蟲蛋白，對歐洲粉蝶(尸/en;s6ray^cae)、小菜蛾(7VM/e〃axj//oy/e〃fl)、葉甲(/V;"etfowcoc力/ear/ae)有很高的致死率(Morganetal"^p/￡>jWrowM'croto/"2001,67:2062-2069)。Waterfield等從尸./國'腦固sW14菌株中發(fā)現(xiàn)了一個127816bp的致病島，包含9個獨立的fc毒素基因，接著構(gòu)建了fca、fc6、fcc和to/基因大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，對fc基因表達(dá)蛋白功能分析結(jié)果認(rèn)為toi4、fcc/S、tocC是對煙草天蛾幼蟲具有殺蟲活性的主效基因(Waterfieldetal.,々^/￡"v/to"M/ctoWo/.，2001,67:5017-5024)。Morgan等分離到的X"ewatop/7a殺蟲蛋白基因簇由xp"/、x/7f57、x;7fC7禾口c/"2組成(Morganetal.，Jp;/五"Wro"^MicroWci/.,2001，67:2062-2069)。2003年尸./,."證raTT01菌株基因組全序列測序完成，序列分析表明尸./w冊'"esce"s為已知基因組序列的細(xì)菌中含有殺蟲毒素基因最多的一種細(xì)菌，這些毒素基因?qū)Χ喾N害蟲具有毒殺和抑制生長活性的作用(Ericetal，Ato及'o/ec/ww/.，2003,21:1307-1313)。這些研究表明昆蟲病原線蟲共生菌所產(chǎn)生的殺蟲毒素蛋白可作為新的殺蟲毒素蛋白基因源，具有很好的商業(yè)潛力和應(yīng)用前景，并給白蟻防治帶來了新的希望。但是，目前仍未發(fā)現(xiàn)利用轉(zhuǎn)殺蟲毒素基因的陰溝腸桿菌防治白蟻的報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提出一種可引入并作用于臺灣乳白蟻種群，對白蟻具有口服毒性的轉(zhuǎn)基因工程菌一轉(zhuǎn)基因陰溝腸桿菌(五"terotocto"c/oacae)GEI-tcdAlBl菌株，及其構(gòu)建方法和用途。這是一種采用基因工程技術(shù)，構(gòu)建表達(dá)外源殺蟲基因的白蟻腸腔共生細(xì)菌的轉(zhuǎn)基因工程菌，將這種表達(dá)外源基因的白蟻共生細(xì)菌作為誘餌喂養(yǎng)白蟻，重組細(xì)菌在白蟻腸腔中繁殖，可產(chǎn)生致死白蟻的殺蟲蛋白。這將是可持續(xù)控制白蟻的安全有效的方法。本發(fā)明所提出的轉(zhuǎn)基因陰溝腸桿菌(Ewtero6ac^c/oacae)GEI-tcdAlBl菌株，是從白蟻的腸道主要細(xì)菌-陰溝腸桿菌入手，利用Tn5轉(zhuǎn)座子將從昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌尸/0^^^^^/";/"^"^丁丁01菌株中克隆的兩個殺蟲毒素基因fc^757基因(SEQIDNO.l)插入到陰溝腸桿菌的基因組DNA中，構(gòu)建而成的對白蟻具有口服毒性的轉(zhuǎn)基因工程菌。該菌株于2007年12月24日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，編號為CCTCCM207208，中國典型培養(yǎng)物保藏中心的地址為中國武漢市武漢大學(xué)。研究表明，白蟻個體攝取轉(zhuǎn)基因工程菌后，通過其喂食機(jī)制，殺蟲毒素可作為持續(xù)的資源在群體中轉(zhuǎn)移，能逐漸消除白蟻種群，并能避免對環(huán)境的危害，進(jìn)而實現(xiàn)對這種入侵害蟲的長期控制。本發(fā)明構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因陰溝腸桿菌(EWeTO&ac^c/oacae)命名為陰溝腸桿菌GEI-tcdAlBl菌株。該菌株是利用Tn5轉(zhuǎn)座子將昆蟲病源線蟲共生菌兩個殺蟲毒素基因插入到陰溝腸桿菌的基因組DNA中，用于表達(dá)殺蟲毒素蛋白的工程菌。本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因陰溝腸桿菌GEI-tcdAlBl菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟1)從昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌戶/iwm'"esce"sTT01菌株中克隆兩個殺蟲毒素基因fcci4/3/。2)利用微轉(zhuǎn)座子載體pMini-Tn5，將toi4M/基因置入轉(zhuǎn)座單位里，構(gòu)建"自殺性"工程質(zhì)粒pMini-Tn5-tcdAlBl。3)將構(gòu)建的工程質(zhì)粒pMini-Tn5-tcdAlBl導(dǎo)入陰溝腸桿菌中。4)測定to^757基因整合到腸道細(xì)菌陰溝腸桿菌基因組DNA上，得到本轉(zhuǎn)基因陰溝腸桿菌GEI-tcdAlBl。本發(fā)明所構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因陰溝腸桿菌GEI-tcdAlBl菌株，可用于以下測定1)免疫印跡測定fcoL4/5/基因在轉(zhuǎn)基因陰溝腸桿菌中的表達(dá)。2)轉(zhuǎn)基因陰溝腸桿菌的生物活性測定。3)測定轉(zhuǎn)基因陰溝腸桿菌在蟻群中的轉(zhuǎn)移。利用本發(fā)明構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因陰溝腸桿菌培養(yǎng)物混入白蟻飼料(一般為濾紙)喂養(yǎng)白蟻，結(jié)果顯示20天后，處理白蟻的校正死亡率約為54%。證明轉(zhuǎn)基因陰溝腸桿菌對白蟻具有口服毒性作用。因此，本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)基因陰溝腸桿菌GEI-tcdAlBl菌株可作為制備殺滅入侵白蟻誘餌藥劑的應(yīng)用。圖1顯示從載體pUC19中克隆到的tocZ啟動子片段，其中的限制性酶切位點J^al和5^n被用在與載體pET32a(+)的連接中，WWI位點被用在與載體pMini-Tn5的連接中。圖2a是toi4757基因片段在質(zhì)粒pET32a(+)-tcdAlBl中的連接方式，所標(biāo)注的限制性酶切位點用于以后的亞克隆中，本圖標(biāo)注了對應(yīng)各片段的大?。籦是基因片段在GEI-tcdAlBl染色體中的連接方式。圖3顯示SDS-PAGE分析GEI-tcdAlBl中重組TcdAlBl蛋白的表達(dá)。條帶M,TakaRa窄范圍蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(44.3-200kDa);1，GEI-tcdAlBl;2，￡.c/oacae。圖4顯示SDS-PAGE分析尸.Zwm力escemTT01中TcdAlBl蛋白的表達(dá).條帶M,TakaRa窄范圍蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(44.3-200kDa);/w/m'"esce"sTT01。圖5顯示W(wǎng)esternblot分析GEI-tcdAlBl和尸./w附/"esce"sTT01中TcdAlBl蛋白的表達(dá).條帶M,Hou-Bio預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(2-200kDa);1,GEI-tcdAlBl;2,尸./wTO'"&scemTT01。圖6顯示工程菌GEI-tcdAlBl對白蟻的致死率測定，測定時間為20天，每個處理三個重復(fù)，標(biāo)注標(biāo)準(zhǔn)誤差和方差分析，同項目中不同字母者表示在0.05水平上差異顯著，字母后的數(shù)字分別代表三個不同處理。圖7顯示工程菌GEI-tcdAlB112小時內(nèi)在蟻群中的傳播，柱狀圖顯示在每個時間段受體白蟻帶菌的百分率，每個處理三個重復(fù)，標(biāo)注標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖8顯示6天內(nèi)工程菌GEI-tcdAlBl在不同比例蟻群(l:l，1:10,l:50)中的傳播，柱狀圖顯示受體白蟻帶菌的百分率，每個處理三個重復(fù)，標(biāo)注標(biāo)準(zhǔn)誤差和方差分析，同項目中不同字母者表示在0.05水平上差異顯著，字母后的數(shù)字分別代表三個不同處理。具體實施方式以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，不是對本發(fā)明的限制。實施例一殺蟲毒素基因的克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)提取i>/柳!V^cemTT01的基因組，用《p"I和5aw//1酶切基因組，回收大約14kbp左右的基因片段，這個片段包括完整的to^7和大部分的fcW7，用相同的酶酶切載體pUC19,進(jìn)行體外連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。以菌落PCR方法對長出的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行快速篩選，PCR引物為Pl(見表l)。挑取經(jīng)初步鑒定的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，接種到6mLLB抗性液體培養(yǎng)基中少量增殖，使用TIANGEN質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。將上一步所提取質(zhì)粒進(jìn)行/:p"I和萬aw/n雙酶切，回收約14kbp的片段，與pET32a(+)進(jìn)行體外連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Eco/ZBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，以引物P1進(jìn)行PCR鑒定，陽性克隆子命名為pET32a(+)-tcdAlBl-l。用Easy-A高保真酶從TT01基因組中擴(kuò)增1的上游片段約638bp，擴(kuò)增所用引物為P3(見表1)。Z6aI禾BK/7"I雙酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET32a(+)-tcdAlBl-l，回收相應(yīng)片段并進(jìn)行體外連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌五.co/z'BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞以引物P1進(jìn)行PCR鑒定，陽性克隆子命名為pET32a(+)-tcdAlBl-2。表1.實驗中所用到的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注劃線標(biāo)注的分別是限制性酶切位點印AI，IandJKwI.。為了殺蟲毒素基因能夠在陰溝腸桿菌中獲得更好的表達(dá)，本發(fā)明從載體pUC19中擴(kuò)增出fccZ啟動子片段(見圖i)，引物為P2(見表i)，上游引物包括sp/ji和油n酶切位點，下游引物包括^zwi。和JHwI酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET32a(+)-tcdAlBl-2并進(jìn)行體外連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌￡.co/ZBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，用引物P1進(jìn)行PCR鑒定，陽性克隆子命名為pET32a(+)-tcdAlBl(見圖2a)。取活化后的重組大腸桿菌和對照的培養(yǎng)物，按3。/。比例接種至新鮮LB(Cart培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD咖為0.40.6，加入IPTG至終濃度為1mmol/L，37°C,200r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)8h。取0.2mL誘導(dǎo)后發(fā)酵液至1.5mL潔凈離心管中，離心得菌體，加入50nL雙蒸水與50nL2XSDS-PAGE上樣緩沖液等體積混合，沸水浴10min,進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析兩個毒素基因在大腸桿菌中的表達(dá)。質(zhì)粒pET32a(+)-tcdAlBl于大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后作為抗原用于制備抗體。實施例二利用微轉(zhuǎn)座子載體pMini-Tn5，構(gòu)建"自殺性"工程質(zhì)粒pMini-Tn5-tcdAlBl,載體pMini-Tn5是具有廣泛宿主接合轉(zhuǎn)移特性(含有wo6片段，可被轉(zhuǎn)移基因fra產(chǎn)物識別)和Tn5轉(zhuǎn)座作用(含有轉(zhuǎn)座子Tn5的f"p基因和轉(zhuǎn)座必需的末端序列)的自殺性質(zhì)粒(含有R6K的復(fù)制起點，在沒有^V基因存在的細(xì)菌中不能復(fù)制)，而且其Tn5轉(zhuǎn)座酶位于兩個末端序列的外側(cè)，當(dāng)發(fā)生轉(zhuǎn)座以后，因為缺少轉(zhuǎn)座酶基因而不會再次轉(zhuǎn)座，避免了轉(zhuǎn)基因工程菌對生態(tài)環(huán)境的潛在威脅。此外，該載體上Tn5轉(zhuǎn)座子兩個末端序列之間插入卡那霉素抗性基因，有利于重組克隆的篩選。建立轉(zhuǎn)座載體pMini-Tn5的Won酶切反應(yīng)體系，并對酶切后的載體片段進(jìn)行脫磷處理。采用TIANGEN公司生產(chǎn)的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收載體pMini-Tn5約6.8kb的片段和質(zhì)粒pET32a(+)-tcdAlBl中約14kb的fcAWS/插入片段。利用TaKaRa的CIAP對載體回收片段進(jìn)行脫磷處理。將目的片段與轉(zhuǎn)座載體進(jìn)行體外連接并將連接產(chǎn)物(具有Km抗性標(biāo)記)導(dǎo)入co//S17-1(A;^)感受態(tài)細(xì)胞中。利用PCR和Wwl酶切鑒定陽性克隆，用其作為下一步接合實驗的供體菌。載體pMini-Tn5經(jīng)Atol酶切后，載體DNA5'端帶有磷酸基團(tuán)，如用此載體直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，其自身環(huán)化幾率非常高，影響連接、轉(zhuǎn)化效率。因此使用堿性磷酸酶(CIAP)對其進(jìn)行脫磷處理。建立以下體系pMini-Tn5酶切體系44pL10xAlkalinePhosphataseBuffer5CIAP(1030U爾L)_1pLTotalvolume50|aL37'C水浴30分鐘后，采用TIANGEN瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收載體片段。實施例三將構(gòu)建的工程質(zhì)粒pMini-Tn5-tcdAlBl導(dǎo)入陰溝腸桿菌中。pMini-Tn5含有廣宿主范圍IncP質(zhì)粒RP4的mo6基因。大腸桿菌S17-l(義p的染色體上整合有RP4質(zhì)粒的加基因。因此，當(dāng)pMini-Tn5轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Sn-101一)B寸，后者即能提供一反式作用元件與前者的mo6區(qū)相作用，促使pMini-Tn5質(zhì)粒能夠被接合轉(zhuǎn)移進(jìn)入其他革蘭陰性菌，但是發(fā)生轉(zhuǎn)移的只是載體部分，大腸桿菌S17-1(A;7的染色體上的RP4質(zhì)粒整合區(qū)并不被轉(zhuǎn)移至受體菌中。1)供體菌的培養(yǎng)將重組^.7//817-1于LB(KmO平板劃線，在37'C下培養(yǎng)過夜，挑單菌落接入10mLLB(KmO培養(yǎng)液中，在37'C下培養(yǎng)過夜，然后以l:10的接種量接入帶同樣抗菌素的新鮮培養(yǎng)液，于37'C，200r/min培養(yǎng)12小時(OD,值約為1.0)。2)受體菌的培養(yǎng)將陰溝腸桿菌(具有Cm抗性)于LB(CmO平板劃線，在28'C下培養(yǎng)過夜，挑單菌落接入10mLLB(Crf)培養(yǎng)液中，在28'C下培養(yǎng)過夜，然后以l:IO的接種量接入帶同樣抗菌素的新鮮培養(yǎng)液，于28'C，200r/min培養(yǎng)12小時(OD,值約為1.0)。3)供體菌和受體菌的接合(1)將對數(shù)期供體菌和受體菌在1000r/min離心10分鐘，以無菌10mmol/LMgS04(或無菌0.9%NaCl)清洗菌體一次以除去抗菌素，1000r/min再次離心10分鐘。(2)重懸菌體于無菌10mmol/LMgSO4中(或無菌0,9%NaCl)，并調(diào)整菌濃度(OD600=1.0)。(3)將供體菌和受體菌分別以1:5，2:4，3:3，4:2，5:1的比例混合，3000r/min離心5分鐘。(4)留100nL上清重懸菌體后濃縮在孔徑為0.2nm的硝酸纖維素濾膜(高壓滅菌)上。(5)濾膜置于LB培養(yǎng)基平板表面，28'C培養(yǎng)24小時，可見濾膜上長出一層菌膜。(6)用約10mLMgSO4(10mmol/L)將菌膜洗下后稀釋成不同濃度(可x10,x跳xioOO，x腦00),在LB平板(含Km和Cm)上涂布，28'C培養(yǎng)48小時(或根據(jù)菌株的生長情況確定)，挑取具有Km、Cm雙抗性的接合子。4)陰溝腸桿菌中的質(zhì)粒分離鑒定pMini-Tn5質(zhì)粒的自殺性來源于其有缺陷的R6K復(fù)制子，而此復(fù)制子必須在有義p/r基因編碼的兀蛋白的條件下才能行使其復(fù)制功能，也就是該載體只有在轉(zhuǎn)導(dǎo)有含基因的X原噬菌體的宿主菌中才能進(jìn)行復(fù)制。由于陰溝腸桿菌中沒有p!V基因存在，因此所構(gòu)建的pMini-Tn5-tcdAlBl質(zhì)粒在陰溝腸桿菌中也不能自我復(fù)制。從Km和Cm雙抗LB平板上隨機(jī)挑取長出的接合子，利用質(zhì)粒分離試劑盒從接合子中分離質(zhì)粒，鑒定pMini-Tn5-tcdAlBl是否存在。如果未發(fā)現(xiàn)pMini-Tn5-tcdAlBl質(zhì)粒存在，說明接合子所表現(xiàn)的抗性是由于轉(zhuǎn)座的作用將抗性基因整合的結(jié)果。實施例四測定fcflL4/S7基因整合到腸道細(xì)菌陰溝腸桿菌基因組DNA上。pMini-Tn5-tcdAlBl重組質(zhì)粒在無選擇壓力下會自然脫落并將fc^/S/基因整合到宿主染色體DNA上。通過提取接合子DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增(見下)，若能擴(kuò)出目的基因片段則可再次驗證tcdAlBl基因是否已整合到陰溝腸桿菌的基因組中。建立以下反應(yīng)體系I體系II體系ddH20ddH2019.8|_iL10XPCRbuffer10XPCRbuffer2.5dNTPMix(10mmol/L)dNTPMix(10mmol/L)0.5P4-for(10pmol/L)PI-for(10nmol/L)0.5&P卜rev(10|xmol/L)PI-rev(10nmol/L)0.5DNAtemplateDNAtemplate1TaqDNAPolymeraseTaqDNAPolymerase0.2TotalvolumeTotelvolume25I體系以pMini-Tn5載體上Km抗性基因的特異性引物P4-for為反應(yīng)的上游引物，toW7S/基因的特異性引物Pl-rev為該反應(yīng)的下游引物。II體系以目的基因toi4^W的特異性引物P1為反應(yīng)的上下游引物。進(jìn)行如下PCR程序<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，在合適大小處出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶的樣品即為陽性克隆。電泳結(jié)果顯示，fc^M/基因已插入陰溝腸桿菌染色體DNA中，且位于Km抗性基因下游，方向一致。Southernblot進(jìn)一步鑒定目的基因整合到陰溝腸桿菌的染色體上，以引物P4擴(kuò)增Tn5轉(zhuǎn)座子中的卡那抗性基因作為Southernblot的探針。提取工程菌RNA，并進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，以檢測fcoWIW在工程菌中的轉(zhuǎn)錄情況。RT-PCR結(jié)果顯示說明fcdL4757基因在工程菌中實現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄。fcoL4M/基因傳代穩(wěn)定性測定按照如下方法進(jìn)行。挑取經(jīng)鑒定正確的接合子接種5mLLB(含Km和Cm)，28°C，200r/min搖培36小時，按3%接種量繼代培養(yǎng)(培養(yǎng)液中不再添加抗生素)，每12小時轉(zhuǎn)接l次，在不添加抗生素的LB平板上劃線，培養(yǎng)24小時后隨機(jī)挑取50個菌斑復(fù)印到LB(含Km和Cm)平板上，統(tǒng)計長出菌落的數(shù)目。在無抗性平板上連續(xù)傳代15次，如果菌株可在抗性平板上繼續(xù)生長，說明轉(zhuǎn)座子在受體菌的染色體上是穩(wěn)定傳代的。將重組菌在無抗性的LB(不含抗生素)中連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)15次后仍能在Km和Cm雙抗LB平板上生長。表明/^抗性基因和to^757基因己整合到陰溝腸桿菌的基因組，并具有良好的穩(wěn)定性。實施例五TcdAlBl蛋白抗血清的制備及ELISA測定1)蛋白純化本發(fā)明使用Novagen的BugBuster蛋白抽提試劑、Benzonase及rLysozyme對大腸桿菌BL21(DE3)/pET32a(+)-tcdAlBl的蛋白進(jìn)行抽提，用Ni-NTAHisbind純化試劑盒純化蛋白。參照郭堯君編著的《蛋白質(zhì)電泳技術(shù)》提取i5/wm/"esce"sTT01的殺蟲毒素蛋白。2)抗血清的制備以無菌PBS緩沖液溶解抗原，使總蛋白的濃度為2mg/mL，將弗氏完全佐劑與抗原溶液以1:1比例混合，在干凈無菌的研缽內(nèi)研磨，直至形成穩(wěn)定的油包水型乳劑(一小滴乳劑在水面上不擴(kuò)散)。免疫前，耳緣靜脈采血約2mL。置37。C1h，4。C靜置過夜使血清析出，離心(2000r/min，4°C，10min)，吸取上清，分裝后-8(TC保存。用弗氏完全佐劑乳化的抗原溶液，在兔背部、大腿處進(jìn)行皮內(nèi)、肌肉多點注射。皮內(nèi)注射每處約O.lmL，共注射20-30處；肌肉注射每點1mL，兩點注射。注射完畢，輕輕按摩注射部位以幫助吸收，注射位置出現(xiàn)白色小皮丘。一周后，用弗氏不完全佐劑乳化的抗原進(jìn)行加強(qiáng)免疫，過程同初次免疫。每隔一周，以PBS溶解的抗原(總蛋白濃度為2mg/mL)加強(qiáng)免疫一次。免疫4次后，間接ELISA法測定抗血清效價上升情況。血清中抗體的效價上升且達(dá)到穩(wěn)定值后，加強(qiáng)免疫一次，一星期后采血獲得大量抗血清；3)ELISA測定原理將抗原吸附在固相載體表面，加入抗血清，抗體和抗原在載體表面形成抗原-抗體復(fù)合物，洗去未結(jié)合抗體，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(抗體的抗體)，二抗與抗體結(jié)合，洗去未結(jié)合二抗，加底物顯色劑顯色，在一定波長下測定OD值，根據(jù)OD值判斷血清中抗體的產(chǎn)生情況。步驟如下以包被液(碳酸鹽緩沖液)包被抗原溶液，使抗原終濃度為2.5pg/mL;在酶聯(lián)板的每孔中加入lOOpL抗原包被液，處理及對照包括抗原包被液+—抗+二抗和抗原包被液+二抗，輕輕振動平板使抗原分布均勻，將包被的微量滴定板用塑料保鮮膜封好，37'C潮濕孵育60min，再置4'C過夜；加有抗原溶液的微量滴定板封好后于4'C可保存數(shù)月。次日，在洗板機(jī)上用PBST洗滌三次；每孔加入150|aL~200nL封閉液，37。C潮濕孵育60min;倒掉封閉液，用PBST洗滌三次，最后每塊滴定板用一大紙巾包裹，孔口朝下，在幾張紙巾上輕輕拍打，棄去殘余的液體；用稀釋液將抗血清做i:20、i:40、i:80、i:160稀釋，取ioojxL分別加入到對應(yīng)包被孔中，微量滴定板用塑料保鮮膜封好，37'C潮濕孵育60min;洗板機(jī)上用PBST洗滌三次，最后一次洗滌后，如步驟5所述棄去殘余液體；每孔中加入100nL辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗稀釋液(1:10000稀釋)，37'C潮濕孵育60min，洗滌三次；混合TMB底物溶液A液與B液，每孔加入50|iL，37'C顯色15~30min;每孔中加入502mol/L&804終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀上測定OD450值。實施例六SDS-PAGE和Westernblot印記分析基因工程菌中毒性蛋白的表達(dá)1)SDS-PAGE取活化后的P/"/m'"^ceraTT01的培養(yǎng)物按3%比例接種至新鮮LB培養(yǎng)基中，基因工程菌以及對照的培養(yǎng)物，按3。/。比例接種至新鮮LB(Kmr和Cm。培養(yǎng)基中，28°C,200r/min培養(yǎng)24h。取0.2mL發(fā)酵液至1.5mL潔凈離心管中，離心得菌體，超聲破碎后與2XSDS-PAGE上樣緩沖液等體積混合,沸水浴10min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，圖3和圖4結(jié)果證明兩個毒素基因的表達(dá)。2)Westernblot印記準(zhǔn)備足夠的轉(zhuǎn)印緩沖液，用于填充轉(zhuǎn)印槽及平衡凝膠、PVDF膜和濾紙；？/訓(xùn)/"esmwTT01和工程菌的培養(yǎng)物SDS-PAGE蛋白電泳后，從玻璃板上卸下凝膠，小心剔去濃縮膠部分，同時切下分離膠的左上角作為方向標(biāo)記；剪下與膠等大小的PVDF膜1張及Whatman3mm濾紙片6張；將凝膠浸于轉(zhuǎn)印緩沖液中平衡30min，濾紙至少平衡30s;將膜浸于甲醇中活化至少15s，膜將由不透明變?yōu)榘胪该鳡?，小心將膜浸于雙蒸水中2min，然后在轉(zhuǎn)印緩沖液中至少平衡5min;從負(fù)極開始依次放入3張濾紙、膠、膜、另3張濾紙，注意不要有氣泡；將夾板移入預(yù)先裝有轉(zhuǎn)印緩沖液的轉(zhuǎn)印槽中，補(bǔ)加緩沖液至完全覆蓋夾板；打開制冷系統(tǒng)，連接電源，恒流轉(zhuǎn)膜250mA，4h;轉(zhuǎn)膜完畢后，將膜取出后完全浸泡于甲醇中5min;將膜浸入封閉液中4'C封閉過夜；棄封閉液，TBS洗膜4次，每次10min;以稀釋液稀釋一抗至適當(dāng)?shù)臐舛?按i:5000~i:ioooo比例)，加入一抗，孵育2h,室溫緩搖；陰性對照以i^bsa取代一抗，其他步驟與實驗組相同；棄一抗，TBS洗膜4次，每次10min;加入適量二抗稀釋液(1:30000比例稀釋)，室溫緩搖lh;棄二抗，TBS洗膜4次，每次10min;加入適量底物顯色液，密切觀察顯色過程，并在較淺本底且達(dá)到適當(dāng)顯色強(qiáng)度時流水終止顯色。圖5結(jié)果證明兩個毒素基因的表達(dá)。實施例七工程菌對臺灣乳白蟻的口服毒性測定將轉(zhuǎn)基因陰溝腸桿菌挑單菌落接入lOmLLB培養(yǎng)液中，在28'C下培養(yǎng)過夜，然后以500nL工程菌菌液浸濕濾紙，加入室內(nèi)飼養(yǎng)的白蟻種群中。以未轉(zhuǎn)入fc^/5J基因的陰溝腸桿菌和雙蒸水作為對照。每個處理設(shè)三個重復(fù)，每個重復(fù)100頭白蟻。在28'C下觀察20天，每天記錄死亡的個體數(shù)目并清出死亡個體留待后續(xù)的實驗。20天后分析白蟻的死亡率，以校正死亡率來估計工程菌對臺灣乳白蟻的口服毒性。圖6結(jié)果證明，和對照相比轉(zhuǎn)基因陰溝腸桿菌對白蟻具有明顯的口服毒性作用。實施例八工程菌在白蟻群中的轉(zhuǎn)移取臺灣乳白蟻工蟻700頭(作為以下實驗的供體白蟻)放入浸有1%蘇丹紅7B的濾紙中28t:條件下飼養(yǎng)一周，染料確保不影響工程菌在蟻群中的攝取、傳送和定殖。被染色供體工蟻于加入50(HiL工程菌菌液的濾紙中飼菌2天，然后轉(zhuǎn)移到加入500nL無菌水的濾紙中。取樣5頭白蟻經(jīng)70%乙醇表面消毒10min，滅菌ddH20沖洗3次；用無菌鑷子將死亡白蟻腹部剖開，用無菌環(huán)取腸道物，ddH20稀釋不同倍數(shù)后在LB平板(添加50ng/mLKm和50ng/mLCm)上涂布；待長出菌落后通過菌落形態(tài)及目的基因PCR檢測來鑒定工程菌，測定工程菌在蟲體腸道的存在。受體工蟻700頭以浸ddH2O的濾紙同條件飼養(yǎng)。供體工蟻和受體工蟻各50頭放于一個平板中混合飼養(yǎng)，12小時內(nèi)每隔2小時從中取5頭受體工蟻按照上述方法進(jìn)行體表消毒、破腹稀釋內(nèi)容物劃板，測定工程菌在蟲體腸道的存在，記錄帶菌受體工蟻的數(shù)量，以觀察工程菌在工蟻間的轉(zhuǎn)移，實驗設(shè)三個重復(fù)，記錄供體工蟻和受體工蟻的死亡數(shù)量。圖7結(jié)果顯示12個小時后工程菌的轉(zhuǎn)移效率能達(dá)到70%以上。供體工蟻和受體工蟻以不同比例(1:1、l:10禾ni:50)(每個比例各3個重復(fù))混合飼養(yǎng)6天，每天從中取5頭供體工蟻和5頭受體工蟻按照上述方法進(jìn)行體表消毒、破腹稀釋內(nèi)容物劃板，測定工程菌在蟲體腸道的存在，記錄帶菌受體工蟻的數(shù)量，以測定供體工蟻和受體工蟻的不同比例對工程菌轉(zhuǎn)移的影響。每天記錄供體工蟻和受體工蟻的死亡數(shù)量。圖8結(jié)果顯示前兩個比例中5天后工程菌的轉(zhuǎn)移效率達(dá)到90%以上，并且在較低的比例下工程菌也可以在蟻群中轉(zhuǎn)移。序列表toi4/B/基因核苷酸序列(SEQIDNO.l)〈110〉廣東省昆蟲研究所〈120〉轉(zhuǎn)基因陰溝腸桿菌GEI-tcdAlBl及其構(gòu)建方法和用途<160>1<210〉1〈211>12074<212>DNA<213〉_P/iotor/ja6c/i/w加!'"esce"sTTOl(Symbioticbacteriaofentomopathogenicnematodes)〈220〉<221>CDS<222>(14)…(12074)<400>1aatatgaattcgcctgtaaaagagatacctgatgtattaaa犯acc犯tg60tggttttaattgCCtg3C3gcagctcttttaacgaatttcaccaacaagt120atctgctcacctctcttggtCCg犯gC3C3cgacttatatcatgatgcccaacaggccca180cggctatEitg犯gCCCgtElttcttaagcgcgcg犯tcctc240tgccgtacatcttgccatcatcgcccctaatgtcgaactgataggctataELceigccaatt300togcggt聊gccagtcaatatgtcgcaccgggtaccgtttcctccatgttctcccccgc360cgcttatttgactgagcttttcgcaatttacacgccagcaactccgttta420ttatctggatacccgccgccC3g3tctC犯atcaatggcgctcagccaacaaaatstgga480taccgaactttccacgctctcgttatccaatgagctattgttggaaagtatt3a犯ctga540gtct犯gctgctaaagtgatggaaatgctctccactttccgtccttccgg600cgcgacgccttatcacgatgcttatgaa犯tgtgcgtg犯gttatccagctacaagatcc660tgggcttgagCSLtCELCCggCaaUgccgggCt￡L￡LtgC￡ltC犯gcctccct720attgggtattaacgcctcaatctcacctgagttgttt犯tatcctgacggaggagattac780cgaiaiggtaalgctgsgg犯ctttatgagaaaaattttggtcggcctcact840ggctatgccggaatatctta犯cgtta/ttagatg犯g犯cttagccagtt900tattggtaaagccagcaattttggtcaacagg犯tatagtC3taacc3gcttattactcc960a_gtagttaa_cagcagtgatggC3Cggtt犯ggtatatcggattacccgcg1020EL犯tgCCt8tcaagtggacgtggaactgtt"tcccttcggtggtgaaaattatcggttaga1080ttata^a/ttcgg￡Lalgccacttatttatccatcaagttaa3tg3C3333g1140agagcttattcgaactgaaggcgctcctcaggtcELgLcatagaatactctg1200aXtaagtaccactgatatcagtcaaccttttgaaattggcctg3cacg8gtacttcctaa1260tactaattacgcctatgccgccgcaaaatttaccgttgaggaatgitaaccaatactcttt1320cctgctaaasctcaataaggcgattcgtcta/tcccgagcaacagaattgtcacccacgat1380tctgg犯ggtattgtgcgcagtgtt犯tcagcaactggatatcaacacagaagtattagg1440t犯agtttttctgactaaatattatatgcagcgttstgctattgatgctgaaactgccct1500<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>taatagtgtcataaccgctacgcagagaattatgaaatcccttceitcggt3960犯cagttatggcsgggg卿atataacctcagtatggtgcatggcgg聊4020tatcccaattatccgttaccaagcctca/tcaaaatccatatctcacctaa4080acctatgaaggagctgatgagcgaactcgtaatcagtgcaacctgataa^4140aaattgggtgataaa/tttattatctatacc犯tctgagtgtcaatacaca4200atggacatcataatatacccggtttatc犯t3tagagg犯4260t犯tagtcagggtagattactgttttatcgattggtaaagtaagtgtctt4320tcttcctaattggggaca犯gcctatattcagaagttaccaatagcaataatggctatat4380tatagacacttctaatcaagaacctttattt3p3^c3>atatctctatatgg4440taatggattccgtattattgctactgatgtctataacgcagtagagstcaacactgc犯t4500ttccccggcaaaaMtcaggagccggtagccttttaccgc4560ggat肌agatgtttccgttcagccatcacctagttttgatg犯8tgtatt4620ta_ccctcga8Lctggtttgaattttaataat犯cttagccagtattgatgt4680cacctttactgcattggcggaggatgggcgtaaactgggttcagtattcc4740tgttactcgcccgataatgctctgaccctgcaccataatg3犯3tggtgC4800CaELtggCaagcctatcgtactcgcctg犯taccctatttgcccgccagtt娜OggttgcscgagccaccaccggaatcgatacaattctgagteL"tggELaactceigaMatcca49203gagcctgtttt3tgg￡lgtgataattttactgC犯C3tt3actcaagtct4980tcatggcaac"tcaaaattatgtt3gg朋acaacctgatca5040agca犯tgtcatttatcagggtgagctaacatctctctga5100aacttatata3gCgg3gt犯cc3gtggataataaagggaa5160cgatagctggatttatttatttctactaatttggcgagtt5220ttggtttaaaaatggtacgaattttcaaggttattatccc犯aggtaMg5280tgatcctatttg犯cc犯tggatttcagcggcgctaacag5340tctttatttctggg犯ctgttctactataccccgatgctggttgctcaacgtttgttgca5400tgaaca犯actttgatg肌gccaaccgctggctgaaatatgtctggagtccatccggtta5460tattgttcacggccagattcagaactaccagtgg犯tgttcgcccgttactggaagacac5520cagttgg肌cagtgatcctttagattccgtcgatcctgacgcggtagcac33C3Cg3tCC5580肌agtctc肌cctttatgcgtactctcgatctgttgatagC3CgCggCg35640tcaggcttaccgccaactggagcgggatacgcttagLCgaaggtatatgca5700agcgctgcatctattgggcgcctaccgctgagtacgacatggaataatcc5760tCgELCt3g8C卿gccgcagatattactactcaaaatgctcacgccagctcaatagttgc5820tctgcggcagagtacaccagcacctttagcBttgCgC3gCgccaataccctgaccga/tct5880cttcctgcca犯gtg3tgatgaactactggcagacattagctcagagagt5940cgtcataacctctctatcgacggtcaaccgctatatctgccaatctatgc6000cacaccggcagatccaaaagcgttactcagcgccgccgttgccacttctcaaagtggagg6060caaactaccagagtcatttatgtccctgtggcgcttcccgcacatgctggaaaatgcacg6120cggcatggttagccaactcatccagttcggctccacgttacaaaatattatcgagcgtca6180gcactcaatgcgttattacaaaatcaggccgcggagctga6240cctgagcattcaggacaa犯ccattgaagaattggatgtctgctggaaaa6300atccaaagcgggagcccaatcgcgctttga犯gttgt3tg6360caacgccggtcteitgatgctacgagcgtccgcagccgggctcaccacggc6420agttcaagcatcccgtctggctggcgcagcggctgatttggtgcctaacatcttcggctt6480cgccggcggtggtagtcgctggggagctatcgctgaggca3caggttatgtgatggaatt6540ctccgctaatgttatgaataccgaagcggataa^ttogccaatccg3aacctaccgtcg6600tcgccgtcaggagtggg.tccaacgtaataatgccgaagC3g肌Ctg3a_a_caactcga6660ttcccaacttaaatcactggt8gt8CgCCgtgaagccgccaa^ccagcct6720gaaaacccagc犯gEiacagacccaatctcagctggccttcctgcaacgtaagttcagc犯6780tcaagcgttgtacaactggctacgtggccgattggcggcgatttacttcc6840tttggctgtcgcgcgttgttacaggcttaccgttggga犯tcaatgatgc6900ctctgcaagtttcattaaaccgggtgcctggca^ggaacctatgccggtctgCttgC3gg6960tgaaaccttgatgctaagtctgacacaa^tggaagatgccC3tctga^cgcgataaacg7020tgcactagaagtgg咖gcacggtgtcgcta_gccga_a_gtttatgctggattgccacaaga7080taaaggtccattctccctggctcaggaaatgctcaggcag7140tgccggcagt3tttggC3tttggtgccggtacggacactaaaacctcttt7200gcaggcatccatttcattagctgatttgaa犯ttcgtgagg3tt8CCCg8catctcttgg7260caa肌ttcgacgtatcaaacagatcagtgtcaccctgcccgcgctactggggccatatca7320ggatgtgcaggcaatattgtcttacggtgattagctaacggctgcgaagc7380gctagcagtttctcacggtatg肌tg3C3gcggccaattccagctcgatttcaacgatgg7440caaattcctgccattcgaaggcatcgccattgatcaaggcacgctgacactgagtttccc7500aaatgcatccatgccgaagaagccactatgctaaaaaccctg犯cgatat7560cattttgcatattcgctacaaccgtccaaacgtactaaaacaggccccgs7620atcggggcctttcatgcagaattcacagacattcagtgttgccgagctgt7680cattacccaagggcggcggggcaattaccggtotgggtgsccaactgggc7740cggatggtatggccgccttatccctgccattacccatttctgccgggcgtggttactccc7800catcgctcaccttgaetttac3gC￡Lgtgg￡lgccggtaacagcccgtttggtctcggttggg7860actgcaacgttatgacaattcgtcgccgcaCCElgt3Ctggcgtaccgaatt3cg3tg3a_a_7920ccgatacttttctggggccag犯ggtg犯gtgttggtcatagcattaaatgagaacggtc7980aagctgatetccgcagtgaatcctcattgc3gggcEitca^tttggggg犯atcttcaccg8040ttaccggttatcgttcccgtttggaaagccactttagctggttggaatattggcaaccca8100aaacaacaggtacaaccgatttctggctgatatacagccccgacggacaggtccatttac8160tcctcaggcacgtatcagcaiatccactcaatgttagcc犯acagcgcaat8220ggttgttggaagcttcggtatcatcccacggcgaacagattt3tt3tca^t3tcgagccg8280aaactgcgaaactgacgagttcacagcccatccgaacgcaaccgtccaac8340gctacctgcaagcggtccattacggtaacctgaccgccagcgaagtttttcccacgctca8400acggagatgacccwtc犯atctggctggttgttctgtttagtatttgattacggtgaac8460gc犯aaacagcttatctgaaataccgccgtttaaagcctceiagtctctggctttgccgcc8520犯gaccgtttttcccgttatgaatacggttttgaattgcgcacccggcgcttatgccgtc8580犯atcctgatgtttcaccgtCt3CEl犯CCCtgtctggtca柳t犯agggga_Cg￡ltg33C8640ccgcgttggtttcacgtctgatactggattcgcggtgatcagcacgctcg8700tttctgtccgtcggataggtC6Ltg3ggfLC3￡LC￡l￡LtaCCgtcatctcactgccaccactgg87602LgCtggCtt3ccagccttttg3gCC3g犯C犯a犯gcacgctggcaatca3tgg3tgt3C8820tggcaaatttcaacgccattcaacgctggcaactgcttgacctgaaaggag犯ggcgtoc8880ccggtgttctatatcaggatag犯atggctggtggtatcgatctgcccaacgtcaBgccg8940ggga柳gatgaatgcggtc8CCtggggg3aaatgcaactccttcctatcacgccagctt9000tgcaggataacgcctcactgatggatattaacggtgacgggcaactggactgggttatca9060ccggaccggggttaaggggctatcacagccaacacccggatggtagctggacacgcttta9120caccattagatgccttgccgatagaatattctcatccccgtgctcaacttgccgatttaa9180tgggggccgggctgtccgatttEigtsctgeittggccccaa犯gtgtacgcttgtatgcta92403taaccgtg3tggttttaccc肌gggcgggatgtggtgca3tCCggtg3tatcactctgc9300Cgtt￡lCCgggtgccgatgcccgt33gttagtggcatttagtgacgtactcggttcgggcc9360aagcacatctggttg犯gttagtgceiactcaagtcacctgctggccaaatctggg織tg9420gccgttttggtcagccaattacattgccgggattcagccaatctgccgacaactttaatc9480ccgaccgagttcatctggccgatctggatggcagtggtcctgccgatttgatttatgttc9540atactgaccgtctggeigattaaagtggtaacagctttgcaaaaccattca9600cactccgttttcctgscggcctgcgttttgatgatacttgccagctacaagtggctg3tg9660ttcagggatt3ggggCtgtCagcctgatcctgagcgtaccgcatatggcgccacatcatt9720ggcgctgcgatctgaccaatgcg犯axxgtggttgctcagtgaaatgaac9780gcgctcatcacaccctgcattaccgtagctcctcccagttctggctggatgacaaagccg9840cagccttggcgsccggeic^acaccggtctgttacctgcccttcccggtccatactctgt9900ggc犯ac3g8gaccgaggatg3犯tC3gCggcaataaattagtgaccacgttacgttacg9960ctcacggcgcttgggatggacgtg獄gggaatttcgtggctttggttat10020cagacagccatcaactcgctcaaggcaatgccccggaacggcactcacca10080aaaactggtatgccaccggagtcccgg鄉(xiāng)tagacaatacgctatctgccgggtattggc10140gtggtgat犯acaagcgttcaccggttttaCgCC3CgCtttactcgctgg犯柳gggca10200aagatgttccggcgacaccgga_a_a_a_tga_tgataatctgtactggttcaaccgggcactaa10260aaggtcagctactgcgtagtgagctctacgggctggatgac3gcgaac3gcaaaatatcc10320cctatacagtgactgaatctcgtccacaagtgcgccaattacaagatggcactaccgctt10380ccccggtgctttgggcctcggtcgtgga犯accgtagttatc8ct8tga^cgtattatcg10440gtgatcctcagtgcaatcaggatettacgctgtcc3gcga_ccaattcgggc犯cctctga10500肌C3ggtttCaatgcaatatccccgccgcaaaccaatccgtatcccgata10560cactaccggatacgctatttgCC3gC3gttatgacgatcaacaacaactattgcgaittaa10620cctgccagcaatccagttggcaccatctaaccggtaatgaactcagagtgctgggattac10680cggatggtacacgcagtgatgccttcacttacgatgccaaacaggtgcctgttgatggtt10740taaatctggaagccctatgtgctgaa犯tagtctgattgccgatgaca肌ccacgcgaat10800accttaatcagcaaagaacgttctataccgatgggaaaaaccaagcgcca10860cgacacgacaagctttaatcgcctttaccg肌acggcggtattaacagaatctctgttat10920ccgcatttgatggcggtetcacgccagatgaattacccggcattctgacacaagcaggat10980gccttstctgtttccacgcaCCggCg3333C333gtCtgggtagcacgtc11040aaggctataccga^ttocggaactgaggcacaattttggcgtcctgtcgcacaacgtaaca11100量，從活性炭層上部抽取濕空氣2026小時，使?jié)窨諝獯┻^鮮花層后，先經(jīng)分子篩層吸收其中的水分，再經(jīng)活性炭層吸收其中的鮮花頭香成分后，空氣排空；D、取出活性炭，在壓力為2025MPa，溫度為2535"C條件下，用二氧化碳臨界萃取23小時，即得頭香精油。所述分子篩用量以每公斤鮮花2535克計，用于吸收空氣流中的水份。所述活性炭用量以每公斤鮮花1020克計，用于吸收空氣流中的香氣成分。所述二氧化碳臨界萃取采用現(xiàn)有市購的二氧化碳臨界萃取儀，并按其說明書進(jìn)行操作即可。所述己提取頭香成分的鮮花再用現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行浸提，得含沸點較高的香氣成分的精油，以充分利用資源，降低成本。本發(fā)明的第二個目的通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)一種鮮花頭香的吸收、萃取裝置，包括下部帶進(jìn)氣口、上部帶出氣口的殼體，其特征在于殼體內(nèi)的中下部間隔設(shè)有鮮花分隔篩網(wǎng)，以放置鮮花后構(gòu)成鮮花層，殼體內(nèi)的上部設(shè)有由分子篩層和活性炭層構(gòu)成的吸附柱，分別吸收水份和鮮花頭香成份。所述殼體內(nèi)中下部間隔設(shè)置的鮮花分隔篩網(wǎng)均為等徑篩網(wǎng)，以充分利用空間攤放鮮花原料，以避免運輸和加工過程中因擠壓而使鮮花變質(zhì)。所述殼體內(nèi)上部設(shè)置的由分子篩層和活性炭層構(gòu)成的吸附柱直徑小于殼體中下部直徑，以利收集、吸附香氣成份和水份。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點和效果采用上述方案，可充分利用分子篩只吸收水份而活性炭則吸收鮮花頭香成份的特點，方便地將容易揮發(fā)、容易損失的香韻較佳的鮮花中的頭香成份用活性炭先提取出來，且不含水份，既能有效利用鮮花資源，讓精油香味純正、持久，以利提高精油產(chǎn)品檔次，又省去化學(xué)除水份的工藝和設(shè)備，有利于降低投資和生產(chǎn)成本，使用本發(fā)明的方法不僅能獲得質(zhì)優(yōu)味香的精油產(chǎn)品，而且工藝簡單，精油得率高，生產(chǎn)用活性炭和分子篩稍做處理后，可重復(fù)使用，進(jìn)一步節(jié)能降耗，容量產(chǎn)權(quán)利要求1.一種轉(zhuǎn)基因陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)GEI-tcdA1B1CCTCCM207208，該菌株是利用Tn5轉(zhuǎn)座子將昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌PhotorhabdusluminescensTT01菌株中克隆兩個殺蟲毒素基因tcdA1B1基因插入到陰溝腸桿菌的基因組DNA中，構(gòu)建而成的對白蟻具有口服毒性的轉(zhuǎn)基因工程菌。2.權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因陰溝腸桿菌GEI-tcdAlBlCCTCCM207208的構(gòu)建方法，其特征包括下列步驟1)從昆蟲病源線蟲共生細(xì)菌/5/ww/"mc^mTT01菌株中克隆兩個殺蟲毒素基因fcoL475A2)利用微轉(zhuǎn)座子載體pMini-Tn5，將toi4/57基因置入轉(zhuǎn)座單位里，構(gòu)建"自殺性"工程質(zhì)粒pMini-Tn5-tcdAlBl;3)將構(gòu)建的工程質(zhì)粒pMini-Tn5-tcdAlBl導(dǎo)入陰溝腸桿菌中；4)測定fcoL4/57基因整合到腸道細(xì)菌陰溝腸桿菌基因組DNA上，得到轉(zhuǎn)基因陰溝腸桿菌(五.c/oaca^GEI-tcdAlBlCCTCCM207208菌株；3.權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因陰溝腸桿菌GEI-tcdAlBlCCTCCM207208作為制備殺滅白蟻誘餌藥劑的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)GEI-tcdA1B1及其構(gòu)建方法和用途，該菌株是利用Tn5轉(zhuǎn)座子將從昆蟲病原線蟲共生細(xì)菌PhotorhabdusluminescensTT01菌株中克隆的兩個殺蟲毒素基因tcdA1B1基因插入到陰溝腸桿菌的基因組DNA中，構(gòu)建而成的對白蟻具有口服毒性的轉(zhuǎn)基因工程菌。該菌株保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，編號為CCTCCM207208。將這種表達(dá)外源基因的白蟻共生細(xì)菌作為誘餌喂養(yǎng)白蟻，重組細(xì)菌在白蟻腸腔中繁殖，可產(chǎn)生致死白蟻的蛋白。這將是可持續(xù)控制白蟻的安全有效的方法。文檔編號C12N1/21GK101230328SQ20071003298公開日2008年7月30日申請日期2007年12月29日優(yōu)先權(quán)日2007年12月29日發(fā)明者丘雪紅,莉曹,趙瑞華,韓日疇,珣顏申請人:廣東省昆蟲研究所