專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于分析酸性環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)及功能的基因芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因芯片，尤其涉及用于分析酸性環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)及功能的基因芯片。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的微生物群落研究方法是以培養(yǎng)為依據(jù)，包括對(duì)細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)適溫、pH值、GC含量、微生物總量、生物量、呼吸效率、酶活性等生物特性的了解和分析。盡管這些傳統(tǒng)的方法仍然是微生物群落研究的基礎(chǔ)，但是由于不同種類(lèi)微生物對(duì)培養(yǎng)要求的差異，以分離培養(yǎng)為基礎(chǔ)的微生物群落分析不能提供準(zhǔn)確而豐富的信息。特別是在酸性環(huán)境中存在的微生物大多數(shù)是屬于化能自養(yǎng)的嗜酸性細(xì)菌，這些細(xì)菌在人工條件下很難進(jìn)行分離培養(yǎng)，特別是在固體培養(yǎng)基上。因此，后來(lái)又發(fā)展了熒光顯微鏡法、掃描電鏡法和透射電鏡法等觀察微生物個(gè)體豐度和形態(tài)的方法，但它們?nèi)圆荒芴峁┪⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)多樣性的足夠信息。20世紀(jì)80年代末90年代初發(fā)展了以核酸(基因)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)，該方法大大地減輕對(duì)微生物培養(yǎng)的依賴(lài)性，并迅速地廣泛應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析。目前，主要有采用以16S rRNA基因和16S-23S rRNA間隔序列分析為基礎(chǔ)的分子生態(tài)學(xué)研究方法，但這種16SrRNA基因和16S-23S rRNA間隔序列分析只反映微生物系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化關(guān)系，不能直接反映微生物代謝與生理特征。近年來(lái)微生物生態(tài)學(xué)家已經(jīng)不滿(mǎn)足于對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的分析，而是盡力把群落結(jié)構(gòu)分析與微生物群落的生理代謝功能聯(lián)系在一起，因而發(fā)展了以功能基因作分子標(biāo)記研究微生物群落的方法。但是，目前在微生物群落分析中所用的RFLP和DGGE等方法靈敏度低、特異性不高，而基因克隆與序列分析則工作量大。FISH檢測(cè)技術(shù)盡管靈敏度高、特異性強(qiáng)，但存在熒光染料種類(lèi)的限制，每次檢測(cè)的微生物種類(lèi)有限。因此，這些方法尚難以同時(shí)、快速、準(zhǔn)確、靈敏地進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)與功能分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種分析酸性環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的基因芯片。利用該芯片，可以實(shí)現(xiàn)高通量、快速、準(zhǔn)確、靈敏地對(duì)酸性環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的同步研究。
本發(fā)明的基因芯片由基片及固定于基片上的寡聚核苷酸探針組成，這些探針包括表1所列的核苷酸序列中的至少104條，表2所列的核苷酸序列中的至少55條，表3所列的核苷酸序列中的至少27條，表4所列的核苷酸序列中的至少39條，表5所列的核苷酸序列中的至少44條，表6所列的核苷酸序列中的至少15條，表7所列的核苷酸序列中的至少4條，表8所列的核苷酸序列中的至少12條，表9所列的核苷酸序列中的至少8條和表10所列的核苷酸序列中的至少446條，其中重復(fù)序列中至少選取一條。
本發(fā)明芯片的探針最好是包括如表1～10所列的全部1072條核苷酸序列。
表1 與碳代謝相關(guān)的158條核苷酸序列g(shù)i|14524359|；gi|14524359|；gi|67462196|；gi|67462196|；gi|67462196|；gi|7638263|；gi|15028604|；gi|15028605|；gi|15026917|；gi|18034174|；gi|18034256；|gi|6065813|；gi|7638343|；gi|2970046|；gi|987616|；gi|927383|；gi|34014716|；gi|13591552|；gi|56783612|；gi|287464|；gi|2171551|；gi|4105512|；gi|4105512|；gi|4105512|；gi|71905234|；gi|21038749|；gi|21038751|；gi|12642575|；gi|12642575|；gi|3449365|；gi|3449365|；gi|12642575|；gi|297843|；gi|297843|；gi|1649042|；gi|7638259|；gi|7638260|；gi|7638297|；gi|7638305|；gi|14251200|；gi|3378536|；gi|3378536|；gi|3378536|；gi|3378536|；gi|7638316|；gi|7638318|；gi|7638319|；gi|7638320|；gi|7638377|；gi|27462756|；gi|2065443|；gi|27877094|；gi|4579697|；gi|34392407|；gi|7638271|；gi|84617168|；gi|84617166|；gi|7638276|；gi|7638394|；gi|4704344|；gi|7638286|；gi|7638308|；gi|7638374|；gi|84617162|；gi|57283673|；gi|7638299|；gi|7638314|；gi|7638385|；gi|7638388|；gi|32470341|；gi|7638290|；gi|7638317|；gi|7638293|；gi|7638380|；gi|48109050|；gi|20531762|；gi|47680291|；gi|7638331|；gi|7638275|；gi|7638307|；gi|7638332|；gi|7638309|；gi|7638348|；gi|15209404|；gi|7638267|；gi|7638274|；gi|7638346|；gi|7638347|；gi|7638382|；gi|7638300|；
gi|7638258|；gi|7638287|；gi|7638289|；gi|7638345|；gi|7638369|；gi|7638396|；gi|22204164|；gi|23491642|；gi|56783612|；gi|7638340|；gi|11999161|；gi|11999159|；gi|11999157|；gi|11999163|；gi|11999165|；gi|11999167|；gi|11999169|；gi|11999171|；gi|31747100|；gi|7638315|；gi|414354|；gi|7638361；gi|7638359|；gi|7638395|；gi|7638277|；gi|7638310|；gi|7638311|；gi|7638393|；gi|31747605|；gi|21105295|g；gi|21105295|g；gi|7638279|；gi|7638280|；gi|7638281|；gi|7638303|；gi|45544833|；gi|45544835|；gi|7638322|；gi|7638262|；gi|7638294|；gi|7638295|；gi|7638335|；gi|7638333|；gi|7638334|；gi|7638349|；gi|7638283|；gi|7638392|；gi|5711738|；gi|7638313|；gi|7638338|；gi|7638390|；gi|4579697|；gi|4579703|；gi|34392407|；gi|67515403|；gi|7638330|；gi|7638261|；gi|7638358|；gi|7638339|；gi|7638272|；gi|7638387|；gi|7638378|；gi|7638351|；gi|7638375|；gi|7638364|；gi|7638329|；gi|7638298|；gi|7638273|表2 與氮代謝相關(guān)的72條核苷酸序列g(shù)i|31747623|；gi|31747709|；gi|31747801；gi|31747806|；gi|31747821|；gi|31747823|；gi|31747826|；gi|31747828|；gi|31747833|；gi|31747835|；gi|31747837|；gi|31747839|；gi|154642|；gi|7638352|；gi|7638353|；gi|7638363|；gi|7638386|；gi|7638389|；gi|48431602|；gi|7638312|；gi|27652557|；gi|56783612|；gi|154629|；gi|7638284|；gi|7638291|；gi|7638324|；gi|7638325|；gi|7638326|；gi|7638328|；gi|7638337|；gi|7638285|；gi|7638342|；gi|7638381|；gi|71056998|；gi|2196459|；gi|32470341|；gi|2653994|；gi|7638357|；gi|7638373|；gi|7638302|；gi|7638371|；gi|20977198|；gi|7638306|；gi|7638266|；gi|7638355|；gi|7638391|；gi|2653994|；gi|1263912|；gi|7638265|；gi|7638354|；gi|7638384|；gi|7638301|；gi|7638356|；gi|7638376|；gi|7638321|；gi|7638360|；gi|7638344|；gi|7638368|；gi|7638292|；gi|7638278|；gi|7638341；gi|7638367|；gi|7638366|；gi|7638365|；gi|7638350|；gi|7638296|；gi|7638264|；gi|505191|；gi|27808287|；gi|27808285|；gi|27808263|；gi|31747605|
表3 與硫代謝相關(guān)的39條核苷酸序列g(shù)i|70888497|；gi|70888495|；gi|70888493|；gi|70888491|；gi|7638288|；gi|14594778|；gi|22213639|；gi|22213639|；gi|22213640|；gi|31747590|；gi|31747592|；gi|22204164|；gi|42516537|；gi|42794898|；gi|46681|；gi|11323291|；gi|26985957|；gi|42794900|；gi|42516536|；gi|42516536|；gi|42794894|；gi|26985951|；gi|42794900|；gi|6065813|；gi|14279355|；gi|15077482|；gi|15077483|；gi|14669472|；gi|14276187|；gi|14276188|；gi|13561053|；gi|13561054|；gi|14090316|；gi|14090317|；gi|44902762|；gi|1045501|；gi|2257960|；gi|396201|；gi|7110572|表4 與鐵代謝相關(guān)的68條核苷酸序列g(shù)i|48167|；gi|2171667|；gi|1729439；gi|1729439；gi|1729432|；gi|1729432|；gi|1729432|；gi|62318455|；gi|62318455|；gi|62318455|；gi|62318455|；gi|62318455|；gi|62318455|；gi|62318455|；gi|62318455|；gi|30270532|；gi|18181616|；gi|30349330|；gi|30349328|；gi|927521|；gi|24475574|；gi|24475574|；gi|15209319|；gi|15209319|；gi|15209319|；gi|15209319|；gi|22213639|；gi|22213639|；gi|15028602|；gi|15028606|；gi|77415795|；gi|77415795|；gi|77415795|；gi|15026919|；gi|3046830|；gi|15808107|；gi|15209319|；gi|19335762|；gi|15028600|；gi|18375794|；gi|2323345|；gi|15808109|；gi|15209319|；gi|15209319|；gi|24475574|；gi|4579703|；gi|3046822|；gi|15026921|；gi|14251200|；gi|15808114|；gi|14251200|；gi|14251200|；gi|14251200|；gi|14251200|；gi|14251200|；gi|22213639|；gi|22213639|；gi|1654085|；gi|1654085|；gi|1654085|；gi|1654085|；gi|22204164|；gi|2852657|；gi|22204164|；gi|22204164|；gi|15026921|；gi|1419214|；gi|27948763|表5 與遺傳相關(guān)的97條核苷酸序列GY00466；GY00463；GY00481；GY00400；GY00477；GY11618；GY11619；GY11915；GY11916；GY00615；GY00382；GY00609；GY00608；gi|46667|；gi|415998|；gi|517286|；gi|642271|；gi|2052256|；gi|2293013|；gi|22625889|；gi|7638323|；gi|40784|；gi|84617164|；gi|1217620|；gi|29569817|；
gi|32130562|；gi|31088004|；gi|48173|；gi|4585347|；gi|10803003|；gi|10803004|；gi|3046584|；gi|6288959|；gi|6288958|；gi|48114|；gi|48112|；gi|48083|；gi|32470341|；gi|28374983|；gi|414337|；gi|38602344|；gi|154652|；gi|34014716|；gi|21326643|；gi|35210350|gi|35210348|；gi|35210346|；gi|35210342|；gi|35210344|；gi|35210340|；gi|35210338|；gi|35210334|；gi|35210336|；gi|35210332|；gi|35210330|；gi|35210328|；gi|35210324|；gi|35210350|；gi|35210348|；gi|35210344|；gi|32470341|；gi|32470341|；gi|60686968|；gi|31616662|；GY12177；GY00675；gi|83697121|；gi|4165431|；gi|2231059|；gi|1217620|；gi|40780|；gi|27462758|；gi|27877094|；gi|39300|；gi|55774634|；gi|688337|；gi|32470341|；gi|57157695|；gi|10945165|；gi|31747752|；gi|25045206|；gi|34364579|；gi|15530119|；gi|15530111；gi|15530105|；gi|15530099|；gi|15530097|；gi|15530083|；gi|15530081|；gi|15530079|；gi|15530075|；gi|15530071|；gi|15530067|；gi|15530065|；gi|34392407|；gi|4579697|；gi|4579703|表6 與金屬抗性相關(guān)的27條核苷酸序列g(shù)i|6691785|；gi|4586903|；gi|4586896|；gi|2879916|；gi|2879916|；gi|2879916|；gi|62464764|；gi|60739065|；gi|61105587|；gi|68053494|；gi|32470341|；gi|15528430|；gi|60686968|；gi|60686968|；gi|60686968|；gi|60686968|；gi|60686968|；gi|48150|；gi|48150|；gi|15528430|；gi|15528430|；gi|15528430|；gi|27372310|；gi|27372310|；gi|27372310|；gi|2170714|；gi|77632631|表7 與膜相關(guān)的16條核苷酸序列g(shù)i|22204164|；gi|22204164|；gi|22213639|；gi|22213639|；gi|22213639|；gi|22213639|；gi|22204164|；gi|22204164|；gi|22204164|；gi|22204164|；gi|22204164|；gi|22204164|；gi|22204164|；gi|22204164|；gi|4138615|；gi|2735720|表8 13條轉(zhuǎn)座子核苷酸序列g(shù)i|2653994|；gi|6065813|；gi|62464764|；gi|60739065|；gi|61105587|；
gi|2653994|；gi|63025527|；gi|63025525|；gi|56126467|；gi|15528430|；gi|61661427|；gi|567906|；gi|27948763|表9 11條IST序列g(shù)i|984833|；gi|56159739|；gi|154631|；gi|15795384|；gi|3821739|；gi|176137|；gi|11229594|；gi|30143044|；gi|30143043|；gi|30143042|；gi|30143041|表10 571條16S rRNA核苷酸序列g(shù)i|35464180|；gi|35464179|；gi|35464178|；gi|35464176|；gi|34392263|；gi|34392260|；gi|34392259|；gi|34392258|；gi|32527885|；gi|32527882|；gi|32527881|；gi|32527880|；gi|32527874|；gi|29468909|；gi|29468879|；gi|29468857|；gi|29468841|；gi|29468813|；gi|29468693|；gi|29468678|；gi|28881695|；gi|40353858|；gi|40353857|；gi|40353856|；gi|40353855|；gi|40353854|；gi|40353853|；gi|40353852|；gi|22203533|；gi|28436009|；gi|28436007|；gi|38564750|；gi|27805074|；gi|27805073|；gi|35464187|；gi|35464186|；gi|35464185|；gi|35464183|；gi|35464182|；gi|35464181|；gi|5031310|；gi|27357786|；gi|27357766|；gi|27357738|；gi|27357703|；gi|18496681|；gi|18496673|；gi|2967724|；gi|20385323|；gi|20385317|；gi|13171259|；gi|27357821|；gi|27357820|；gi|27357810|；gi|28435616|；gi|28435604|；gi|28435603|；gi|28435601|；gi|28435599|；gi|28435596|；gi|28435593|；gi|28435584|；gi|28435583|；gi|28435580|；gi|28435579|；gi|28435575|；gi|28435574|；gi|22267224|；gi|22267218|；gi|22267216|；gi|2660911|；gi|12060942|；gi|7208567|；gi|7208534|；gi|7208477|；gi|47087472|；gi|5051673|；gi|5031379|；gi|28435618|；gi|28435617|；gi|50659775|；gi|37960006|；gi|37960005|；gi|37959995|；gi|53773200|；gi|53772843|；gi|53794234|；gi|49175865|；gi|52375859|；gi|52374992|；gi|52374944|；gi|52372144|；gi|52371779|；gi|52371405|；gi|52371314|；gi|52371138|；gi|52371102|；gi|52370971|；gi|52370844|；gi|52370305|；gi|52370162|；gi|52370003|；gi|52369905|；gi|52083008|；gi|52083007|；gi|52083006|；gi|52083005|；gi|52083004|；gi|37595624|；gi|49175755|；gi|49175754|；gi|49066618|；gi|49066614|；gi|49035637|；gi|49035636|；
gi|49035635|；gi|49035633|；gi|49035632|；gi|49035631|；gi|49035628|；gi|49035627|；gi|49035624|；gi|49035622|；gi|49035620|；gi|49035619|；gi|49035617|；gi|49035616|；gi|58047112|；gi|58047100|；gi|22595303|；gi|22595296|；gi|53854846|；gi|60202814|；gi|60202810|；gi|60202797|；gi|60202794|；gi|60202783|；gi|60202771|；gi|60202748|；gi|60202732|；gi|58802948|；gi|58200152|；gi|58200119|；gi|58200063|；gi|58200050|；gi|58200009|；gi|58200002|；gi|58199976|；gi|58199928|；gi|58199747|；gi|58199656|；gi|58199565|；gi|58199536|；gi|68132217|；gi|67482574|；gi|67482568|；gi|46253450|；gi|46253448|；gi|46253447|；gi|46560274|；gi|46560271|；gi|46560269|；gi|46560265|；gi|46560264|；gi|46560263|；gi|46560262|；gi|46560261|；gi|46560260|；gi|46560259|；gi|46560258|；gi|46560257|；gi|46560255|；gi|46560254|；gi|46560253|；gi|46560252|；gi|46560251|；gi|46560249|；gi|46560248|；gi|46560247|；gi|56683269|；gi|61658589|；gi|61658566|；gi|61658553|；gi|61613246|；gi|60923416|；gi|56410864|；gi|60202960|；gi|60202956|；gi|60202948|；gi|60202937|；gi|60202932|；gi|60202931|；gi|60202928|；gi|60202927|；gi|60202926|；gi|60202925|；gi|60202920|；gi|60202918|；gi|60202855|；gi|60202840|；gi|60202839|；gi|60202838|；gi|60202826|；gi|60202820|；gi|68144458|；gi|68132273|；gi|68132272|；gi|68132241|；gi|68132227|；gi|41529519|；gi|41529509|；gi|41529506|；gi|41529471|；gi|41529459|；gi|68159916|；gi|68159915|；gi|68159907|；gi|68159895|；gi|68159869|；gi|68159862|；gi|68144464|；gi|77999222|；gi|77999221|；gi|77999220|；gi|77999219|；gi|77999217 ；gi|77999216|；gi|77999213|；gi|56411471|；gi|29243437|；gi|29243436|；gi|29243434|；gi|29243432|；gi|74381960|；gi|74230588|；gi|72535279|；gi|72059470|；gi|72059467|；gi|61699232|；gi|61699231|；gi|59149778|；gi|59149746 ；gi|59149742|；gi|56131365|；gi|83318605|；gi|77024770|；gi|77024753|；gi|77024750|；gi|77024733|；gi|77024732|；gi|82504346|；gi|82504344|；gi|82504341|；gi|82504340|；gi|82504335|；gi|82504327|；gi|82504326|；gi|82504275|；gi|82504273|；gi|82504264|；gi|82504257|；gi|82504256|；gi|82504249|；gi|82504248|；gi|82504183|；
gi|82504181|；gi|82504168|；gi|82504166|；gi|82504165|；gi|82504163|；gi|82504162|；gi|82469876|；gi|82409129|；gi|78923856|；gi|78217104|；gi|78217100|；gi|78217099|；gi|78217085|；gi|78217083|；gi|87042318|；gi|86143969|；gi|85822890|；gi|85822880|；gi|85699784|；gi|41059430|；gi|41059422|；gi|84663626|；gi|84618054|；gi|84618053|；gi|84452194|；gi|84452192|；gi|84452191|；gi|84452188|；gi|84452187|；gi|71148545|；gi|71148529|；gi|83999356|；gi|78483705|；gi|78483704|；gi|78483703|；gi|71041247|；gi|86851483|；gi|9587794|；gi|7414719|；gi|40362929|；gi|40362928|；gi|14039656|；gi|83860088|；gi|83860079|；gi|67462307|；gi|14149387|；gi|604373|；gi|50079959|；gi|33324721|；gi|33324719|；gi|33324718|；gi|53794243|；gi|14149386|；gi|13448924|；gi|176168|；gi|1805687|；gi|1805681|；gi|1805678|；gi|1805676|；gi|50882626|；gi|516644|；gi|494951|；gi|494950|；gi|76093195|；gi|5002512；gi|5102592|；gi|35210320|；gi|57434236|；gi |57434235|；gi|60202792|；gi|54072670|；gi|37813098|；gi|21623845|；gi|35210319|；gi|18496333|；gi|45453510|；gi|34581751|；gi|14627126|；gi|13620966|；gi|11036531|；gi|27818783|；gi|27818782|；gi|27818781|；gi|25188139|；gi|25188140|；gi|25188138|；gi|25188135|；gi|25188134|；gi|25188132|；gi|25188131|；gi|25188128|；gi|25188125|；gi|25188120|；gi|25188119|；gi|25188116|；gi|25188115|；gi|25188110|；gi|25188108|；gi|25188104|；gi|25188103|；gi|25188102|；gi|25188101|；gi|25188100|；gi|25188097|；gi|25188094|；gi|25188093|；gi|25188092|；gi|25188089|；gi|25188088|；gi|25188087|；gi|25188086|；gi|25188084|；gi|25188083|；gi|996091|；gi|57434233|；gi|154696|；gi|12056454|；gi|348079|；gi|1208605|；gi|40802|；gi|415336|；gi|174346|；gi|7414839|；gi|7025445|；gi|4107392|；gi|38304555|；gi|57118106|；gi|5738882|；gi|5738881|；gi|5738880|；gi|4761534|；gi|1061233|；gi|971568|；gi|971567|；gi|86851482|；gi|83860096|；gi|83860083|；gi|1405346|；gi|1054585|；gi|434308|；gi|31747598|；gi|6491779|；gi|54072673|；gi|45453514|；gi|33347876|；gi|31324891|；gi|15485506|；gi|505079|；gi|44885723|；gi|7620385|；
gi|176133|；gi|74275363|；gi|62392254|；gi|58414942|；gi|23955461|；gi|23955458|；gi|23955452|；gi|2944373|；gi|2944370|；gi|2944368|；gi|2944367|；gi|2944362|；gi|2944361|；gi|2944360|；gi|2944359|；gi|2944358|；gi|2944357|；gi|30575364|；gi|23957479|；gi|23957478|；gi|23957476|；gi|18151366|；gi|23266666|；gi|5776552|；gi|47613|；gi|942631|；gi|60202944|；gi|60202943|；gi|60202833|；gi|60202832|；gi|58334008|；gi|58334006|；gi|58334003|；gi|58333997|；gi|56291758|；gi|56291751|；gi|56291750|；gi|14537946|；gi|27817753|；gi|27817741|；gi|26005713|；gi|26005711|；gi|26005686|；gi|26005618|；gi|26005617|；gi|26005614|；gi|26005612|；gi|26005609|；gi|26005607|；gi|26005605|；gi|26005603|；gi|26005599|；gi|26005595|；gi|26005593|；gi|26005592|；gi|4995938|；gi|4995937|；gi|2329896|；gi|2329890|；gi|2329885|；gi|2329884|；gi|2329877|；gi|2329874|；gi|2329868|；gi|534963|；gi|35210342|；gi|35210340|；gi|35210338|；gi|35210334|；gi|35210330|；gi|534921|；gi|34787172|；gi|34787171|；gi|29468694|；gi|37961766|；gi|27357785|；gi|2702326|；gi|20385322|；gi|28435591|；gi|13235580|；gi|37959999|；gi|38426740|；gi|49175757|；gi|49035621|；gi|58199664|；gi|46560272|；gi|60202929|；gi|68132296|；gi|76057964|；gi|61699236|；gi|62512260|；gi|60417875|；gi|56131362|；gi|83318598|；gi|47778667|；gi|41059426|；gi|60301784|；gi|61967933|；gi|20798996|；gi|66912129|；gi|13605461|；gi|1805679|；gi|12231193|；gi|25188106|；gi|25188096|；gi|25188091|；gi|38374039|；gi|56407694|；gi|174334|；gi|2944365|；gi|15919413|；gi|23955449|；gi|22535999|；gi|23957474|；gi|84452205|；gi|2970046|；gi|57434240|；gi|25188112|；gi|38374038|；gi|32997069|；gi|6491780|；gi|20750395|；gi|32527873|；gi|37595616|；gi|60202650|；gi|61699233|；gi|20268828|；gi|1297048|；gi|10645190|；gi|23955451|；gi|83860076|；gi|58047088|；gi|46560275|；gi|82469876|；gi|35210348|；gi|35210344|；gi|45935285|；gi|33324710|；gi|33324712|；gi|23957590|；gi|2920578|；gi|23955454|；gi|25188099|；gi|39546113|；gi|1236771|；gi|34740231|；gi|23955491|；gi|51699480|；gi|510681|；gi|12054694|；
gi|76057964|；gi|61699234|；gi|62512252|；gi|60417875|；gi|56131362|；gi|83318598|以上gi開(kāi)頭的號(hào)碼是GenBank生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)給核苷酸序列標(biāo)的gi(geninfo identifier)碼，它對(duì)應(yīng)唯一的核苷酸序列；GY開(kāi)頭的號(hào)碼是ICB(Identification and Classification of Bacteria)(http://www.mbio.co.jp/icb)數(shù)據(jù)庫(kù)中唯一對(duì)應(yīng)的已知細(xì)菌核苷酸序列。
本發(fā)明的這種功能基因芯片以16S rRNA基因和重要功能基因作探針構(gòu)建基因芯片，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)酸性環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的同步研究，能夠有效的監(jiān)控酸性環(huán)境中微生物特定的功能活動(dòng)，是一種有效的系統(tǒng)發(fā)育分析工具。用本發(fā)明的功能基因芯片能對(duì)酸性環(huán)境的微生物群落進(jìn)行分析，有效克服了傳統(tǒng)微生物分析方法中的嗜酸性細(xì)菌很難進(jìn)行分離培養(yǎng)，以及勞動(dòng)強(qiáng)度大、測(cè)定結(jié)果不夠準(zhǔn)確的缺點(diǎn)。與傳統(tǒng)微生物分析方法相比，利用本發(fā)明分析酸性環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)與功能，具有高通量、同時(shí)、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。


圖1用不同基因與芯片雜交后評(píng)估基因芯片的雜交特異性的雜交圖1、2、3、4、5分別代表pufM、cbbQ、iro、gyrB基因和16s rDNA；圖2不同Acidithiobacillus ferrooxidans DNA濃度與芯片雜交評(píng)估芯片靈敏度的雜交結(jié)果圖A0.2ng；B1ng；C5ng；D25ng圖3不同DNA濃度與芯片雜交評(píng)估基因芯片定量性能的分析圖A亞鐵氧化酶基因(iro)；B16s rRNA(Acidithiobacillus ferrooxidans)；CDNA濃度與總雜交信號(hào)強(qiáng)度的相關(guān)性。
具體實(shí)施例方式
在公知的基因數(shù)據(jù)庫(kù)中，如DDBJ、EMBL、GenBank、ICB(Identificationand Classification of Bacteria)中查找并篩選到嗜酸性微生物的16S rRNA序列和涉及到碳、氮、鐵代謝，金屬抗性以及與膜相關(guān)的，轉(zhuǎn)座子及IST等功能基因序列，如表1～10所示，共1072條。其中大部分序列來(lái)自于嗜酸性微生物，少量人類(lèi)基因用來(lái)作為負(fù)對(duì)照和定量對(duì)照。
在考慮特異性，GC含量，熔解溫度和自身配對(duì)等參數(shù)的基礎(chǔ)上，選擇表1所列的基因中的至少104條，表2所列的基因中的至少55條，表3所列的基因中的至少27條，表4所列的基因中的至少39條，表5所列的基因中的至少44條，表6所列的基因中的至少15條基因，表7所列的至少4條，表8所列的至少12條，表9所列的至少8條和表10所列的至少446條基因序列作為探針序列，其中重復(fù)序列中至少選取一條。50mer的寡核苷酸探針使用經(jīng)修正的PRIMEGENS軟件版本進(jìn)行設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)了包含如表1～10所列的序列中的754～1072個(gè)寡核苷酸探針，芯片上每個(gè)探針點(diǎn)都存在四個(gè)重復(fù)。
寡核苷酸探針使用50％的DMSO溶解，到終濃度為50pmol/μl，然后在相對(duì)濕度為55～58％的環(huán)境條件下將探針打印在玻片上(Cornning，Inc.)。點(diǎn)好的芯片處于室溫下干燥過(guò)夜，最后在600mJ的輻射劑量下進(jìn)行交聯(lián)。
實(shí)施例2芯片雜交特異性評(píng)估選取芯片中包含的16s rDNA，亞鐵氧化酶基因(iro)，編碼DNA螺旋酶B亞單位的gyrB基因，編碼光合反應(yīng)中心復(fù)合體M亞單位的pufM基因，以及cbbQ基因作為靶標(biāo)序列來(lái)檢測(cè)芯片探針的雜交特異性。將這些基因通過(guò)PCR方法擴(kuò)增后使用純化試劑盒對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行純化，所有基因的PCR純化產(chǎn)物按照等量混合，使用cy3熒光染料標(biāo)記后與寡核苷酸芯片在50℃雜交，結(jié)果顯示芯片上與這五個(gè)基因?qū)?yīng)的探針位置點(diǎn)上都產(chǎn)生了很強(qiáng)的熒光信號(hào)(如附圖1)，并且在芯片上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與非靶標(biāo)基因間的非特異性交互雜交現(xiàn)象。說(shuō)明特異性的寡核苷酸探針與其對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因之間具有很強(qiáng)的特異性。
同時(shí)還使用cy3標(biāo)記的Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC23270的純基因組DNA對(duì)50mer寡核苷酸芯片的雜交特異性進(jìn)行了檢測(cè)。芯片上對(duì)應(yīng)于Acidithiobacillus ferrooxidans的探針點(diǎn)都具有很強(qiáng)的雜交信號(hào)，在總共161個(gè)A.f探針中有147個(gè)探針位點(diǎn)的SNR≥3。而其他探針中只有一些存在較低的交叉雜交信號(hào)。此外，A.f23270菌株的ferredoxin基因(登錄號(hào)NC 005023)具有SNR＝47.09的信噪比。這一結(jié)果也表明設(shè)計(jì)的探針與它們對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)基因之間具有很好的特異性。
實(shí)施例3芯片雜交靈敏度檢測(cè)使用Acidithiobacillus ferrooxidans 23270的純基因組DNA來(lái)檢測(cè)本發(fā)明芯片的靈敏度，將Acidithiobacillus ferrooxidans 23270的純基因組DNA按照一定的濃度梯度稀釋(濃度分別為0.2，1，5，25，50，100，250，500 and 750ng)并使用cy3進(jìn)行標(biāo)記后與芯片雜交。從芯片雜交分析結(jié)果我們可以發(fā)現(xiàn)在25-750ng的梯度之間所有A.f基因都具有很強(qiáng)的信號(hào)(見(jiàn)附圖2)，5ng的基因組DNA雜交中可檢測(cè)到大部分的基因信號(hào)但是有一小部分的探針只有很微弱的雜交信號(hào)，而在0.2 and 1ng基因組DNA作為標(biāo)記模板雜交的時(shí)候我們只檢測(cè)到很少的基因信號(hào)。因此，根據(jù)芯片梯度雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們確定芯片對(duì)純培養(yǎng)微生物基因組DNA的檢測(cè)極限為5ng。
實(shí)施例4功能基因芯片的定量性能通過(guò)測(cè)定目標(biāo)DNA濃度與芯片雜交信號(hào)之間的關(guān)系評(píng)估了芯片的用于核酸定量的能力。如前所述，純的Acidithiobacillus ferrooxidans 23270基因組DNA按照梯度稀釋后使用cy3進(jìn)行標(biāo)記并與芯片進(jìn)行雜交，每一濃度的DNA制備三個(gè)平行雜交，每一探針對(duì)應(yīng)的信號(hào)取其均值，以DNA濃度的對(duì)數(shù)值和熒光信號(hào)強(qiáng)度對(duì)數(shù)值作平面圖(見(jiàn)附圖3)。對(duì)于亞鐵氧化酶基因，DNA濃度在1到500ng之間時(shí)濃度與信號(hào)強(qiáng)度之間存在很強(qiáng)的線性相關(guān)性(r2＝0.982)，同樣的線性相關(guān)性也存在與16s rRNA基因探針。此外，當(dāng)DNA濃度范圍在5到500ng之間時(shí)，DNA濃度與芯片的總信號(hào)強(qiáng)度之間也存在很強(qiáng)的線性關(guān)系(r2＝0.98)。這一結(jié)果表明芯片雜交對(duì)于特定濃度范圍內(nèi)的DNA具有定量作用，說(shuō)明了我們構(gòu)建的芯片也可以作為一種定量工具使用。
實(shí)施例4本發(fā)明的芯片在酸性環(huán)境研究中的應(yīng)用使用從酸性水樣中獲得的自然酸性小生境中(pH＝2.0)提取的總DNA與芯片進(jìn)行雜交，以確定這種芯片是否能夠有效的環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)及其相關(guān)功能。從樣品中分別提取的各5ug總DNA使用隨機(jī)引物進(jìn)行cy3熒光標(biāo)記，然后將標(biāo)記好的DNA與芯片進(jìn)行雜交。所有SNR≥3的點(diǎn)被視為具有陽(yáng)性信號(hào)，在樣品中，樣品共產(chǎn)生31個(gè)陽(yáng)性信號(hào)。在這陽(yáng)性信號(hào)中，與Acidithiobacillusferrooxdians相關(guān)的16S rRNA探針雜交信號(hào)很強(qiáng)，說(shuō)明Acidithiobacillusferrooxdians是在這一微生物群落的優(yōu)勢(shì)種群，這一結(jié)果與我們通過(guò)傳統(tǒng)的PCR克隆的方法保持一致。此外，在芯片上，與Acidithiobacillus ferrooxdians相關(guān)的能量代謝基因也有較強(qiáng)的雜交信號(hào)，這說(shuō)明在這一微生物群落中，微生物的能量代謝活動(dòng)活躍。綜上所述，本發(fā)明的基因芯片是一種有效的系統(tǒng)發(fā)育分析工具，同時(shí)也能夠有效的監(jiān)控酸性環(huán)境中微生物特定的功能活動(dòng)。
權(quán)利要求
1.一種用于分析酸性環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)及功能的基因芯片，包括基片及固定于基片上的寡聚核苷酸探針，其特征在于所述探針由以下核苷酸序列構(gòu)建而成，所述序列包括表1所列的核苷酸序列中的至少104條，表2所列的核苷酸序列中的至少55條，表3所列的核苷酸序列中的至少27條，表4所列的核苷酸序列中的至少39條，表5所列的核苷酸序列中的至少44條，表6所列的核苷酸序列中的至少15條，表7所列的核苷酸序列中的至少4條，表8所列的核苷酸序列中的至少12條，表9所列的核苷酸序列中的至少8條和表10所列的核苷酸序列中的至少446條；其中重復(fù)序列中至少選取一條。
2.如權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于所述探針由表1～10所列的全部1072條核苷酸序列構(gòu)建而成。
3.如權(quán)利要求1或2所述的基因芯片，其特征在于每個(gè)探針點(diǎn)都存在四個(gè)重復(fù)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于分析酸性環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)及功能的基因芯片。該基因芯片的探針由包括嗜酸性微生物的16S rRNA序列和涉及到碳、氮、鐵代謝，金屬抗性、與膜相關(guān)的基因以及轉(zhuǎn)座子及IST等功能基因序列，以及少量作為負(fù)對(duì)照和定量對(duì)照的人類(lèi)基因，共754～1072條寡聚核苷酸序列構(gòu)建而成。本發(fā)明的芯片能高通量、快速、準(zhǔn)確、靈敏地分析對(duì)酸性環(huán)境中的微生物群落進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能同步分析，有效克服了傳統(tǒng)微生物分析方法中嗜酸性細(xì)菌難以進(jìn)行分離培養(yǎng)，勞動(dòng)強(qiáng)度大、測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確的缺點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101074449SQ20071003475
公開(kāi)日2007年11月21日 申請(qǐng)日期2007年4月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月17日
發(fā)明者邱冠周, 劉學(xué)端, 覃文慶, 劉新星, 申麗, 王軍 申請(qǐng)人:中南大學(xué)