專利名稱：基于連接子聚合酶鏈式反應和磁性納米粒子的單核苷酸多態(tài)性檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種應用連接子聚合酶鏈式反應(Linker-PCR)和磁 性納米粒子的基因檢測技術，尤其是 一 種多位點的單核苷酸多態(tài)性 (SNP)的檢測方法
背景技術：
隨著人類基因組測序工作的完成，人類基因組的DNA序列已被 初步地測定和分析，現(xiàn)有的研究結果表明，人類基因組約含有3萬 4 萬個蛋白質(zhì)編碼基因，全面深入地了解個體和群體間基因組的變異或 多態(tài)性已成為可能，并日益顯示其重要性。人類基因組中的遺傳多態(tài) 性較多地表現(xiàn)在重復序列，特別是短串聯(lián)重復序列，如小衛(wèi)星DNA和 微衛(wèi)星DNA，它們的多態(tài)性主要是基于重復序列拷貝數(shù)的變異。另一 類更加普遍的多態(tài)性是基因組中散在的單個堿基的不同。這種不同雖 然也包括單個堿基的缺失和插入，但更多的是單個堿基的置換，即單 核苷酸的多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)。 SNP為數(shù)眾 多，分布廣泛。隨著人類基因組計劃的進展，人們愈來愈相信基因組 中的這類多態(tài)性有助于解釋個體的表型差異、不同群體和個體對疾 病，特別是對復雜疾病的易感性、以及對各種藥物的耐受性和對環(huán)境 因子的反應。因此，研究SNP己成為人類基因組計劃的內(nèi)容和目標之
近年來，國內(nèi)外有關SNP分型檢測技術正成為研究熱點，新的SNP 檢測方法層出不窮，如以分子構象不同為基礎的檢測方法，包括測序 法、單鏈構象多態(tài)性分析、限制性長度多態(tài)性分析、變性高壓液相色 譜等；以熒光共振能量傳遞，包括Taqman法、分子信標(molecular beacons)法、侵入法(Invader assay)等；此外還有以分子雜交技術 為基礎的檢測方法，包括等位基因特異性寡核苷酸探針雜交法、動態(tài) 等位基因特異性雜交法、寡核苷酸連接法，基因芯片法等；除了以上 三大類方法以外，還有如質(zhì)譜法、AFM法單個堿基延伸標記法。目前，SNP與復雜疾病的遺傳易感性已經(jīng)成為的SNP研究重點。 復雜性狀的形成受許多微效加性基因的作用，與疾病相關的單個SNP 不能引起疾病，而是一系列易感性主基因上存在的SNP群的共同作 用以及環(huán)境因素的影響決定某一個體是否患某種疾病。而要進行這方 面的研究，就需要能夠簡便地不同基因的多個SNP的基因型在年齡、 種族相匹配的病人和對照人群中的發(fā)生頻率，因此要對大量的樣本的 多個SNP位點進行快速、低成本的基因分型。但是現(xiàn)有的各種SNP 檢測方法很難滿足這種需求因此，探索和建立高效、低成本、高通量 且適合于臨床應用的多位點SNP檢測方法是十分必要的。
隨著納米技術的迅速發(fā)展，納米材料廣泛應用到生命科學領域， 為其研究和發(fā)展提供了新的技術和手段。磁性納米粒子(MNPs)
作為納米材料的一個重要組成部分，由于其特殊的物理化學性質(zhì)和 生物相容性，目前已被廣泛應用于細胞的分離、免疫測定、蛋白質(zhì) 和酶的固定以及DNA的檢測等。磁性納米粒子在溶液中較好的擴散 型，高的表面積以及特殊的磁分離性質(zhì)使其在核酸檢測方面具有非 常廣闊的應用前景。 發(fā)明目的
本發(fā)明的目的是為了提供一種利用連接子聚合酶鏈式反應 (Linker-PCR)對樣本進行全基因組擴增，再利用磁性納米粒子做為 擴增產(chǎn)物載體針對基因組中多個單核苷酸多態(tài)性位點(SNP位點)進 行分析的分型檢測方法，該方法利用了 Linker-PCR和磁性納米粒子 的優(yōu)點，能夠簡便、高效、準確地實現(xiàn)對大量樣品多個SNP位點分 型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn)
基于磁性納米粒子的SNP分型方法，包括下述步驟 (1) 選取多個待檢測的重要功能SNP位點。針對每個待測位點 設計兩條分別與兩種等位基因互補的野生和突變檢測探 針，待檢測位點位于探針序列的中間且每條探針的一端帶 有標記物。(2) 限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA用足量的限制性內(nèi)切酶消 化成短片段。選取的內(nèi)切酶的識別序列避開了絕大部分 SNP位點，因此經(jīng)該酶消化后，各個基因的功能SNP位點
基本保持完整。消化產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化。
(3) 設計、制備連接子Linker。 Linker是由兩條互補的寡聚核 苷酸鏈構成，且互補兩序列后形成與酶切切口互補的粘性 末端。其中一條寡核苷酸5'端標記有生物素。
(4) 將制備好的Linker通過T4 DNA連接酶連接到純化后的消 化產(chǎn)物未端。
(5) 以步驟(3)中生物素標記的寡核苷酸為擴增引物在多孔板 中進行Linker-PCR擴增。
(6) 將擴增產(chǎn)物固定到磁性顆粒上，然后將帶有PCR產(chǎn)物的磁 性顆粒均勻的分到不同的反應管中，經(jīng)變性、洗滌后，各 管中固定在顆粒表面的單鏈DNA(ssDNA)與不同SNP位點 的檢測探針在特定溫度下雜交。
(7) 將雜交有檢測探針的磁性納米粒子經(jīng)洗滌、變性、磁分離 后，通過檢測變性下來探針上的標記物來實現(xiàn)對樣本的 SNP分型。
所述的標記物為雙色熒光標記物，對應檢測樣本基因型的方法為 雙色熒光檢測法。
所述步驟(7)中SNP檢測方法，其中當所述的步驟(l)兩條檢測探 針分別標記熒光Cy3和Cy5時，通過雙色熒光檢測，則可實現(xiàn)樣本 的SNP分型。
所述的步驟(l)標記物為發(fā)光酶、熒光、納米金時，對應步驟(6) 中兩種檢測探針分別加入到兩管進行雜交，對應步驟(7)檢測樣本基 因型的方法為化學發(fā)光法、熒光檢測法和銀染法。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術具有如下優(yōu)點
1、本發(fā)明使用Linker-PCR實現(xiàn)了全基因組擴增。磁性納米粒子 一DNA復合體包含了基因組中絕大多數(shù)SNP位點，通過與不同位點 的檢測探針雜交能夠?qū)崿F(xiàn)多位點檢測。2、 本發(fā)明使用了磁性納米顆粒作為雜交靶序列載體，可避免對 靶序列純化、濃縮而導致成本高、費時、費力的缺陷。因此，本發(fā) 明具有成本低、快速、簡便的優(yōu)點。
3、 本發(fā)明在整個實驗過程中，都可以在96或384孔板中進行， 對于樣本的分型能夠借助芯片法實現(xiàn)，因此能夠?qū)崿F(xiàn)對大量樣本的高
通量、自動化檢測。


附圖為實施方案的流程圖。
圖中標號說明如下
1為基因組DNA， 2待檢測不同SNP位點，3生物素標記的 連接子(Linker), 4為親合素標記的磁性納米粒子，5為Cy3標記 的野生探針，6為Cy5標記的突變探針。
具體實施方式
實施方案-
1) 選取一些重要的功能SNP位點，針對每個待測位點設計兩 條分別標記Cy3和Cy5的野生和突變檢測探針，待檢測位點位 于探針序列的中間且每條探針的一端帶有標記物。
2) 限制性內(nèi)切酶Msel消化基因組DNA用足量的限制性內(nèi) 切酶Msel在6(TC下消化過夜。這個內(nèi)切酶(識別序列為 T*TAA)將基因組DNA消化成短片段，片段大小在200-2000 個堿基之間。由于該酶的識別序列避開了絕大部分SNP位點， 因此經(jīng)該酶消化后，各個基因的功能SNP位點基本保持完整。 消化產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化。
3) 制備Linker。 Linker是由兩條寡聚核苷酸鏈Ll和L2構成， 序列為Ll: 5'-Biotin-AGG CAA CTG TGC TAT CCG AGG GAT-3，和L2: 5'-TAA TCC CTC GGA-3'。其中L1的5，端標記 生物素。Linker的制備過程如下將兩條寡聚核苷酸鏈(濃度 為100 pM)等量混合。在55'C下溫浴10分鐘，然后在慢慢冷卻至室溫復性。
4) 復性后的linker通過T4 DNA連接酶連接到純化后的消化 產(chǎn)物未端，目的是為擴增待測靶序列提供一條通用引物。連接 反應在16'C下過夜；連接完成后，在7(TC下5分鐘終止反應；
5) 進行Linker-PCR擴增。以生物素標記的Ll為擴增引物， 反應體系為100^1，其中含有l(wèi)x反應緩沖液，2.5 mM的Mg2+， 0.4 的引物，4U的Taq DNA聚合酶，5%的DMSO及200
的dNTP。 PCR擴增程序如下95T預變性4分鐘，然后95°C 變性1分鐘，7(TC復性2分30秒，72'C延伸30秒，PCR的循 環(huán)數(shù)為20個，最后，72'C再延伸10分鐘。通過Linker-PCR所 有的酶切產(chǎn)物都被大量擴增。
6) 將擴增產(chǎn)物固定到磁性顆粒上，然后將帶有PCR產(chǎn)物的磁 性顆粒均勻的分到不同的反應管中，經(jīng)變性、洗滌后，各管中 固定在顆粒表面的單鏈耙序列與不同SNP位點的野生和突變 檢測探針在特定溫度下雜交。
7) 雜交、洗滌后，將與產(chǎn)物結合的探針變性下來，磁分離后， 將熒光探針點樣到未經(jīng)任何修飾的玻片表面。
8) 通過生物芯片掃描儀，對樣品的分型結果進行分析。野生 純合型樣本與Cy3標記探針雜交，產(chǎn)生"綠色"熒光信號；突 變純合型樣本與Cy5標記探針雜交，.產(chǎn)生"紅色"熒光信號； 雜合型同時與Cy3和Cy5標記探針雜交，產(chǎn)生"黃色"熒光信 號。
權利要求
1、一種基于連接子聚合酶鏈式反應(Linker-PCR)和磁性納米粒子單核苷酸多態(tài)性檢測方法，其特征在于選取特定的限制性內(nèi)切酶將基因組DNA打斷，避開待檢測SNP位點。而所設計的連接子是由兩條互補的寡聚核苷酸鏈構成，且互補兩序列后形成與酶切切口互補的粘性末端。而且其中作為Linker-PCR引物的一條寡核苷酸5’端標記有生物素。連接子通過T4連接酶將Linker同打斷的基因組DNA片斷相連接。
2、 根據(jù)權利要求1所述單核苷酸多態(tài)性檢測方法。其特征在 于通過Linker—PCR將所有連接有連接子的片斷進行擴 增，實現(xiàn)全基因組擴增。
3、 根據(jù)權利要求1， 2所述單核苷酸多態(tài)性檢測方法。其特征在于 所述的通過Linker—PCR擴增出的標記生物素的靶序列直 接固定到親合素包被的磁性納米粒子上。變性后磁性納米 粒子一DNA復合物與野生和突變探針雜交。
4、 根據(jù)權利要求1、 2、 3所述單核苷酸多態(tài)性檢測方法，其特征 在于SNP位點所使用的兩條檢測探針一端帶有標記物，標 記物可以分別為兩種不同熒光標記物，也可以為相同標記 物，如納米金、化學發(fā)光物、熒光標記物等。
5、 根據(jù)權利要求2、 3所述單核苷酸多態(tài)性檢測方法，其特征在于所述 PCR反應、雜交、變性和洗滌步驟均在多孔PCR板中進行，能夠?qū)?現(xiàn)自動化。
6、 根據(jù)權利要求1、 3、 4所述的SNP分型方法，其特征在于 所通過檢測變性下來的探針上的標記物實現(xiàn)對樣品的分 型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于連接子聚合酶鏈式反應(Linker-PCR)和磁性納米粒子的單核苷酸多態(tài)性檢測(SNP)方法，其特征在于利用連接子聚合酶鏈式反應(Linker-PCR)對樣本進行全基因組擴增，將生物素標記的擴增靶序列固定到親合素標記的磁性納米顆粒上，通過與等位基因特異探針雜交的方法，實現(xiàn)對樣品的分型。該方法利用Linker-PCR實現(xiàn)了多位點的同時檢測、分型。利用了磁性納米顆粒作為雜交載體，可避免對靶序列純化、濃縮而導致成本高、費時、費力的缺陷。因此，本發(fā)明具有多位點、低成本、快速、簡便的優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK101307357SQ20071003491
公開日2008年11月19日 申請日期2007年5月14日 優(yōu)先權日2007年5月14日
發(fā)明者何農(nóng)躍, 劉洪娜, 松 李, 湯建新, 王志飛, 陸祖宏 申請人:何農(nóng)躍;李 松