專利名稱：一種抗腫瘤藥物埃博霉素全長基因簇的表達(dá)體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因重組，具體涉及利用大分子DNA操縱的方法，構(gòu)建抗腫瘤藥物埃博 霉素全長基因的表達(dá)體系。
背景技術(shù)：
埃博霉素(epothilones)是一個具有潛在價值的抗腫瘤藥物，目前它在諾華公司 (Novartis)處于臨床II期試驗(yàn)階段，在百時美施貴寶公司(Bristol-Myers Squibb)處于臨床III
期試驗(yàn)階段。埃博霉素由革蘭氏陰性細(xì)菌纖維堆囊菌(5^""^^^"http://"/0 ^)產(chǎn)生，這些聚
酮化合物是具有強(qiáng)烈細(xì)胞毒素作用的大環(huán)內(nèi)酯，可以作為抗癌藥物。其作用機(jī)制和抗癌 藥物紫杉醇(泰素，Taxol)相似。埃博霉素同抗癌藥物紫杉醇相比有兩個主要的優(yōu)點(diǎn)。首 先，埃博霉素能夠殺死可以表達(dá)P—蛋白的多藥耐藥腫瘤細(xì)胞系，這種細(xì)胞系用抗癌藥 物紫杉醇是殺不死的。其次，埃博霉素具有很好的水溶性，不像傳統(tǒng)抗癌藥物紫杉醇一
樣需要有副作用的聚氧乙烯醚蓖麻油作為助溶劑。埃博霉素的這些優(yōu)點(diǎn)決定了它可能會
成為臨床實(shí)踐中紫杉醇的替代者。
埃博霉素聚酮化合物是由埃博霉素基因簇編碼的大型多功能酶復(fù)合物催化合成的，
這些基因簇已經(jīng)由科學(xué)家們從不同的土壤粘菌中分離純化和測序，因而現(xiàn)在這些基因簇 可以被修飾和轉(zhuǎn)化到新的菌株。目前，已有科學(xué)家將這些基因簇克隆出來，但至今為止 還沒有完整的全長基因簇；也有研究對其進(jìn)行表達(dá)，但都是利用傳統(tǒng)的分子遺傳操作方 法多次轉(zhuǎn)化，操作耗工耗時，且容易在體內(nèi)或體外發(fā)生重排，因而影響表達(dá)或不能穩(wěn)定 遺傳。
埃博霉素的全長基因簇大于60kb，由于傳統(tǒng)的基因重組技術(shù)很大程度上受到DNA 分子大小的限制，因而現(xiàn)有傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)還不能將埃博霉素的全長基因簇完整 的縫合在一起。
目前，埃博霉素的產(chǎn)量低的問題已成為這一重要藥物進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)的一大障礙，對 原始菌株粘細(xì)菌纖維堆囊菌(&rawg/"m "http://"/0 /附)而言，所報(bào)道的埃博霉素A產(chǎn)量僅為 20mg/L、埃博霉素B僅為10mg/L;埃博霉素C和D則是更低。利用原始宿主菌發(fā)酵生 產(chǎn)埃博霉素存在以下幾個技術(shù)問題(l)、粘細(xì)菌纖維堆囊菌的生長速度非常慢，其倍增 時間是16小時。(2)、粘細(xì)菌纖維堆囊菌的遺傳背景非常模糊；G)、由于此粘細(xì)菌外源
DNA的轉(zhuǎn)化效率低，加之可用的分子生物學(xué)工具的限制，對此菌進(jìn)行DNA分子改造相 當(dāng)困難，因而，影響埃博霉素的工業(yè)化生產(chǎn)。因此，如何將埃博霉素全長基因簇完整的 縫合以及轉(zhuǎn)化到異質(zhì)宿主菌，以提高埃博霉素的產(chǎn)量是規(guī)?；a(chǎn)抗腫瘤藥物埃博霉素 必須解決的技術(shù)問題。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在采用Red/ET同源重組技術(shù)和異質(zhì)宿主菌，使埃博霉素的全長基因簇完整 的縫合在一起，并轉(zhuǎn)化到新的宿主菌中，以解決埃博霉素的全長基因簇的克隆和發(fā)酵生 產(chǎn)中存在的上述問題。
實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)方案為-
抗腫瘤藥物埃博霉素全長基因簇的表達(dá)體系，包括使用Red/ET重組技術(shù)，引入接合 元件和可誘導(dǎo)的啟動子pl5A,將埃博霉素的基因簇印"，e戸5,印oC, 印aP和完整的縫合而構(gòu)建的帶有全長埃博霉素基因簇的重組表達(dá)質(zhì)粒 pl5A-IR-neo-epo-IR-Tpase-BSD-oriT和轉(zhuǎn)入的并使其高效表達(dá)的異質(zhì)宿主菌一惡臭假單 胞菌(i^ew(ioffwmw;7w/"/(iaJ AT2W0禾口黃色禾占球菌(Afywcomw xa"Aws J 7622。
下面結(jié)合附圖進(jìn)一步詳述本發(fā)明。
圖1埃博霉素的基因簇和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；
其中，KS， (3-酮?；；d體蛋白合成酶；KSy，p-酮?；；d體蛋白合成酶(將活 性位點(diǎn)的半胱氨酸替換成了酪氨酸)；AT，?；D(zhuǎn)移酶；DH，脫水酶；ER，反烯酰還原 酶；KR，酮還原酶；MT，甲基轉(zhuǎn)移酶；ACP,?；d體蛋白；TE,硫酯酶；C，濃縮酶；A， 腺苷化酶；PCP，肽載體蛋白。
圖2編碼埃博霉素的7個主要基因；
圖3帶有埃博霉素基因簇的科斯質(zhì)粒epo14和epo35的修飾；
圖4帶有全長epothilones基因簇的重組質(zhì)粒pl5A-epo-km-zeo-cm的構(gòu)建；
圖5全長埃博霉素基因簇表達(dá)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)；
圖6表達(dá)的埃博霉素產(chǎn)物的HPLC分析。
埃博霉素聚酮化合物是由埃博霉素基因簇編碼的大型多功能酶復(fù)合物合成，在埃博 霉素結(jié)構(gòu)中有7個基因，9個模塊和46個結(jié)構(gòu)域(圖1)。這個基因簇大約有60kb。編碼 埃博霉素聚酮化合物的7個基因?yàn)閑; a4、 epo5、 epoC、 epoZ)、 epo五、e; oF、 epo《，其 中woJ^qwD組成埃博霉素基因簇的上游，部分印oZ)(構(gòu)成上下游的重疊部分)、印0￡、
印oF和wo《組成埃博霉素基因簇的下游(圖2)。這7個基因共有55.747kb，其中epo4 為4.266kb， epo5為4.232kb， e/ oC為5.498kb， 為21.774kb, epo五為11.397kb，
e/ oF為7.320kb， e/w尺為1.260kb。
埃博霉素的全長基因簇大于60kb，用一般的分子生物學(xué)方法很難達(dá)到對其全長基因 簇進(jìn)行修飾及插入功能組件，本發(fā)明采用的Red/ET重組工程技術(shù)(Improved RecT or RecET cloning and subcloning method,歐洲專利專利號01117529.6; Methods for heterologous expressio ofsecondary metabolites ，專利申請?zhí)朠CT/IB2005/003650 ; Recombination method,歐洲專利專利號0103276.2)，是基于同源重組的一種對大的DNA 分子(BAC/PAV/P1和科斯質(zhì)粒)和細(xì)菌染色體進(jìn)行修飾的主要方法，其應(yīng)用不受分子大小 的限制，能有效的克服現(xiàn)有的基因操作上技術(shù)難題。
本發(fā)明將埃博霉素全長基因簇通過科斯質(zhì)粒完整的縫合在一起，并轉(zhuǎn)化到惡臭假單 胞菌(尸5^wcfowowos;w"WaJ AT2W0禾卩黃色粘球菌(Afyxococo/s jcaw^ziw^ 7622兩個異 質(zhì)宿主菌中進(jìn)行表達(dá)，順利的解決了埃博霉素藥物生產(chǎn)中原始生產(chǎn)菌發(fā)酵產(chǎn)量低、發(fā)酵 周期長的問題。本發(fā)明將聚酮化合物、假單胞菌、粘細(xì)菌方面的專門技術(shù)和Red/ET技術(shù) 相結(jié)合，為規(guī)模生產(chǎn)抗腫瘤藥物埃博霉素完成了必要的技術(shù)準(zhǔn)備。
具體實(shí)施例方式
抗腫瘤藥物埃博霉素全長基因簇的構(gòu)建
1、 epothilones基因簇的分離及科斯質(zhì)粒epo14和epo35的構(gòu)建
從野生菌株粘細(xì)菌纖維堆囊菌中提取其染色體DNA，用SmdX I消化(含有4個酶 切位點(diǎn))，脈沖電泳分離后回收40~50kb的片段，同時用Saw//1 (Sa"14 I同尾酶)酶 切科斯質(zhì)粒(購自美國Invitro Gene公司)，去磷酸化后與回收的DNA片段以T4 DNA 連接酶連接，然后1500V, 25pF， 200Q電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B (Introducing Red /ET Recombination: DNA Engineering for the 21st Century Gene Cloning & Expression Technologies),獲得含有epothilones基因簇的科斯質(zhì)粒文庫，利用一段600-700bp的末端 用P32同位素標(biāo)記的探針，篩選到5個含有epothilones基因簇陽性克隆，其中兩個分子較 大的克隆便是含有epothilones基因簇上游的科斯質(zhì)粒epo14和含有epothilones基因簇下 游科斯質(zhì)粒epo35。
2、 科斯質(zhì)粒epo14和印o35的修飾
為了把分散在epo14和epo35中的埃博霉素基因簇組合在一起，本發(fā)明在科斯質(zhì)粒 中引入了SpeI限制性酶切位點(diǎn)，選擇性標(biāo)記和P15起始位點(diǎn)。首先，經(jīng)設(shè)計(jì)引物
epol4-F: 5，-GATCTGACGCAGTTGATCGCAGCAAAATTCAAGGCGCTTACATGAA GGAGGACTAGTTCTGCCATTCATCCGCTTATT
epol4陽R: 5，-CCGAGGAGCAGATTCTCTGGCAGCATCTCGTAGGCGGGATATCCGA CAACTTATATCGTATGGGGCTG，(下劃線表示S戸I酶切位點(diǎn))
利用PCR從質(zhì)粒pl5A-cm-neo-zeo (參見文獻(xiàn)Zhang Y, Muyrers JP， Testa Q & Stewart AF. (2000). DNA cloning by homologous recombination in Escherichia coli. iVa^we 歷o阮A(yù)"o/ogy. 18:1314-1317)擴(kuò)增出帶有氯霉素基因和P15A啟動子(來自pACYC177 的強(qiáng)啟動子)的寡核苷酸片斷(2109bp)，由于引物中帶有同科斯質(zhì)粒epol4骨架兩側(cè)相 同的45個堿基，擴(kuò)增的片斷兩端就具有了45個堿基的同源臂，利用Red/ET同源重組技 術(shù)，以擴(kuò)增的片斷同源替換epo14骨架，就構(gòu)成了修飾的含有博霉素基因簇的上游的科 斯質(zhì)粒pl5A-epo14 (圖3)。
然后，設(shè)計(jì)引物
epo35- F: GATACAGCTCGCGCGCGGGTGCTGTCTGCCGCGGGTGCGATTCGATA GTTCGATTTATTCAACAAAG
epo35- R: GGCCGCTTGTTTCAGCGGATTCTGCTGTGCCGTAGGACCGCGAGTA GTCATGATACTAGTTTAATAAGATGATCTTCTTGAG (下劃線表示Spel酶切位點(diǎn))
擴(kuò)增出含有卡拉霉素基因和Zeocin抗性基因及P15A起始位點(diǎn)的寡核苷酸片斷 (2715bp)，擴(kuò)增的片斷帶有epo35骨架和重疊基因兩端45個堿基的同源臂，利用Red/ET 同源重組技術(shù)，以擴(kuò)增的片斷同源替換epo35骨架和重疊基因，就構(gòu)成了修飾的含有博 霉素基因簇的下游的科斯質(zhì)粒pl5A-epo35 (圖3)。
3、 帶有全長epothilones基因簇的重組質(zhì)粒pl5A-epo-km-zeo-cm的構(gòu)建 將修飾后的科斯質(zhì)粒epo14和科斯質(zhì)粒epo35用限制性內(nèi)切酶Spel進(jìn)行切割，然后
以T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物1350V，25^F，200Q電轉(zhuǎn)化大腸桿菌GB2005(Zhang Y, Buchholz F, Muyrers JP， et al. (1998). A new logic for DNA engineering using recombination in Escherichia coli. Nature Genetics. 20(2):123-8)， 通過卡拉霉素、zeocin禾口 氯霉素三種抗生素聯(lián)合篩選，并用菌落PCR進(jìn)行鑒定，獲得了含有全長的埃博霉素基因 簇的重組質(zhì)粒pl5A-epo-km-zeo-cm，不僅形成了一個全長的埃博霉素基因簇(圖4)，同 時，還為全長的埃博霉素基因簇加入了pl5A的強(qiáng)啟動子，有利于其高效表達(dá)。
4、 重組表達(dá)質(zhì)粒pl5A-IR-neo-epo-IR-Tpase-BSD-oriT的構(gòu)建
利用Red/ET基因重組技術(shù)在轉(zhuǎn)座酶Tpase后面加入Blasticidin抗性基因(BSD)及 oriT形成Tpase-BSD-oriT組件，將其及一端轉(zhuǎn)座位點(diǎn)(IR)插入到縫合后的埃博霉素基
因的3 ，端，同源替換pl5A-epo-km-zeo-cm中的km-zeo-cm組件，同時在印oA基因的 前面插入Tn5強(qiáng)啟動子并帶入另一端轉(zhuǎn)座位點(diǎn)(IR);然后，PCR擴(kuò)增neo抗性基因，利 用Red/ET同源重組技術(shù)插入到epoA的前面，就獲得了埃博霉素全長基因簇的重組表達(dá) 質(zhì)粒pl 5A-IR-neo-epo-IR-Tpase-BSD-oriT (圖5 )。
5、重組表達(dá)質(zhì)粒pl5A-IR-neo-epo-IR-Tpase-BSD-oriT轉(zhuǎn)入異質(zhì)宿主菌。 發(fā)明人在長期的研究中發(fā)現(xiàn)了可以用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素的生長速度快的兩個 異質(zhì)宿主菌，即惡臭假單胞菌KT2440 (i^Wo7KO"^y/w"'c/"^:7^卯)和黃色粘球菌1622 (MyxococcM xa"f/^ 7622)。已知惡臭假單胞菌KT2440的整個基因組已經(jīng)測序完成，并 含有一個大的DNA轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其產(chǎn)生的聚酮化合物，有一個丙二酰CoA和甲基丙二酰 CoA，并且含有一個P-pant轉(zhuǎn)移酶；惡臭假單胞菌KT2440已用于工業(yè)發(fā)酵許多年，其 倍增時間和大腸桿菌的相當(dāng)，而且它的基因組序列中的GC含量較高，接近于土壤粘菌。 另一個菌株是黃色粘球菌1622，它是遺傳背景最清楚的粘細(xì)菌，能表達(dá)埃博霉素基因來 生產(chǎn)埃博霉素，而且可以利用基因工程技術(shù)進(jìn)行改造。其次，黃色粘球菌1622比纖維堆 囊菌OS: ^//w/cm^)有一個更短的倍增時間5小時，這可以提高裝置的容積產(chǎn)率。
利用電轉(zhuǎn)化(2500V ， 25^F , 200Q， 2mm)將重組表達(dá)質(zhì)粒 pl5A-IR-neo-epo-IR-Tpase-BSD-oriT轉(zhuǎn)化入黃色粘球菌1622 (JVfyxococcws xcm^s 中；利用接合技術(shù)(Silke C， Zhang Y， Fu J， et al. (2005). Heterologous Expression of a Myxobacterial Natural Products Assembly Line in Pseudomonads via Red/ET Recombineering. Chemistry & Biology. 12:349—356)將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入惡臭假單胞菌KT2440 (i^wJowomw戶riJ"/iT2W0)，利用卡拉霉素抗性和菌落PCR篩選到陽性的轉(zhuǎn)化子；同 時利用轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)的同源重組將外源基因整合到宿主菌的染色體上，獲得能穩(wěn)定的異質(zhì) 表達(dá)埃博霉素的新型工程菌株。表達(dá)產(chǎn)物的HPLC檢測如圖6所示，轉(zhuǎn)入重組表達(dá)質(zhì)粒 的假單胞菌工程菌的HPLC圖譜上具有同原始菌株對應(yīng)的峰1，峰2和峰3 (埃博霉素產(chǎn) 物)，但野生的假單胞菌則沒有產(chǎn)生對應(yīng)的峰1-3;而且假單胞菌工程菌的峰1和3的峰 值比原始菌株對應(yīng)的峰要大，說明本發(fā)明縫合在一起的全長埃博霉素基因簇在異質(zhì)表達(dá) 宿主菌假單胞菌中獲得了高效的表達(dá)。 〈110〉湖南師范大學(xué)
〈120〉 一種抗腫瘤藥物埃博霉素全長基因簇的表達(dá)體系
〈160〉 1
〈210〉 1
<211〉 60674
〈212〉 ■
<213〉 埃博霉素全長基因簇表達(dá)質(zhì)粒pl5A-IR-neo-印o-IR-Tpase-BSD-oriT全序列
〈220〉 〈400〉 1
ggtttagttc ctcaccttgt cgtattatac tatgccgata tactatgccg atgattaatt 60
gtgtatccaa cggcgtcagc cgggcaggat aggtgaagta ggcccacccg cgagcgggtg 180
ttccttcttc actgtccctt attcgcacct ggcggtgctc aacgggaatc ctgctctgcg 240
aggctggccg gctaccgccg gcgtaacaga tgagggcaag cggatggctg atgaaaccaa 300
gccaaccagg aagggcagcc cacctatcaa ggtgtactgc cttccagacg aacgaagagc 360
gattgagg犯aaggcggcgg cggccggcat gagcctgtcg gcctacctgc tggccgtcgg 420
ccagggctac aaaatcacgg gcgtcgtgga ctatgagcac gtccgcgagc tggcccgcat 480
c組ggcgac ctgggccgcc tgggcggcct gctgaaactc tggctcaccg acgacccgcg 540
cacggcgcgg ttcggtgatg ccacgatcct cgccctgctg gcgaagatcg actctaggtc 600
cctcctgttc agctactgac ggggtggtgc gtaacggcaa aagcaccgcc ggacatcagc 660
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tcatgtggca ggagaaaaaa ggctgcaccg gtgcgtcagc agaatatgtg atacaggata 780
tattccgctt cctcgctcac tgactcgcta cgctcggtcg ttcgactgcg gcgagcggaa 840
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aaatctgacg ctcaaatcag tggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 1020
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ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa 2220
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aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg 2460
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鄉(xiāng)gctcgcg cgacaccgtc gggcgagtcc ccgccgaacg ctgggatgca gcagcgtggt 2940
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ggctgtacga tgtatggtcc gcgttccgcg aggcgttcga cctgtgcgtg aggctgttca 4500
accaggagct cgaccggccg ctccgcgagg tgatgtgggc cgaaccggcc agcgtcgacg 4560
ccgcgctgct cgaccagaca gccttcaccc agccggcgct gttcaccttc gaatatgcgc 4620
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tggctgcgcg cgggcgcctg atgcaggcgc tgccggccgg cggggcgatg gtgtcgatcg 4800
aggcgccgga ggccgatgtg gctgctgcgg tggcgccgca cgcagcgtcg gtgtcgatcg 4860
ccgcggtcaa cgctccggac caggtggtca tcgcgggcgc cgggcaaccc gtgcatgcga 4920
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gagtgaaggc gctgcacgcg gccggtgcgg gcaccttcgt cgaggtcggt ccgaaatcga 5220
cgctgctcgg cctggtgcct gcctgcatgc cggacgcccg gccggcgctg ctcgcatcgt 5280
cgcgcgctgg gcgtgacgag ccggcgaccg tgctcgaggc gctcggcggg ctctgggccg 5340
tcggtggcct ggtctcctgg gccggcctct tcccctcagg ggggcggcgg gtgccgctgc 5400 ccacgtaccc ttggcagcgc gagcgctact ggatcgacac gaaagccgac gacgcggcgc 5460
gtggcgaccg ccgtgctccg ggagcgggtc acgacgaggt cgaggagggg ggcgcggtgc 5520
gcggcggcga ccggcgcagc gctcggctcg accatccgcc gcccgagagc ggacgccggg 刷O
agaaggtcga ggccgccggc gaccgtccgt tccggctcga gatcgatgag ccaggcgtgc 5640
ttgatcacct cgtgcttcgg gtcacggagc ggcgcgcccc tggtctgggc gaggtcg卿 5700
tcgccgtcga cgcggcgggg ctcagcttca atgatgtcca gctcgcgctg ggcatggtgc 5760
ccgacgacct gccgggaaag cccaaccctc cgctgctgct cggaggcgag tgcgccgggc 5820
tttcggcggg agcgtttgct acccacgtca ccacgtcggc tgcgctggtg ctgcctcggc 5940
ctcaggcgct ctcggcgatc gaggcggccg ccatgcccgt cgcgtacctg acggcatggt 6000
acgcgctcga cagaatagcc cgccttcagc cgggggagcg ggtgctgatc catgcggcga 6060
ccggcggggt cggtctcgcc gcggtgcagt gggcgcagca cgtgggagcc gaggtccatg 6120
cgacggccgg cacgcccgag aELacgcgcct acctggagtc gctgggcgtg cggtatgtga 6180
gcgattcccg ctcggaccgg ttcgtcgccg acgtgcgcgc gtggacgggc ggcgagggag 6240
gatcgcacgg ccggtttgtg gagctcggca agcgcgactg ttacgcggat aaccagctcg 6360
ggctgcggcc gttcctgcgc aatctctcct tctcgctggt ggatctccgg gggatgatgc 6420
tcgagcggcc ggcgcgggtc cgtgcgctct tggaggagct cctcggcctg atcgcggcag 6480
gcgtgttcac ccctcccccc atcgcgacgc tcccgatcgc ccgtgtcgcc gatgcgttcc 6540
ggagcatggc gcaggcgcag catcttggga agctcgtact cacgctgggt gacccggagg 6600
tccagatccg tattccaacc cacgcaggcg ccggcccgtc caccggggat cgggacctgc 6660
tcgacaggct cgcgtcagct gcgccggccg cgcgcgcggc ggcgctggag gcgttcctcc 6720
gtacgcaggt ctcgcaggtg ctgcgcacgc ccgaaatcaa ggtcggcgcg gaggcgctgt 6780
tcacccgcct cggcatggac tcgctcatgg ccgtggagct gcgcaatcgt atcgaggcga 6840
gcctcaagct gaagctgtcg acgacgttcc tgtccacgtc ccccaatatc gccttgttgg 6900
cccaaaacct gttggatgct ctcgccacag ctctctcctt ggagcgggtg gcggcggaga 6%0
acctacgggc aggcgtgcaa aacgacttcg tctcatcggg cgcagatcaa gactgggaaa 7020
tcattgccct atgacgatca atcagcttct gaacgagctc gagcaccagg gtatcaagct 7080
ggcggccgat ggggagcgcc tccagataca ggcccccaag aacgccctga acccgaacct 7140
gctcgctcga atctccgagc acaaaagcac gatcctgacg atgctccgtc agagactccc 7200
cgcagaatcc atcgtgcccg ccccagccga gcggcacgct ccgtttcctc tcacagacat 7260
ccaagaatcc tactggctgg gccggacagg agcgtttacg gtccccagcg ggatccacgc 7320
ctatcgcgaa tacgactgta cggatctcga cgtgccgagg ctgagccgcg cctttcggaa 7380
agtcgtcgcg cggcacgaca tgcttcgggc ccacacgctg cccgacatga tgcaggtgat 7440
cgagcctaaa gtcgacgccg acatcgagat catcgatctg cgcgggctcg accggagcac 7500
acgggaagcg aggctcgtgt cgttgcgaga tgcgatgtcg caccgcatct atgacaccga 7560
gcgccctccg ctctatcacg tcgtcgccgt tcggctggac gagcggcaaa cccgtctcgt 7620
gctcagtatc gatctcatta acgttgacct aggcagcctg tccatcatct tcaaggactg 7680
gctcagcttc tacgaagatc ccgagacctc tctccctgtc ctggagctct cgtaccgcga 7740
ttatgtactc gcgctggagt ctcgcaagaa gtctgaggcg catcaacgat cgatggatta 7800
ctggaagcgg cgcatcgccg agctcccacc tccgccgacg cttccgatga aggccgatcc 7860
gggtcgattg aagcggcgtg tcggggagcg cgggctgacc ccgacgggcg tcatcctggc 7980
tgcattttcc gaggtgatcg ggcgctggag cgcgagcccc cggtttacgc tcaacataac 8040
gctcttcaac cggctccccg tccatccgcg cgtgaacgat atcaccgggg acttcacgtc 8100
gatggtcctc ctggacatcg acaccactcg cgacaagagc ttcgaacagc gcgctaagcg 8160
gcgagaggcc gcccgggtcc tggggatcca acgaggcgca ttgttccccg tggtgctcac 8280
gagcgcgctt aaccagcaag tcgttggtgt cacctcgttg cagaggctcg gaactccggt 8340
gtacaccagc acgcagactc ctcagctgct gctggatcat cagctctacg agcacgatgg 8400
ggacctcgtc ctcgcgtggg acatcgtcga cggagtgttc ccgcccgacc ttctggacga 8460
catgctcgaa gcgtacgtcg tttttctccg gcggctcact gaggaaccat ggggtgaaca 8520
ggtgcgctgt tcgcttccgc ctgcccagct agaagcgcgg gcgagcgcaa acgcgaccaa 8580
cgcgctgctg agcgagcata cgctgcacgg cctgttcgcg gcgcgggtcg agcagctgcc 8640
ttcgcggcga cttggcgcgc ggctgcgcga gcagggggca cgcccgaaca cattggtcgc 8760
ggtggtgatg g卿犯ggct gggagc鄉(xiāng)t tgtcgcggtt ctcgcggtgc tcgagtcagg 鵬O
cgcggcctac gtgccgatcg atgccgacct accggcggag cgtatccact acctcctcga 8880
gccggggatc cagcggctgc tcgtgagcga ggccggcgtc gaaggcgacg gcgaccagcc 9000
gccggacgcg tccaagctgc gcgatccggc gcattgggca gagttgatcg aacgagagaa 9300
ggtgacggtg tggaactcgg tgccggcgct gatgcggatg ctcgtcgagc attttgaggg 9360
ggtgggcctg cctggcgagc tccaggccat caggcccggc gtgtcggtga tcagcctggg 9480
cggggccacc gaagcgtcga tctggtccat cgggtacccc gtgaggaacg tcgacctatc 9540
ggcgctcgaa ccgcgcccgg tctgggttcc ggggcaactc tacattggcg gggtcgggct 9660
ggcactgggc tactggcgcg atgaagagaa gacgcgcaag agcttcctcg tgcaccccga 9720
gaccggggag cgcctctaca agaccggcga tctgggccgc tacctgcccg atggaaacat 9780
ggaaatcgag gaaacgctca agtcgcatcc gaacgtacgc gacgcggtga ttgtgcccgt 9900
cgggaacgac gcggcgaaca agctccttct agcctatgtg gtcccggagg gcacacggag 9%0
acgcgctgcc gagcaggacg cgagcctcaa gaccgagcgg atcgacgcga gagcacacgc 10020
cgccgaagcg gacggcttga gcgacggcga gagggtgcag ttcaagctcg ctcgacacgg 10080
actccggagg gacctggacg gaaagcccgt cgtcgatctg accgggcagg atccgcggga 10140
ggcggggctg gacgtctacg cgcgtcgccg tagcgtccga acgttccttg aggccccgat 10200
tccgtttgtt gagtttggtc gattcctgag ctgcttgagc agcgtggagc ccgacggcgc 10260
gacccttccc aaattccgtt atccatcggc gggcagcacg tacccggtgc aaacctacgc 10320
gtatgtcaaa tccggccgca tcgagggcgt ggacgagggc ttctattatt accacccgtt 10380
cgagcaccgt ttgctgaagc tctccgatca cgggatcgag cgcggagcgc acgttcggca 10440
aaacttcgac gtgttcgatg aagcggcgtt caacctcctg ttcgtgggca ggatcgacgc 10500
catcgagtcg ctgtatggat cgtcgtcgcg agaattttgc ctgctggagg ccggatatat 10560
ggcgcagctc ctgatggagc aggcgccttc ctgcaacatc ggcgtctgtc cggtggggca 10620
attcaatttt gaacaggttc ggccggttct cgacctgcga cattcggacg tttacgtgca 10680
cggcatgctg ggcgggcggg tagacccgcg gcagttccag gtctgtacgc tcggtcagga 10740
ttcctcaccg aggcgcgcca cgacgcgcgg cgcccctccc ggccgcgagc agcacttcgc 10800
cgatatgctt cgcgacttct tgaggaccaa actacccgag tacatggtgc ctacagtctt 10860
cgtggagctc gatgcgttgc cgctgacgtc caacggcaag gtcgatcgta aggccctgcg 10920
cgagcggaag gatacctcgt cgccgcggca ttcggggcac acggcgccac gggacgcctt 10980
ggaggagatc ctcgtcgcgg tcgtacggga ggtgctcggg ctggaggtgg tcgggctcca 11040
gcagagcttc gtcgatcttg gtgcgacatc gattcacatc gttcgcatga ggagcctgtt 11100
gcagaagagg ctggataggg agatcgccat caccgagttg ttccagtacc cgaacctcgg 11160
ctcgctggcg tccggtttgc gccgagactc gagagatcta gatcagcggc cgaacatgca 11220
ggaccgagtg gaggttcggc gcaagggcag gagacgtagc taagagcgcc gaacaaaacc 11280
aggccgagcg ggccgatgag ccgcaagccc gcctgcgtca ccctgggact catctgatct 11340
gatcgcgggt acgcgtcgcg ggtgtgcgcg ttgagccgtg ttgttcgaac gctgaggaac 11400
ggtgagctca tggaagaaca agagtcctcc gctatcgcag tcatcggcat gtcgggccgt 11460
tttccggggg cgcgggatct ggacgaattc tggaggaacc ttcgagacgg cacggaggcc 11520
gtgcagcgct tctccgagca ggagctcgcg gcgtccggag tcgaccccgc gctggtgctg 11580
gacccgagct acgtxcgggc gggcagcgtg ctggaagacg tcgaccggtt cgacgctgct 11640ttcttcggca tcagcccgcg cgaggcagag ctcatggatc cgcagcaccg gatcttcatg 11700
gaatgcgcct gggaggcgct ggagaacgcc ggatacgacc cgacggctta cgagggctct 11760
atcggcgtgt acgccggcgc caacatgagc tcgtacttga cgtcgaacct ccacgagcac 11820
ccagcgatga tgcggtggcc cggctggttt cagacgttga tcggcaacga caaggattac 11880
ctcgcgaccc acgtctccta caggctgaat ctgagagggc cgagcatctc cgttcaaact 11940
gcctgctcca cctcgctcgt ggcggttcac ttggcgtgca tgagcctcct ggaccgcgag 12000
aacggcacga tcatgggcaa cggctgcggc gttgtcctcc tgaagccgct ggaccgggcg 12180
gcgaggaaga tcgggttcac tgcgcccagt gaggtgggcc aggcgcaagc gatcatggag 12300
gcgctggcgc tggcaggggt cgaggcccgg tccatccaat acatcgagac ccacgggacc 12360
ggcacgctgc tcggagacgc catcg，cg gcggcgctgc ggcgggtgtt cggtcgcgac 12420
ccgcccagcc tgaacttcga gtctcctaac ccatcgatcg atttcgcgag cagcccgttc 12600
tacgtcaata cctctcttaa ggattggaat accggctcga ctccgcggcg ggccggcgtc 12660
agctcgttcg ggatcggcgg caccaacgcc catgtcgtgc tggaggaagc gcccgcggcg 12720
aagcttccag ccgcggcgcc ggcgcgctct gccgagctct tcgtcgtctc ggccaagagc 12780
gcagcggcgc tggatgccgc ggcggcacgg ctacg卿tc atctgcaggc gcaccagggg 12840
atttcgttgg gcgacgtcgc cttcagcctg gcgacgacgc gcagccccat ggagcaccgg 12900
ctcgcgatgg cggcgccgtc gcgcg鄉(xiāng)cg ttgcgagagg ggctcgacgc agcggcgcga 12960
ggcc卿ccc cgccgggcgc cgtgcgtggc cgctgctccc caggcaacgt gccgaaggtg 13020
gtcttcgtct ttcccggcca gggctctcag tgggtcggca tgggccggca gctcctggct 13080
gaggaacccg tcttccacgc ggcgctttcg gcgtgcgacc gggccatcca ggccgaagct 13140
tggggtgtcg cgcccgacgt cgtgatcggc cacagcatgg gcgaggtagc cgccgcgcat .13320
gtggccgggg cgctgtcgct cgaggatgcg gtggcgatca tctgccggcg cagccggctg 13380
ctccggcgca tcagcggtca gggcgagatg gcggtgaccg agctgtcgct ggccgaggcc 13440
gaggcggcgc tccgaggcta cgaggatcgg gtgagcgtgg ccgtgagcaa cagcccgcgc 13500
tcgacggtgc tctcgggcga gccggcagcg atcggcgagg tgctgtcgtc cctgaacgcg 13560
aagggggtgt tctgccgtcg ggtgaaggtg gatgtcgcca gccacagccc gcaggtcgac 13620
ccgctgcgcg aggacctctt ggcagccctg ggcgggctcc ggccgggtgc ggctgcggtg 13680
ccgatgcgct cgacggtgac gggcgccatg gtagcgggcc cggagctcgg agcgaattac 13740
tggatgaaca acctcaggca gccagtgcgc ttcgccgagg tagtccaggc gcagctccaa 13800
ggcggccacg gtctgttcgt ggagatgagc ccgcatccga tcctaacgac ttcggtcgag 13860
gagatgcggc gcgcggccca gcgggcgggc gcagcggtgg gctcgctgcg gcgggggcag 13920
gacgagcgcc cggcgatgct ggaggcgctg ggcacgctgt gggcgcaggg ctaccctgta 13980
ccctgggggc ggctgtttcc cgcggggggg cggcgggtac cgctgccgac ctatccctgg 14040
cagcgcgagc ggtactggat cgaagcgccg gccaagagcg ccgcgggcga tcgccgcggc 14100
gtgcgtgcgg gcggtcaccc gctcctcggt gaaatgcaga ccctgtcaac ccagacgagc 14160
acgcggctgt gggagacgac gctggatctc aagcggctgc cgtggctcgg cgaccaccgg 14220
gtgcagggag cggtcgtgtt tccgggcgcg gcgtacctgg agatggcgat ttcgtcgggg 14280
gccgaggctt tgggcgatgg ccctttgcag ataactgacg tggtgctcgc cgaggcgctg 14340
cggctgcagt tccagatcgc gagccgggcg ccgggcgctg gccacgcgtc cttccgggtc 14460
cacgctcgcg gcgcgttgct ccgagtggag cgcaccgagg tcccggctgg gcttacgctt 14520
tccgctgtgc gcgcgcggct ccaggccagc atacccgccg cggccaccta cgcggagctg 14580
accgagatgg ggctgcagta cggccctgcc ttccagggga ttgctgagct atggcggggt 14640
gaaggcgagg cgctgggacg ggtacgcctg cccgacgcgg ccggctcggc agcggagtat 14700
cggttgcatc ctgcgctgct ggacgcgtgc ttccagatcg tcggcagcct cttcgcccgc 14760
agtggcgagg cgacgccgtg ggtgcccgtg gagttgggct cgctgcggct cttgcagcgg 14820
ccttcggggg agctgtggtg ccatgcgcgc gtcgtgaacc atgggcacca aacccccgat 14880
cggcagggcg ccgacttttg ggtggtcgac agctcgggtg cagtggtcgc cgaagtttgc 14940
gggctcgtgg cgcagcggct tccgggaggg gtgcgccggc gcgaaga卿cgattggttc 15000
ctggagctcg agtgggaacc cgcagcggtc ggcacagcca aggtcaacgc gggccggtgg 15060
ctgctcctcg gcggcggcgg tgggctcggc gccgcgttgc gcgcgatgct ggaggccggc 15120
ggccatgccg tcgtgcatgc ggcagagaac aacacgagcg ctgccggcgt acgcgcgctc 15180
gggggtggcg 3gctcg3ccc agggctcggg gcgc卿gcg cattggacgc gccccggsgc 15300
tggaccgtgc鄉(xiāng)ccctggc cggcatgggc tttcgagacg ccccgcgatt gtggcttttg 15420
acccgcggcg cacaggccgt cggcgccggc gacgtctccg tgacacaggc accgctgctg 15480
gggctgggcc gcgtcatcgc catggagcac gcggatctgc gctgcgctcg ggtcgacctc 15540
gatccagccc ggcccgaggg ggagctcgct gccctgctgg ccgagctgct ggccgacgac 15600
gccgaagcgg aagtcgcgtt gcgcggtggc gagcgatgcg tcgctcggat cgtccgccgg 15660
cagcccgaga cccggccccg ggggaggatc gagagctgcg ttccgaccga cgtcaccatc 15720
cgcgcggaca gcacctacct tgtgaccggc ggtctgggtg ggctcggtct gagcgtggcc 15780
ggatggctgg ccgagcgcgg cgctggtcac ctggtgctgg tgggccgctc cggcgcggcg 15840
agcgtggagc aacgggcagc cgtcgcggcg ctcgaggccc gcggcgcgcg cgtcaccgtg 15900
gcgaaggcgg atgtcgccga tcgggcgcag ctcgagcgga tcctccgcga ggttaccacg 15960
tcggggatgc cgctgcgggg cgtcgtccat gcggccggca tcttggacga cgggctgctg 16020
atgcagcaga ctcccgcgcg gtttcgtaag gtgatggcgc ccaaggtcca gggggccttg 16080
gtagggctct tgggctcgcc gggccagggc aactacgccg cggccaacac gttcctcgac 16200
gctctggcgc accaccggag ggcgcagggg ctgccagcgt tgagcgtcga ctggggcctg 16260
ttcgcggagg tgggcatggc ggccgcgcag ga卿tcgcg gcgcgcggct ggtctcccgc 16320
ggaatgcgga gcctcacccc cgacgagggg ctgtccgctc tggcacggct gctcgaaagc 16380
ggccgcgctc aggtgggggt gatgccggtg aacccgcggc tgtgggtgga gctctacccc 16440
gcggcggcgt cttcgcgaat gttgtcgcgc ctggtgacgg cgcatcgcgc gagcgccggc 16500
gggccagccg gggacgggga cctgctccgc cgcctcgccg ctgccgagcc gagcgcgcgg 16560
agcgcgctcc tggagccgct cctccgcgcg cagatctcgc aggtgctgcg cctccccgag 16620
ggcaagatcg aggtggacgc cccgctcacg agcctgggca tgaactcgct gatggggctc 16680
acctatccca cggtggcggc gctgagcggg catctggcgc gggaggcatg cgaagccgct 16800
cctgtggagt caccgcacac caccgccgac tctgccgtcg agatcgagga gatgtcgcag 16860
gacgatctga cgcagttgat cgcagcaaaa ttcaaggcgc ttacatgaat gactactcgc 16920
gagcggctcg ctgggctcgc acaggcggag ctggaacgga ccgagccgat cgccatcgtc 17040
gacgcggagc gcgacgcggt ccagccgctc gacatgcgct gggcgctggt gggtgtcgct 17160
cccgtcgagg ccgtgccgca ctgggcgggg ctgctcaccg agccgataga ttgcttcgat 17220
ttgctggagg tcgcttggga ggggctcgag gacgccggta tcccgccccg gtccatcgac 17340
gggagccgca ccggtgtgtt cgtcggcgct ttcacggcgg actacgcgcg cacggtcgct 17400
cggctgccgc gcgaggagcg agacgcgtac agcgccaccg gcaacatgct cagcatcgcc 17460
gccggacggc tgtcgtacac gctggggttg cagggacctt gcctgaccgt cgacacggcg .17520
tgctcgtcat cgctggtggc gattcacctc gcctgccgca gcctgcgcgc aggagagagc 17580
gatctcgcgt tggcgggagg ggtcagcgcg ctcctctccc ccgacatgat ggaagccgcg 17640
gcgcgcacgc aagcgctgtc gcccgatggt cgttgccgga ccttcgatgc ttcggccaac 17700
gggttcgtcc gtggcgaggg ctgtggcctg gtcgtcctca aacggctctc cgacgcgcaa 17760
tcgaccgggt tgaccgcgcc caacgtgctg gctcaggaga cggtcttgcg cgaggcgctg 17880cggagcgccc acgtcgaagc tggggccgtc gattacgtcg agacccacgg aacagggacc 17940
tcgctgggcg atcccatcga ggtcgaggcg ctgcgggcga cggtggggcc ggcgcgctcc 18000
gacggcacac gctgcgtgct gggcgcggtg aagaccaaca tcggccatct cgaggccgcg 18060
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gcgaccgagc cggtgccgtg gccgcgcacg gaccgcccgc gcttcgcggg ggtgagctcg 18240
ttcgggatga gcggaacgaa cgcgcatgtg gtgctggaag aggcgccggc ggtggagctg 18300
tggcctgccg cgccggagcg ctcggcggag cttttggtgc tgtcgggcaa gagcgagggg 18360
gcgctcgatg cgcaggcggc gcggctgcgc gagcacctgg acatgcaccc ggagctcggg 18420
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acgccggcgg gggcggcgcg ctgcatcgcg agctcctcgc gcggcaagct ggcgttcctg 18600
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gcgttccggg aggcgttcga ccggtgcgtg gcgctgttcg accgggagct ggaccgcccg 18720
ctgcgcgagg tgatgtgggc ggaggcgggg agcgccgagt cgttgttgct cgaccagacg 18780
gcgttcaccc agcccgcgct cttcgcggtg gagtacgcgc tgacggcgct gtggcggtcg 18840
tggggcgtag agccggagct cctggttggg catagcatcg gggagctggt ggcggcgtgc 18900
gtggcggggg tgttctcgct gg卿atggg gtgaggctcg tggcggcgcg cgggcggctg 18960
atgcaggggc tctcggcggg cggcgcgatg gtgtcgctcg gagcgccgga ggcggaggtg 19020
gcggcggcgg tggcgccgca cgcggcgtcg gtgtcgatcg cggcggtcaa tgggccggag 19080
caggtggtga tcgcgggcgt ggagcaagcg gtgcaggcga tcgcggcggg gttcgcggcg 19140
cgcggcgcgc gcaccaagcg gctgcatgtc tcgcacgcgt tccactcgcc gctgatggaa 19200
ccgatgctgg aggagttcgg gcgggtggcg gcgtcggtga cgtaccggcg gccaagcgtt 19260
tgggtgcggc acgtgcggga ggcggtgcgc ttcgcggacg gggtgaaggc gctgcacgaa 19380
gccggcgcgg ggacgttcgt cgaagtgggc ccgaagccga cgctgctcgg gctgttgcca 19440
gcctgcctgc cggaggcgga gccgacgctg ctggcgtcgt tgcgcgccgg gcgcgaggag 19500
gctgcggggg tgctcgaggc gctgggc鄉(xiāng)ctgtgggccg ccggcggctc ggtcagctgg 19560
ccgggcgtct tccccacggc tgggcggcgg gtgccgctgc cgacctatcc gtggcagcgg 19620
cagcggtact ggatcgaggc gccggccgaa gggctcggag ccacggccgc cgatgcgctg 19680
gcgcagtggt tctaccgggt ggactggccc gagatgcctc gctcatccgt ggattcgcgg 19740
cgagcccggt ccggcgggtg gctggtgctg gccgaccggg gtggagtcgg ggaggcggcc 19800
gcggcggcgc tttcgtcgca gggatgttcg tgcgccgtgc tccatgcgcc cgccgaggcc 19860
tccgcggttg ccgagcaggt gacccaggcc ctcggtggcc gcaacgactg gcagggggtg 19920
ctgtacctgt ggggtctgga cgccgtcgtg gaggcggggg catcggccga agaggtcgcc 19980
aaagtcaccc atcttgccgc ggcgccggtg ctcgcgctga ttcaggcgct cggcacgggg 20040
gacgctgccc cctgtcaggc ggcgctgtgg ggtatgggcc gggtcgcggc gct卿gcat 20160
cccggctcct ggggcgggct cgtggacctg gatccggagg agagcccgac ggaggtcgag 20220
gccctggtgg ccgagctgct ttcgccggac gccgaggatc agctggcatt ccgccagggg 20280
cgccggcgcg cagcgcggct tgtggccgcc ccaccggagg gaaacgcagc gccggtgtcg 20340
ctgtctgcgg aggggeigUa cttggtgacg ggtgggctgg gcgcccttgg cctcctcgtt 20400
gcgcggtggt tggtggagcg cggggcgggg caccttgtgc tgatcagccg gcacggattg 20460
cccgaccgcg aggaatgggg ccg卿tcag ccgccagagg tgcgcgcgcg cattgcggcg 20520
atcgaggcgc tggaggcgca gggcgcgcgg gtcaccgtgg cggcggtcga cgtggccgat 20580
gccgaaggca tggcggcgct cttggcggcc gtcgagccgc cgctgcgggg ggtagtgcac 20640
gccgcgggtc tgctcgacga cgggctgctg gcccaccagg acgctggtcg gctcgcccgg 20700
ctggacctct tcgtactgtt ttcctcggcg tcgggcgtct tcggctcgat cggccagggc 20820
agctacgcgg caggcaatgc ctttttggac gcgctggcgg acctccgccg aacgcagggg 20880
ctcgccgccc tgagcatcgc ctggggcctg tgggcggagg gggggatggg ctcgcaggcg 20940
cagcgccggg aacacgaggc atcgggaatc tgggcgatgc cgacgagtcg ggccctggcg 21000
gcgatggaat ggctgctcgg tacgcgcgcg acgcagcgcg tggtcatcca gatggattgg 21060
gcccatgcgg gagcggcgcc gcgcgacgcg agccgaggcc gcttctggga tcggctggta 21120
tctgttgtgg agacccgctc ggcgctctac gagcttgtgc gcggcgtggt cgccggggtg 21240
tcggcgacgc tagcgttcga ccatccgacc gtggagcggc tggtggaata cttgctgagc 21420
caggcgctgg agctgcagga ccgcaccgac gtgcggagcg ttcggttgcc ggcgacagag 21480
tcctactggc agctgttgac cgagggcgtg gtggtcagca ccgaggtgcc ggccgaccgg 21600
tggaatgggg cagacgggcg cgtccccggc tcgggagagg cacagagaca gacctacgtg 21660
cccaggggtg gctttctgcg cgaggtggag acgttcgatg cggcgttctt ccacatctcg 21720
gtgggcgcgg gccccaacga atatgccgag cgggtgcagg aactcgccga tgaggcggcg 21900
gggctctaca gcggcaccgg caacatgctc agcgttgcgg cgggacggct atcatttttc 21960
ctgggcctgc acgggccgac cctggctgtg gatacggcgt gctcctcgtc gctggtggcg 22020
ctgcacctcg gctgccagag cttgcgacgg ggcgagtgcg accaagccct ggttggcggg 22080
cccggcgggc ggtgcaagac gttctcggcc gacgcggacg gctacgcgcg ggccgagggc 22200
tgcgccgtgg tggtgctcaa gcggctctcc gacgcgcagc gcgaccgcga ccccatcctg 22260
agcggccctg cccaggaggc gctgttacgc caggcgctgg cgcacgcagg ggtggttccg 22380
gccgacgtcg atttcgtgga atgccacggg accgggacgg cgctgggcga cccgatcgag 22440
gtgcgtgcgc tgagcgacgt gtacgggcaa gcccgccctg cggaccgacc gctgatcctg. 22500
ggagccgcca aggccaacct tgggcacatg gagcccgcgg cgggcctggc cggcttgctc 22560
aaggcggtgc tcgcgctggg gcaagagcaa ataccagccc agccggagct gggcgagctc 22620
aacccgctct tgccgtggga ggcgctgccg gtggcggtgg cccgcgcagc ggtgccgtgg 22680
ccgcgcacgg accgcccgcg cttcgcgggg gtgagctcgt tcgggatgag cggaacgaac 22740
gcgcatgtgg tgctggaaga ggcgccggcg gtggagctgt ggcctgccgc gccggagcgc 22800
tcggcggagc ttUggtgct gtcgggcaag agcgaggggg cgctcgatgc gcaggcggcg 22860
cggctgcgcg agcacctgga catgcacccg gagctcgggc tcggggacgt ggcgttcagc 22920
ctggcgacga cgcgcagcgc gatgaaccac cggctcgcgg tggcggtgac gtcgcgcgag 22980
gggctgctgg cggcgctttc ggccgtggcg caggggc卿cgccgccggg ggcggcgcgc 23040
tgcatcgcga gctcgtcgcg cggcaagctg gcgttcctgt tcaccggaca gggcgcgcag 23100
acgccgggca tgggccgggg gctttgcgcg gcgtggccag cgttccggga ggcgttcgac 23160
cggtgcgtgg cgctgttcga ccgggagctg gaccgcccgc tgcgcgaggt gatgtgggcg 23220
gagccgggga gcgccgagtc gttgttgctc gaccagacgg cgttcaccca gcccgcgctc 23280
ttcacggtgg agtacgcgct gacggcgctg tggcggtcgt ggggcgtaga gccggagctg 23340
gtggctgggc atagcgccgg ggagctggtg gcggcgtgcg tggcgggggt gttctcgctg 23400
gaagatgggg tgaggctcgt ggcggcgcgc gggcggctga tgcaggggct ctcggcgggc 23460
ggcgcgatgg tgtcgctcgg agcgccggag gcggaggtgg cggcggcggt ggcgccgcac 23520
gcggcgtcgg tgtcgatcgc ggcggtcaat gggccggagc aggtggtgat cgcgggcgtg 23580
gagcaagcgg tgcaggcgat cgcggcgggg ttcgcggcgc gcggcgcgcg caccaagcgg 23640
ctgcatgtct cgcacgcgtc ccactcgccg ctgatggaac cgatgctgga ggagttcggg 23700
cgggtggcgg cgtcggtgac gtaccggcgg ccaagcgttt cgctggtgag caacctgagc 23760
gggaaggtgg tcgcggacga gctgagcgcg ccggggtact gggtgcggca cgtgcgggag 23820
gcggtgcgct tcgcggacgg ggtgaaggcg ctgcacgaag ccggtgcggg cacgttcgtc 23880
gaagtgggcc cgaagccgac gctgctcggg ctgttgccag cctgcctgcc ggaggcggag 23940
ccgacgctgc tggcgtcgtt gcgcgccggg cgcgaggagg ctgcgggggt gctcgaggcg 24000
ctgggcaggc tgtgggccgc cggcggctcg gtcagctggc cgggcgtctt ccccacggct 24060
gggcggcggg tgccgctgcc gacctatccg tggcagcggc agcggtactg gcccgacatc 24120
gactggccgg agatacctcg cagcctccag aaatcagagg aggcgagccg cgggagctgg 24240
ctggtattgg cggataaggg tggagtcggc gaggcggtcg ctgcagcgct gtcgacacgt 24300
ggacttccat gcgtcgtgct ccatgcgccg gcagagacat ccgcgaccgc cgagctggtg 24360
gcgttatggg gcatgggccg ggtggcggcg ctcgagcatc ccggggcctg gggcgggctc 24660
gtggacctgg atccccgagc gagcccgccc caagccagcc cgatcgacgg cgagatgctc 24720
cacgcggcac ggctggtggc cgccccgcca caggggcaag cggcaccggt gtcgctgtct 24840
gcggaggcga gctacctggt gacggg鄉(xiāng)c ctcggtgggc tgggcctgat cgtggcccag 24900
tggctggtgg agctgggagc gcggcacttg gtgctgacca gccggcgcgg gttgcccgac 24960
cggcaggcgt ggtgcgagca gcagccgcct gagatccgcg cgcggatcgc agcggtcgag 25020
gcgctggagg cgcggggtgc acgggtgacc gtggcagcgg tggacgtggc cgacgtcgaa 25080
ggcgtcagcg tcatgcgtcc actggcggag acggacgaga ccctgctcga gtcggtgctc 25200
ctgttcgtgc tgttctcgtc gggcgcagcg gtgtggggta gccatagcca gggtgcgtac 25320
gcgttgagcg tcgcgtgggg tctgtgggcc gagggaggca tggcggacgc gg鄉(xiāng)ctcat 25440
gcacgtctga gcgacatcgg ggttctgccc atgtcgacgt cggcagcgtt gtcggcgctc 25500
gttgcggaag cccgcgtggc tctgcacgag atcgtccatg gggccgtcgc tcgggtgctg 25740
acgacgctgg cctttgatca tccgacggta cagcggctgg tggagcatct gctcgtcgat 25920
gtactgaagc tggaggatcg cagcgacacc cagcatgttc ggtcgttggc gtcagacgag 25980
cccatcgcca tcgtgggagc cgcctgccgc ttcccgggcg gggtggagga cctggagtcc 26040
tactggcagc tattggccga gggcgtggtg gtcagcgccg aggtgccggc cgaccggtgg 26100
gatgcggcgg actggtacga ccctgatccg gagatcccag gccggactta cgtgaccaaa 26160
ggcgccttcc tgcgcgattt gcagagattg gatgcgacct tcttccgcat ctcgcctcgc 26220
gaggcgatga gcctcgaccc gcagcagcgg ttgctcctgg aggtaagctg ggaagcgctc 26280
g卿gcgcgg gtatcgctcc ggatacgctg cgagatagcc ccaccggggt gttcgtgggt 26340
gcggggccca atgagtacta cacgcagcgg ctgcgaggct tcaccgacgg agcggcaggg 26400
ttgtacggcg gcaccgggaa catgctcagc gttacggctg gacggctgtc gtttttcctg 26460
ggtctgcacg gcccgacgct ggccatggat acggcgtgct cgtcatccct ggtcgcgctg 26520
cacctcgcct gccagagcct gcgactgggc gagtgcgatc aagcgctggt tggcggggtc 26580
gacgggcggt gca卿cgtt ctcggccgac gcggacggct acgcgcgggg cgaggggtgc 26700
gccgtggtgg tgctcaagcg gctgcgcgat gcgcagcgcg ccggcgactc catcctggcg 26760
ctgatccggg gaagcgcggt gaaccacgac ggcccgagca gcgggctgac cgtacccaac 26820
ggacccgccc agcaagcatt gctgcgccag gcgctttcgc aagcaggcgt gtctccggtc 26880
gacgttgatt ttgtggagtg tcacgggaca gggacggcgc tgggcgaccc gatcgaggtg 26940
caggcgctga gcgaggtgta tggtccaggg cgctccgggg accgaccgct ggtgctgggg 27000
gccgccaagg ccaacgtcgc gcatctggag gcggcatctg gcttggccag cctgctcaag 27060
gccgtgcttg cgctgcggca cgagcagatc ccggcccagc cggagctggg ggagctcaac 27120
ccgcacttgc cgtggaacac gctgccggtg gcggtgccac gtaaggcggt gccgtggggg 27180
cgcggcgcac gcccgcgtcg ggccggcgtg agcgcgttcg ggttgagcgg aaccaacgtg 27240
catgtcgtgc tggaggaggc accggaggtg gagccggcgc ccgcggcgcc ggcgcgaccg 27300
gtggagctgg tcgtgctatc ggcca卿gc gcggcggcgc tggacgccgc ggcggcacgg 27360
ctctcggcgc acctgtccgc gcacccggag ctgagcctcg gcgacgtggc gttcagcctg 27420
gcgacgacgc gcagcccgat ggagcaccgg ctcgccatcg cgacgacctc gcgcgaggcc 27480
ctgcg郷cg cgctggacgc cgcggcgcag c犯卿acgc cgcagggcgc ggtgcgcggc 27540
ccgggcatgg gccgtgggct gtacga犯cg tggcctgcgt tccgggaggc gttcgaccgg 27,
tgcgtggcgc tcttcgatcg gg卿tcgac cagcctctgc gcgaggtgat gtgggctgcg 27720
ccgggcctcg ctcaggcggc gcggctcgat cagaccgcgt acgcgcagcc ggctctcttt 27780
gatgcggtga ggttggtggc cgcgcgcggg cggctgatgc aggcgctacc cgccggcggt 27960
gccatggtag ccatcgcagc gtccgaggcc gaggtggccg cctccgtggc gccccacgcc 28020
gccacggtgt cgatcgccgc ggtcaacggt cctgacgccg tcgtgatcgc cggcgccgag 28080
gtacaggtgc tcgccctcgg cgcgacgttc gcggcgcgtg ggatacgcac gaagaggctc 28140
cacgtcgcag gccccgagat cgccacgccc gagtattggg tccggcatgt gcgaagcgcc 28320
gtcctcgtgc cgtcgctacg cgcggaccgc tcggaatgcg aggtggtcct cgcggcgctc 28500
ggggcttggt atgcctgggg gggtgcgctc gactgg犯gg gcgtgttccc cgatggcgcg 28560
ccgcgaagcg ccgcgcctgc agggatcgca ggtcgctggc cgctggctgg tgtcgggctc 28680
tgcatgcccg gcgctgtgtt gcaccacgtg ctctcgatcg gaccacgcca tcagcccttc 28740
atcct,cagca t,cgccgccga. gcgctggccc gagcgggcga tcgagctgac aggcgtgggig 28860
ttcctgaagg ccatcgcgat ggagcccgac caggaggtcg agctccacgc cgtgctcacc 28920
cccgaagccg ccggggatgg ctacctgttc gagctggcga ccctggcggc gccggagacc 28980
gaacgccgat ggacgaccca cgcccgcggt cgggtgcagc cgacagacgg cgcgcccggc 29040
gcgttgccgc gcctcgaggt gctggaggac cgcgcgatcc agcccctcga cttcgccgga 29100
ttcctcgaca ggttatcggc ggtgcggatc ggctggggtc cgctttggcg atggctgcag 29160
gacgggcgcg tcggcgacga ggcctcgctt gccaccctcg tgccgaccta tccgaacgcc 29220
cacgacgtgg cgcccttgca cccgatcctg ctggacaacg gctttgcggt gagcctgctg 29280
tcaacccgga gcgagccgga ggacgacggg acgcccccgc tgccgttcgc cgtggaacgg 29340
gtgcggtggt ggcgggcgcc ggUgg卿g gtgcggtgtg gcggcgtgcc gcggtcgcag 29400
gcattcggtg tctcgagctt cgtgctggtc gacga認(rèn)tg gcg鄉(xiāng)tggt cgccgaggtg 29460
gagggatttg tttgccgccg ggcgccgcga gaggtgttcc tgcggcagga gtcgggcgcg 29520
tcgactgcag ccttgtaccg cctcgactgg cccgaagcgc ccttgcccga tgcgcctgcg 29580
gaacggatcg agg卿gctg ggtcgtggtg gcagcacctg gctcgg卿t ggccgcggcg 29640
ctcgcaacac ggctcaaccg ctgcgtcctc gccgaaccca aaggcctcga ggcggccctc 29700
gcgggggtgt ctcccgcagg tgtgatctgc ctctgggagg ctggagccca cg鄉(xiāng)aagct 29760
ccggcggcgg cgcagcgtgt ggcgaccgag ggcctctcgg tggtgcaggc gctcagggac 29820
cgcgcggtgc gcctgtggtg ggtgaccatg ggcgcagtgg ccgtcgaggc cggtgagcgg 29880
gtgcaggtcg ccacagcgcc ggtatggggc ctcggccgga cagtgatgca ggagcgcccg 29940
gagctcagct gcactctggt ggatttggag ccggaggccg atgcagcgcg ctcagctgac 30000
gttctgttgc gggagctcgg tcgcgctgac gacgagacac aggtggcttt ccgttccgga 30060
aagcgccgcg tagcgcggct ggtcaaagcg acgacccccg aagggctcct ggtccctgac 30120
gcagagtcct atcgactgga ggctgggcag aagggcacat tggaccagct ccgcctcgcg 30180
ccggcacagc gccgggcacc tggcccgggc gaggtcgaga tcaaggt犯c cgcctcgggg 30240
ctcaacttcc ggaccgtcct cgctgtgctg ggaatgtatc cgggcgacgc cgggccgatg 30300
ggcgg卿tt gtgccggtgt cgccacggcg gtgggccagg gggtgcgcca cgtcgcggtc 30360
ggcgatgctg tcatgacgct ggggacgttg catcgattcg tcacggtcga cgcgcggctg 30420
ctgacggcct ggctcgctct gcacgacctg gggaatctgc ggcgcggcga gcgggtgctg 30540
atccatgctg cggccggcgg tgtgggcatg gccgcggtgc aaatcgcccg atggataggg 30600
gccgaggtgt tcgccacggc gagcccgtcc aagtgggcag.cggttcaggc catgggcgtg 30660
ccgcgcacgc acatcgccag ctcgcggacg ctggagtttg ctgagacgtt ccggcaggtc 30720
accggcggcc ggggcgtgga cgtggtgctc aacgcgctgg ccggcgagtt cgtggacgcg 30780
agcctgtccc tgctgtcgac gggcgggcgg ttcctcgaga tgggcaagac cgacatacgg 30840
gagctcgctc cggatcgaac tcgagagatc ctcgagcgcg tggtcgaggg ctttgctgcg 30960
cacgtggccc gctggctcgc ccagc鄉(xiāng)gc gtgccgcaca tggtgctcac aggtcggcgg 31200
gtgacgatcg cggcgtcgga tgtcgccgat cggaatgcgc tggaggctgt gctccaggcc 31320
gcctggaatc tgcatgagct cacggcgggc aacgatctcg ctttcttcgt gctgttctcc 31500
tccatgtcgg ggctcttggg ctcggccggg cagtccaact atgcggcggc caacaccttc 31560
ggcccatggt cggacggagg catggcagcg gggctcagcg cggcgctgca ggcgcggctc 31680
gctcggcatg ggatgggagc tctgtcgccg gctcagggca ccgcgctgct cgggcaggcg 31740
ctggctcggc cggaaacgca gctcggggcg atgtcgctcg acgtgcgtgc ggcaagccaa 31800
gcttcgggag cggcagtgcc gcctgtgtgg cgcgcgttgg tgcgcgcgga ggcgcgccat 31860
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gccgcgagcg ccgtgcccgt cgatcggccg ctgtcggact tgggcctcga ctcgctcacg 32040
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gtggccgagc cgagcgtatc gtccgcaaag tcgtcgccgc aggtcgccct cgacgagccc 32220
attgccatca tcggcatcgg ctgccgtttc ccaggcggcg tggccgatcc ggagtcgttt 32280
tggcggctgc tcga卿ggg cagcgatgcc gtcgtcgagg tgccgcatga gcgatgggac 32340
atcgacgcgt tctatgatcc ggatccggat gtgcgcggca agatgacgac acgctttggc 32400
ggcttcctgt ccgatatcga ccggttcgat ccggccttct tcggcatctc gccgcgcgaa 32460
gcgacgacca tggatccgca gcagcggctg ctcctgg卿cgagctggga ggcgttcgag 32520
cgcgccggga ttttgcccga gcggctgatg ggcagcgata.ccggcgtgtt cgtggggctc 32580
ttctaccagg agtacgctgc gctcgccggc ggcatcgagg cgttcgatgg ctatctaggc 32640
accggcacca cggccagcgt cgcctcgggc aggatctctt atgtgctcgg gctaaagggg 32700
ccgagcctga cggtggacac cgcgtgctcc tcgtcgctgg tcgcggtgca cctggcctgc 32760
caggcgctgc ggcggggcga gtgttcggtg gcgctggccg gcggcgtggc gctgatgctc 32820
acgccggcga cgttcgtgga gttcagccgg ctgcgaggcc tggctcccga cggacggtgc .32880
aagagcttct cggccgcagc cgacggcgtg gggtggagcg aaggctgcgc catgctcctg 32940
accgcggtga accaggatgg gcgcagcaac gggctgetcgg cgcccaacgg gtcgtcgcag 33060
caagaggtga tccgtcgggc cctggagcag gcggggctgg ctccggcgga cgtcagctac 33120
gtcgagtgcc acggcaccgg cacgacgttg ggcgacccca tcgaagtgca ggccctgggc 33180
aatatcggac atacgc鄉(xiāng)c tgcggcgggc gtggccggtg tcatcaaggt ggcgctggcg 33300
ctcgagcgcg ggcttatccc gaggagcctg catttcgacg cgcccaatcc gcacattccg 33360
tggtcggagc tcgccgtgca ggtggccgcc aaacccgtcg aatggacgag aaacggcgtg 33420
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gaggaggcgc cagcggcggc gttcgcgccc gcggcggcgc gttcagcgga gcttttcgtg 33540
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gttgcgcacc cggagctcgg cctcggcgac ctggcgttca gcctggcgac gacccgcagc 33660
ccgatgacgt accggctcgc ggtggcggcg acctcgcgcg aggcgctgtc tgccgcgctc 33720
gacacagcgg cgcaggggca ggcgccgccc gcagcggctc gcggccacgc ttccacaggc 33780
agcgccccaa aggtggtttt cgtctttcct ggccagggct cccagtggct gggcatgggc 33840
caaaagctcc tctcggagga gcccgtcttc cgcgacgcgc tctcggcgtg tgaccgagcg 33900
attcaggccg aagccggctg gtcgctgctc gccgagctcg cggccgatga gaccacctcg 33960
cagctcggcc gcatcgacgt ggtgcagccg gcgctgttcg cgatcgaggt cgcgctgtcg 34020
gcgctgtggc ggtcgtgggg cgtcgagccg gatgcagtgg taggccacag catgggcgaa 34080
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agcaacagcc cgcgctcgac ggtgctggcg ggcgagccgg cagcgctcgc agaggtgctg 34320
gcgatccttg cggcaaaggg ggtgttctgc cgtcgagtca aggtggacgt cgccagccac 34380
agcccacaga tcgacccgct gcgcgacgag ctattggcag cattgggcga gctcgagccg 34440
cgacaagcga ccgtgtcgat gcgctcgacg gtgacgagca cgatcatggc gggcccggag 34500
ctcgtggcga gctactgggc ggacaacgtt cgacagccgg tgcgcttcgc cgaagcggtg 34560
acgacatcgg tcg郷卿t ccgacgggcg acgaagcggg agggagtcgc ggtgggctcg 34680
ttgcggcgtg gac鄉(xiāng)acga gcgcctgtcc atgttggagg cgctgggagc gctctgggta 34740
cacggccagg cggtgggctg ggagcggctg ttctccgcgg gcggcgcggg cctccgtcgc 34800
gtgccgctgc cgacctatcc ctggcagcgc gagcggtact' gggtcgatgc gccgaccggc 34860
ggcgcggcgg gcggcagccg ctttgctcat gcgggcagtc acccgctcct gggtgaaatg 34920
cagaccctgt cgacccagag gagcacgcgc gtgtgggaga cgacgctgga tctcaaacgg 34980
ctgccgtggc tcggcgatca ccgggtgcag ggggcggtcg tgttcccggg cgcggcgtac 35040
ctggagatgg cgctttcgtc cggggccgag gccttgggtg acggtccgct ccaggtcagc 35100
gatgtggtgc tcgccgaggc gctggccttc gcggatgata cgccggcggc ggtgcaggtc '35160
atggcgaccg aggagcgacc aggccgcctg caattccacg ttgcgagccg ggtgccgggc 35220
cacggcggtg ctgcctttcg aagccatgcc cgcggggtgc tgcgccagat cgagcgcgcc 35280
gaggtcccgg cgaggctgga tctggccgcg cttcgtgccc ggcttcaggc cagcgcaccc 35340
gctgcggcta cctatgcggc gctggccgag atggggctcg agtacggccc agcgttccag 35400
gggcttgtcg agctgtggcg gggggagggc gaggcgctgg gacgtgtgcg gctccccgag 35460
gccgccggct ccccagccgc gtgccggctc caccccgcgc tcttggatgc gtgcttccac 35520
gtgagcagcg ccttcgctga ccgcggcgag gcgacgccat gggtacccgt ggaaatcggc 35580
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cacggaaagc caacacccga ccggcggagt accgacttct gggtggtcga cagcacgggc 35700
gcgatcgtcg ccgagatctc cgggctcgtg gcgcagcggc tcgcgggagg tgtacgccgg 35760
cgcgaagaag acgactggtt catggagccg gcttgggaac cgaccgcggt ccccggatcc 35820
gaggtcatgg cgggccggtg gctgctcatc ggctcgggcggcgggctcgg cgctgcgctc 35880
cactcggcgc tgacggaagc tggccattcc gtcgtccacg cgacagggcg cggcacgagc 35940
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gatgcgcttg aggagtcgct ggtgcgcggc tgcgacagcg tgctctggac cgtgcaggcc 36120
gtggccgggg cgggcttccg agatcctccg cggttgtggc tcgtgacacg cggcgctcag 36180
gccatcggcg ccggcgacgt ctctgtggcg caagcgccgc tcctggggct gggccgcgtt 36240
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gacggagaag tcgatgagct gcttgccgag ctgttggccg acgacgccga ggaggaagtc 36360
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gctggtacac cgg卿agcg ggcgtggctg cgcgagcagg ggatcgcgca cgtgatggac 37020
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tc鄉(xiāng)gctcg cagtgggtgg gcatgggccg aaagctcatg gccgaagagc cggtcttccg 40440
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gcccga聊t cgtcagttga Uctgg卿a gcacttgagc gagctgttgg ggcgggggct 49740
gctgataggc ctggagctcc gcaaccgcat cgaggccgcg ctcggcatca ccgtgccggc 49860
gaccctgcta tggacctacc ctaacgtagc agctctgagc gggagcttgc tagacattct 49920
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atggcaccca atgtgctcgc tcaggaggcg ctcttgcgcg aggcgctgca gagcgctcgc 51060
gtcgacgccg gggccatcgg ttatgtcgag acccacggaa cggggacctc gctcggcgac 51120
ccgatcgagg tcgaggcgct gcgtgccgtg ttggggccgg cgcgggccga tgggagccgc 51180
tgcgtgctgg gcgcagtgaa gacaaacctc ggccacctgg agggcgctgc aggcgtggcg 51240
ggtttgatca aggcggcgct ggctctgcac cacgaactga tcccgcgaaa cctccatttc 51300
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ggcaccaacg tccatgtcgt gctggaggag gcgccggcca cggtgctcgc accggcgacg 51480
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gcggcgcgcg gcagggccgc ttcctcgccc ggcaagctcg ccttcctgtt cgccgggcag 51780
ggcgcgcagg tgccgggcat gggccgtggg ttgtgggagg cgtggccggc gttccgcgag 51840
accttcgacc ggtgcgtcac gctcttcgac cgggagctcc atcagccgct ctgcgaggtg 51900
atgtgggccg agccgggcag cagcaggtcg tcgttgctgg accagacggc gttcacccag 51%0
ccggcgctct ttgcgctgga gtacgcgctg gccgcgctct tccggtcgtg gggcgtggag 52020
ccggagctcg tcgctggcca tagcctxggc gagctggtgg ccgcctgcgt ggcgggtgtg 52080
ccggccggcg gcgcgatggt atcgatcgcc gcgccggagg ccgacgtggc tgccgcggtg 52200
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accaaaccgc tgcatgtctc gcacgcgttc cactcgccgc tcatggatcc gatgctggag 52380
gcgttccggc gggtgactga gtcggtgacg taccggcggc cttcgatcgc gctggtgagc 52440
aacctgagcg ggaagccctg caccgatgag gtgagcgcgc cgggttactg ggtgcgtcac 52500
gcgcg卿gg cggtgcgctt cgcggacgga gtgaaggcgc tgcacgcggc cggtgcgggc 52560
ctcttcgtcg aggtggggcc gaagccgacg ctgctcggcc ttgtgccggc ctgcctgccg 52620
gatgccaggc cggtgctgct cccagcgtcg cgcgccgggc gtgacgaggc tgcgagcgcg 52680
atcgaagcgc cggtcgatcg tgaggcggac ggcaccggcc gtgctcgggc ggggggccac 52860
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tttcctggcg ccgggtacct ggagatggcg ctgtcgtcgg gggccgagat cttgggcgat 53040
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tacggcccgg cgttgcgggg gctcgccgag ctgtggcggg gtgagggcga ggcgctgggc 53400
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gagttgatgg acggtacggg cgcggtggtc gccgagatct cccggctggt ggtggagcgg :53700
cttgcgagcg gtgtacgccg gcgcgacgca gacgactggt tcctggagct ggattgggag 53760
cccgcggcgc tcggtgggcc ca卿tcaca gccggccggt ggctgctgct cggcgagggt 53820
ggtgggctcg ggcgctcgU gtgctcggcg ctgaaggccg ccggccatgt cgtcgtccac 53880
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ccggggctcg gggcgcaggg cgcgctcgac gcgccccgga gcccagatgt cgatgccgat 54060
gccctcgaat cggcgctgat gcgtggttgc gacagcgtgc tctccctggt gcaagcgctg 54120
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g鄉(xiāng)ccggtg gtgtcggtct ttgcgcggtg cgatgggcgc agcgcgtggg cgccgaggtg 54960
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ctgcgcgcct gtggtcgcct tgtgaagctg ggcaggcgcg acgactgcgc cgacacgcag 55200
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acgcagcgcg cggtcgctga tcggaccgcc ggggatcggg acctgctcga acagcttgcg 56340
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gcgcctggta agaagtacgt ccaagaggcg gcctcgctga ttcagcacta tgcagacgcQ 56880
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gacgttcagg atctacaatc tcgcaccacg gagcgcttct atatgcatct ccttcccgga 57300
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gagcaagcga atcagagtga gacgaeigcct gctttcgact tcaagccgtt cgcgcctggg 57600
tacgcggagg acccgttccc cgcgatcgag cgcctgagag aggcaacccc catcttctac 57660
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gcgttcgctg tgctcaacct gctgcggtcg cccgaggcgc tcgagctggt gaaggccgag 58380ggaactgtgc gtttcgccag gcaggacctg gagtactgcg gggcatcgat caaga犯ggg 58500
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aaaggcttgg ccat 6067權(quán)利要求
1.一種抗腫瘤藥物埃博霉素全長基因簇的表達(dá)體系，其特征在于該表達(dá)體系包括使用Red/ET重組技術(shù)，引入接合元件和可誘導(dǎo)的啟動子p15A，將埃博霉素的基因簇epoA，epoB，epoC，epoD，epoE，epoF和epoK完整的縫合而構(gòu)建的帶有全長埃博霉素基因簇的重組表達(dá)質(zhì)粒p15A-IR-neo-epo-IR-Tpase-BSD-oriT和轉(zhuǎn)入的并使其高效表達(dá)的異質(zhì)宿主菌-惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)KT2440和黃色粘球菌(Myxococcus xanthus)1622。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤藥物埃博霉素全長基因簇的表達(dá)體系。本發(fā)明使用Red/ET重組工程技術(shù)將埃博霉素的基因簇組合在一起，形成全長的埃博霉素基因簇，并轉(zhuǎn)化到新的異質(zhì)宿主菌中，使之能高效表達(dá)，從而解決了規(guī)模生產(chǎn)抗腫瘤藥物埃博霉素中的技術(shù)難題。
文檔編號C12N15/09GK101173268SQ20071003590
公開日2008年5月7日 申請日期2007年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月16日
發(fā)明者丁學(xué)知, 夏立秋, 孫運(yùn)軍, 張友明 申請人:湖南師范大學(xué)