專利名稱：：冠心病檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地涉及對(duì)氧磷酶3(Paraoxonase3，P0N3)的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)及其與動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病的相關(guān)性。本發(fā)明還涉及檢測(cè)這些SNP的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
：動(dòng)脈粥樣硬化是一種常見(jiàn)的進(jìn)行性動(dòng)脈疾病，病變主要累及中等大小的肌層動(dòng)脈，動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積，平滑肌細(xì)胞增生，形成局限性斑塊，可使動(dòng)脈壁變硬，嚴(yán)重時(shí)斑塊破裂導(dǎo)致血栓、栓塞、出血，受累管腔部分或完全閉塞，臨床表現(xiàn)為動(dòng)脈粥樣硬化血管并發(fā)癥的發(fā)生，老年患者中最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的血管并發(fā)癥是動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病(不穩(wěn)定性心絞痛和心肌梗塞)和腦卒中。動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生和發(fā)展主要經(jīng)歷了四個(gè)循序漸進(jìn)的病理過(guò)程1.脂質(zhì)浸潤(rùn)前期內(nèi)膜改變內(nèi)皮損傷2.脂質(zhì)條紋泡沫細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞聚集，平滑肌細(xì)胞增生。3.纖維斑塊平滑肌纖維化，形成纖維帽。4.復(fù)合病變斑塊鈣化、破裂、潰瘍，中膜病變。動(dòng)脈粥樣硬化的病因及發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，是動(dòng)脈壁的細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)、血液成分(特別是單核細(xì)胞、血小板和LDL)、局部血流動(dòng)力學(xué)、環(huán)境及遺傳因素之間一系列復(fù)雜作用的結(jié)果，因而病因并非是單一因素的。動(dòng)脈粥樣硬化作為多基因疾病，發(fā)病原因不僅涉及到多個(gè)作用不同的基因，而且還涉及到基因-基因、基因-環(huán)境的相互作用?，F(xiàn)在關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)理的學(xué)說(shuō)有很多，如滲入脂質(zhì)學(xué)說(shuō)、血管內(nèi)膜損傷學(xué)說(shuō)、炎癥反應(yīng)學(xué)說(shuō)、氧化-抗氧化學(xué)說(shuō)及血栓形成學(xué)說(shuō)。所有這些學(xué)說(shuō)都涉及到不同的生物通路，但是現(xiàn)在還沒(méi)有一種學(xué)說(shuō)能夠在遺傳學(xué)和分子生物學(xué)上得到完整的解釋。多年來(lái)，基于對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化致病危險(xiǎn)因素的長(zhǎng)期研究，科學(xué)家們針對(duì)這些危險(xiǎn)因素開(kāi)展了大量的工作。目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了血管緊張素I轉(zhuǎn)化酶(ACE)和MTHFR的某些插入、缺失和突變可能使動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病致病的潛在危險(xiǎn)因素。前者使血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要功能的酶類之一，后者是一種與半胱氨酸代謝有關(guān)的酶。另外，德國(guó)科學(xué)家最近證實(shí)，AT1受體的表達(dá)水平與血管受損過(guò)程緊密聯(lián)系A(chǔ)CE抑制劑會(huì)減少AT1受體的激活，從而改善血管功能不良、有效的抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。但長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究較多地集中于脂質(zhì)代謝通路中相關(guān)基因的突變及表達(dá)，如副氧酶、脂蛋白脂肪酶、肝脂肪酶等。在對(duì)內(nèi)源性一氧化氮合成酶(eNOS)的研究中，現(xiàn)在已有一些研究工作表明eNOS與動(dòng)脈粥樣硬化的緊密關(guān)聯(lián)。另有美國(guó)科學(xué)家提出了炎癥機(jī)制在動(dòng)脈粥樣硬化的形成中的作用，并在小鼠試驗(yàn)中得到了一定的證實(shí)。近年來(lái)，單核苷酸多態(tài)性(SNP)和單倍型(haplotype)概念在多基因疾病研究中的廣泛運(yùn)用，為在分子水平上研究動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制開(kāi)辟了全新的思路。同時(shí)，高通量、低成本的SNP檢測(cè)手段的不斷出現(xiàn)也為SNP大規(guī)?？焖俜中吞峁┝丝赡?。曰本科學(xué)家利用大規(guī)模的病例-對(duì)照研究對(duì)9萬(wàn)多個(gè)相關(guān)基因SNPs進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)50KB的單倍型區(qū)域與心肌梗死密切相關(guān)，其中包括LTA(lymphotoxin-oc)，NFKBIL1和BAT1等的多個(gè)SNP位點(diǎn)。在另一研究中，雖然P-選擇素(P-selectin)中S290N和N562D各自與心肌梗塞都沒(méi)有獨(dú)立相關(guān)性，但它們構(gòu)成的單倍型卻與心肌梗塞顯著相關(guān)。此外，SNP的存在與否以及等位基因頻率存在人種及地域的差異，這就提示多基因疾病遺傳異質(zhì)性的存在，即同一疾病或性狀在不同的人群中可能是不同的遺傳因素造成的。在對(duì)凝血因子V基因的研究中，中國(guó)人群中未能發(fā)現(xiàn)國(guó)外報(bào)道的與白人女性心肌梗塞發(fā)病具有相關(guān)性的VLeiden突變，卻發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的SNP-G/A1628(Arg485Lys)突變與APCR及動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病相關(guān)，凝血因子V基因可能是中國(guó)人群動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)易感基因。另外，不同人群中SNP及其單倍型的類型和頻率存在的這種差異可能與不同人群對(duì)藥物及環(huán)境因素的反應(yīng)性不同密切相關(guān)。在過(guò)去的50多年來(lái)，大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)査和遺傳研究己經(jīng)對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化這一復(fù)雜疾病做了一系列的研究，發(fā)現(xiàn)了一些易感基因與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)，例如ABCA1、CYBA、ApoE、LDLR等。更多的與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)繼續(xù)在發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證中。動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病作為一種由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用而發(fā)病的多基因病，尋找其相關(guān)基因進(jìn)而闡明動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病發(fā)病的遺傳機(jī)制己經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)。雖然已有許多關(guān)于各種基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病的研究，但沒(méi)有證實(shí)P0N3基因與動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病相關(guān)性的報(bào)道，更沒(méi)有證實(shí)P0N3基因的SNP與動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病相關(guān)性的報(bào)道。綜上所述，為了盡早診斷動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病，本領(lǐng)域迫切需要尋找動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病易感基因，并開(kāi)發(fā)檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病的方法和試劑盒。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供一種輔助診斷(尤其是早期診斷)動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病的方法及檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的另一目的是提供一種新的治療動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種對(duì)個(gè)體的動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病易感性進(jìn)行診斷的方法，它包括步驟檢測(cè)該個(gè)體的P0N3基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的P0N3基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，存在差異就表明該個(gè)體患動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病的可能性高于正常人群。在另一優(yōu)選例中，所述的方法中檢測(cè)的是P0N3的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常P0N3核苷酸序列比較差異。在另一優(yōu)選例中，所述的差異是以下的單核苷酸多態(tài)性301位A—G;其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQIDN0:1。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測(cè)樣品是否存在對(duì)氧磷酶3(P0N3)的單核苷酸多態(tài)性的方法，包括步驟(a)用P0N3基因特異性引物擴(kuò)增樣品的P0N3基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；禾口(b)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性301位A—G;其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQIDN0:1。在另一優(yōu)選例中，所述的基因特異性引物具有SEQIDN0:2和3的序列。在另一優(yōu)選例中，所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為100-2000bp，且含有SEQIDN0:l中第301位。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病的試劑盒，它包括特異性擴(kuò)增P0N3基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，更佳地，所述的引物擴(kuò)增出長(zhǎng)度為100-2000bp，且含有SEQIDNO:1中第301位的擴(kuò)增產(chǎn)物。在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還含有選自下組的試劑(a)與SEQIDNO:1中第301位的突變結(jié)合的探針；(b)識(shí)別SEQIDN0:l中第301位的突變限制性內(nèi)切酶。在另一優(yōu)選例中，所述的突變選自以下單核苷酸多態(tài)性.-301位A—G;其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQIDN0:1。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入而廣泛的研究，對(duì)大量候選基因的SNP進(jìn)行了測(cè)定和分析。首次發(fā)現(xiàn)和證明了P0N3的基因組序列與動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病密切相關(guān)，其中關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在P0N3的SEQIDN0:1中第301位的SNP(301位A—G)(記為RS978903)在病例和對(duì)照組中的分布存在顯著性差異(代0.05)，因此可作為輔助性檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病(或其易感性)的特異性SNP。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。P0N3基因?qū)ρ趿酌?(Paraoxonase3，P0N3)的序列是己知，其詳細(xì)序列和一些相關(guān)信息可參見(jiàn)網(wǎng)址http:〃ww.ncbi.nlm.nih.gov/Genebank/;http:〃鼠ncbi.nlm.nih.gov/SNP。為了方便起見(jiàn)，在SEQIDNO:1給出P0N3中與本發(fā)明SNP相關(guān)的核苷酸序列。對(duì)氧磷酶也稱為旁羰化酶。P0N3基因?qū)儆趯?duì)氧磷酶的一種。對(duì)氧磷酶(paraoxonase，PON)是一類與高密度月旨蛋白(highdensitylipoprotein,肌)結(jié)合的芳香酯酶，它可降解有機(jī)磷酸酯、芳香羧酸酯及氨基甲酸酯等。對(duì)氧磷酶能部分水解脂質(zhì)過(guò)氧化物，保護(hù)低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein,LDL)免受氧化修飾，減少氧化型脂質(zhì)積聚，延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生(MacknessMIetal.Curr0pinLipidol，1998,9:319-324)。對(duì)氧磷酶基因多態(tài)性及其酶活性在高密度脂蛋白保護(hù)低密度脂蛋白免受氧化修飾和抗動(dòng)脈粥樣硬化/抗炎癥作用中具有重要意義，與冠心病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。P0N1基因的多態(tài)性已被大量證實(shí)與動(dòng)脈粥樣硬化，以及冠心病相關(guān)，它所能代謝的有機(jī)磷酸酯類別也十分廣泛。但一些大體積的藥物底物，如lovastatinandspironolactone,其代謝要專一依靠P0N3基因(DraganovDIetal.JLipidRes.2005;46(6):1239-47.)。本發(fā)明人對(duì)P0N3基因中的幾乎整個(gè)區(qū)域進(jìn)行了測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了許多SNP，其中大部分SNP與動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病易感性并不相關(guān)，然而關(guān)聯(lián)研究表明SEQIDN0:1中301位A—G卻是與動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病易感性關(guān)聯(lián)性非常高的SNP。具體而言，本發(fā)明揭示了P0N3基因第3號(hào)內(nèi)含子的單核苷酸多態(tài)性(SNP)以及該多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性。本發(fā)明的SNP是SEQIDNO:l所示序列的第301位的A/G多態(tài)，它位于人PON3基因的第3號(hào)內(nèi)含子，等位基因型G在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病人群中的頻率，要高于在正常對(duì)照人群中的頻率?；诒景l(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，P0N3蛋白或多肽有多方面的新用途。這些用途包括(但不限于)用于輔助性診斷動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病，或用于篩選促進(jìn)P0N3蛋白功能的物質(zhì)，如抗體、多肽或其它配體。另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人P0N3DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，"特異性"是指抗體能結(jié)合于人P0N3基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人P0N3基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人P0N3蛋白的分子，也包括那些并不影響人P0N3蛋白功能的抗體。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人P0N3基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人P0N3蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來(lái)免疫動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)抗體。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人P0N3蛋白功能的抗體以及不影響人P0N3蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人P0N3基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過(guò)常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人P0N3基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲(chóng)細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而獲得。抗人P0N3蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)活檢標(biāo)本中的人P0N3蛋白的多少和/或突變與否。一種優(yōu)選的抗PON3抗體是不識(shí)別正常PON3但識(shí)別突變P0N3的抗體，或者識(shí)別正常P0N3但不識(shí)別突變P0N3的抗體。利用這些抗體，可以方便地進(jìn)行蛋白質(zhì)水平的動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病易感性檢測(cè)。利用本發(fā)明P0N3蛋白，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與P0N3蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如抑制劑、激動(dòng)劑或拮抗劑等。本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)人P0N3蛋白水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括ELISA等。一種檢測(cè)檢測(cè)樣品中是否存在P0N3蛋白的方法是利用P0N3蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，它包括將樣品與P0N3蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在P0N3蛋白。P0N3蛋白的多聚核苷酸可用于P0N3蛋白相關(guān)疾病的輔助診斷。在診斷方面，P0N3蛋白的多聚核苷酸可用于檢測(cè)P0N3蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下P0N3蛋白的異常表達(dá)。如P0N3DNA序列可用于對(duì)活檢標(biāo)本的雜交以判斷P0N3蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開(kāi)的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為"基因芯片")上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用P0N3蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(cè)P0N3蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。檢測(cè)可以針對(duì)cDNA,也可針對(duì)基因組DNA。P0N3蛋白突變的形式包括與正常野生型P0N3DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無(wú)突變。最方便的檢測(cè)本發(fā)明SNP的方法，是通過(guò)用P0N3基因特異性引物擴(kuò)增樣品的P0N3基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；然后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性301位A—G，其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQIDN0:1。應(yīng)理解，在本發(fā)明首次揭示了P0N3基因的SNP與動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病的相關(guān)性之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地設(shè)計(jì)出可特異性擴(kuò)增出含該SNP位置的擴(kuò)增產(chǎn)物，然后通過(guò)測(cè)序等方法確定是否存在301位A—G。通常，引物的長(zhǎng)度為15-50bp，較佳地為20-30bp。雖然引物與模板序列完全互補(bǔ)是優(yōu)選的，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在引物與模板存在一定的不互補(bǔ)(尤其是引物的5'端)的情況下，也能夠特異性地?cái)U(kuò)增(即僅擴(kuò)增出所需的片段)。含有這些引物的試劑盒和使用這些引物的方法都在本發(fā)明范圍之內(nèi)，只要該引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物含有本發(fā)明SNP的對(duì)應(yīng)位置。一種優(yōu)選的引物對(duì)具有SEQIDN0:2和3的序列。雖然擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度沒(méi)有特別限制，但是通常擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為100-2000bp，較佳地為150-1500bp，更佳地為200-1000bp。這些擴(kuò)增產(chǎn)物都應(yīng)含有SEQIDN0:l中第301位。由于本發(fā)明的SNP與動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病具有非常高的關(guān)聯(lián)性，因此不僅可用于早期輔助性診斷動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病，而且可以未雨綢繆地使一些攜帶者在未發(fā)病前就采取合理的預(yù)防措施(如在飲食上采取相應(yīng)控制)，從而提高攜帶者的生存期和生存質(zhì)量，因此具有極其重大的應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)效益。當(dāng)然，最終宜用常規(guī)檢測(cè)方法進(jìn)行確診。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sarobrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例l1.1研究對(duì)象在經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影確診為動(dòng)脈粥樣硬化的病人中，挑選病變支數(shù)在2條或2條以上，且病變狹窄程度在50免以上的病人作為病例。另取經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影確診為沒(méi)有動(dòng)脈粥樣硬化的正常人作為對(duì)照，盡量選取年齡、性別和籍貫與病例組相匹配。在知情同意的基礎(chǔ)上隨機(jī)收集了187個(gè)病人和192個(gè)正常對(duì)照個(gè)體的外周血樣本。1.2實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果1.2.1DNA提取用常規(guī)酚氯仿法從人的外周血樣本中提取DNA，濃度校正至20ng/ul后，用于常規(guī)PC財(cái)廣增。1.2.2PCR及測(cè)序引物的設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中P0N3的基因組序列，設(shè)計(jì)和合成以下引物。具體引物如下表l所示。表l引物序列表引物名稱序列(5'-3')SEQIDNO:有義引物tctctcttcccctcaccatcaaatt2反義引物gaaaattgaattttatgttctgatg31.2.3P0N3基因的PCR擴(kuò)增以提取的DNA為模板，用T叫酶，在GeneAmp9700PCR儀上以Touchdown程序進(jìn)行PC財(cái)廣增。反應(yīng)條件為94。C預(yù)變性2分鐘，94。C變性30秒，63。C退火40秒，72"延伸40秒，共10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度遞減0.5X:;以后94'C變性30秒，58。C退火40秒，72。C延伸40秒，共30個(gè)循環(huán);最后72"C延伸7分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。結(jié)果，獲得P0N3的擴(kuò)增產(chǎn)物。1.2.4SNP的發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)PCR產(chǎn)物經(jīng)Resin樹(shù)脂純化后，用ABI-PRISM377DNA測(cè)序儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司appliedbiosystems(ABI))進(jìn)行熒光標(biāo)記末端終止法雙向測(cè)序，用Polyphred軟件(美國(guó)華盛頓大學(xué)http:〃droog.mbt.Washington,edu/Polyphred.htral)進(jìn)行序列的判讀和SNP確認(rèn)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)存在數(shù)個(gè)SNP，其中包括以下SNP:SEQIDNO:1中301位A—G。1.2.5SNP基因分型和關(guān)聯(lián)分析用直接單向測(cè)序法進(jìn)行SNP基因分型。即在動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病病人和正常對(duì)照組中進(jìn)行分型和關(guān)聯(lián)分析。對(duì)基因分型結(jié)果進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)分析，列聯(lián)表進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。觀察基因型在病人和對(duì)照之間是否具有差異。分析結(jié)果顯示，在總共187個(gè)病人和192個(gè)正常對(duì)照中，PON3的301位的SNP(記為RS978903)在病人組和對(duì)照組之間存在顯著差異在PON3基因的第3號(hào)內(nèi)含子的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)上，等位基因型G的頻率在病人群中為84.5呢，在對(duì)照中為76.6%，兩者具有顯著性差異(p-0.0059)。上述結(jié)果證實(shí)了SEQIDNO:l中301位的SNP與動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病的發(fā)生存在著相關(guān)性。實(shí)施例2動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病易感性檢測(cè)試劑盒如實(shí)施例l所述，SEQIDNO:1中301位A—G的突變與動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病疾病密切相關(guān)。因此，可基于這個(gè)突變?cè)O(shè)計(jì)P0N3基因特異性引物在以病人的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)。制備一試劑盒(100人次)，它含有:名稱序列濃度有義引物SEQIDNO:2lOOpmol反義引物SEQIDNO:3lOOpmolPCR反應(yīng)液含Taq酶dNTP鎂離子PCR反應(yīng)緩沖液隨機(jī)挑選100個(gè)人構(gòu)成的測(cè)試組，其中包括未知是否患動(dòng)脈粥樣硬化的對(duì)象、已知患動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病病人和經(jīng)檢測(cè)無(wú)動(dòng)脈粥樣硬化的正常人。抽取測(cè)試組中待檢測(cè)對(duì)象的外周血3ml，使用常規(guī)方法(或使用特定的試劑盒)從血液中提取DNA。將動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病檢測(cè)試劑盒中的PCR引物稀釋到limol/il，以所提取的DNA為模板與所提供的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物純化后，用ABI-PRISMTm377DNA測(cè)序儀進(jìn)行熒光標(biāo)記末端終止法雙向測(cè)12序，用Polyphred軟件進(jìn)行序列的判讀和SNP確認(rèn)?；蛘撸瑢U(kuò)增產(chǎn)物與正常對(duì)照用變性高效液相色譜儀(DHPLC)進(jìn)行色譜分析，也可檢測(cè)出301位A—G。檢測(cè)結(jié)果對(duì)于P0N3存在301位A—G的對(duì)象，進(jìn)一步通過(guò)常規(guī)方法檢測(cè)以確認(rèn)是否患有動(dòng)脈粥樣硬化情況。檢測(cè)結(jié)果表明，含301位A—G的檢測(cè)對(duì)象的動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病易感性比例明顯高于不含G正常人群(高出至少80呢)。因此，這表明通過(guò)檢測(cè)P0N3的301位A—G，可進(jìn)行動(dòng)脈粥樣硬化的輔助性檢測(cè)。實(shí)施例3動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病易感性輔助性檢測(cè)重復(fù)實(shí)施例2的檢測(cè)，不同點(diǎn)在于隨機(jī)選取了70個(gè)人(檢測(cè)前不知道是否有動(dòng)脈粥樣硬化癥狀)進(jìn)行檢測(cè)。制備一試劑盒(100人次)，它含有:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>抽取待檢測(cè)對(duì)象的外周血3ml，使用常規(guī)方法(或使用特定的試劑盒)從血液中提取DNA。將動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病檢測(cè)試劑盒中的PCR引物稀釋到limol/il,以所提取的DNA為模板與所提供的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物純化后，用ABI-PRISNT377DNA測(cè)序儀進(jìn)行熒光標(biāo)記末端終止法雙向測(cè)序，用Polyphred軟件進(jìn)行序列的判讀和SNP確認(rèn)。結(jié)果同樣證實(shí)了，含301位A—G的檢測(cè)對(duì)象的動(dòng)脈粥樣硬化比例明顯高于該位點(diǎn)為AA的檢測(cè)對(duì)象。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。序列表<110〉上海人類基因組研究中心<120>冠-'Li、病1^測(cè)方/去禾口i式劑盒<130〉072068<160〉3<170>Patentlnversion3.1<210〉1<211〉601<212〉DNA〈213>智人(Horaosapiens)<400>1tctctcttcccctcaccatcaaatttcttagaaacatcacctgatcttattgcctaatgt60gaactgctccaactctcaattccctgaagttagtattccactcccaccagtttgtagaaa120tacccttataaagatcatataaatggtctccaaattactttattttgataacttttctac180ttctgatctgcttctctgtggcatttgacactacagtataccttcttctttcttatcaaa240acgtcaaaagttgagttcccagatagaaatcctgctcctcttcctgactcttggatttat300acctccttctgtttttatcgatccctcctcccttctcactctatactctttccttgcaga360tcttatacataaagattcaggtatttcctttatatcaaggactttcaagtctgcacattt420atttgtaactctgtaactctagcttgccttcccaacctcctcccaaagggcagctcaaaa480tcaactagtcaaaaccaaaatcaacactctcccctcgaatccatcctctcatttatatct540attcttctcagttaaggacatcactatgctccccaacatcagaacataaaattcaatttt600c601<210〉2<211>25<212〉DNA<213〉人丁.序列<220><221>misc—feature<223>引物<400〉2tctctcttcccctcaccatcaaatt25<210〉3<211〉25<212〉DNA<213>人工序列<220〉<221〉raise—feature<223〉引物<400>3gaaaattgaattttatgttctgatg2權(quán)利要求1.一種體外檢測(cè)樣品是否存在對(duì)氧磷酶3(PON3)的單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，包括步驟(a)用PON3基因特異性引物擴(kuò)增樣品的PON3基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；和(b)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性301位A→G；其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQIDNO1。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因特異性引物具有SEQIDN0:2和3的序列。3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為100-2000bp且含有SEQIDN0:l中第301位。4.一種檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病的試劑盒，其特征在于，它包括特異性擴(kuò)增P0N3基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，所述的引物擴(kuò)增出長(zhǎng)度為100-2000bp且含有SEQIDN0:l中第301位的擴(kuò)增產(chǎn)物。5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，它還含有選自下組的試劑(a)與SEQIDN0:l中第301位的突變結(jié)合的探針；(b)識(shí)別SEQIDN0:l中第301位的突變限制性內(nèi)切酶。6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述的突變是以下的單核苷酸多態(tài)性301位A—G;其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQIDN0:1。7.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的引物具有SEQIDN0:2和3的序列。8.—種對(duì)個(gè)體的動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病易感性進(jìn)行診斷的方法，其特征在于，它包括步驟檢測(cè)該個(gè)體的P0N3基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白，并與正常的P0N3基因、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白相比較，其中，存在差異就表明該個(gè)體患動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病的可能性高于正常人群。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，檢測(cè)的是P0N3的基因或轉(zhuǎn)錄本，并與正常P0N3核苷酸序列比較差異。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的差異是以下的單核苷酸多態(tài)性301位A—G;其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQIDN0:1。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病易感性的方法，它包括檢測(cè)個(gè)體的對(duì)氧磷酶3(PON3)、轉(zhuǎn)錄本和/或蛋白與正常相比是否存在變異，存在變異就表明該個(gè)體患動(dòng)脈粥樣硬化和/或冠心病的可能性大于正常人群。本發(fā)明還公開(kāi)了相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101294212SQ20071004011公開(kāi)日2008年10月29日申請(qǐng)日期2007年4月27日優(yōu)先權(quán)日2007年4月27日發(fā)明者一王,穎王,王海豐,力金,薇黃申請(qǐng)人:上海人類基因組研究中心