專利名稱：一種新型非限制性核酸內(nèi)切酶在大腸桿菌中的表達(dá)及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)一種非特異性核酸內(nèi)切酶的方法。該酶能降解各種形式的核酸(包括DNA及RNA)，可用于除去以核酸為雜質(zhì)的生物材料中的核酸或排除由核酸引起的影響。

背景技術(shù)：
非特異性核酸內(nèi)切酶是一類能夠降解各種形式DNA和RNA的水解酶，對(duì)單鏈、雙鏈、線狀、環(huán)狀和超螺旋形式的DNA和RNA的磷酸二酯鍵均具有很高的活性，產(chǎn)生5’-磷酸核苷酸或5’-磷酸寡核苷酸，且對(duì)核酸沒(méi)有序列要求?？捎糜诔ド锊牧现械暮怂峄蚺懦珊怂嵋鸬母蓴_。
這類酶的典型代表是來(lái)源于Serratia marcescens的非特異性核酸內(nèi)切酶，已經(jīng)商品化，商品名

該酶的基因已被克隆和在大腸桿菌中表達(dá)，由于該酶具有信號(hào)肽，生成的核酸酶被分泌到周質(zhì)和培養(yǎng)基等不同部位。到目前為止，該酶主要是從培養(yǎng)基中分離純化都得到的。但是，只有少量的酶被分泌到胞外，還有不少在周質(zhì)和以無(wú)活性的前體包涵體形式存在于胞內(nèi)。有人將包涵體增溶和復(fù)性，雖得到了具有活性的酶，但由于是前體蛋白，有一段信號(hào)肽，所以比活不高。因此，該酶的產(chǎn)量較低，工藝繁瑣，價(jià)格偏貴，不利用于在我國(guó)使用。
來(lái)源于Anabaena sp.的非特異性核酸內(nèi)切酶與來(lái)源于Serratia marcescens的非特異性核酸內(nèi)切酶同源，生物功能極其相似。來(lái)源于Anabaena sp.的非特異性核酸內(nèi)切酶的基因也被克隆、測(cè)序和在大腸桿菌中表達(dá)，也具有信號(hào)肽，也屬于分泌表達(dá)。但與其他非特異性核酸內(nèi)切酶相比，它有一個(gè)顯著特征，就是它具有一個(gè)天然的抑制劑蛋白，能對(duì)抗該酶在胞內(nèi)的毒性。


發(fā)明內(nèi)容
為了提高非特異性核酸內(nèi)切酶的產(chǎn)量、簡(jiǎn)化工藝、降低價(jià)格、擴(kuò)大其使用，本發(fā)明利用來(lái)源于Anabaena sp.的非特異性核酸內(nèi)切酶具有天然抑制劑蛋白的性質(zhì)，改變了非特異性核酸內(nèi)切酶原有的表達(dá)形式，既改分泌表達(dá)為胞內(nèi)高效表達(dá)，采用強(qiáng)啟動(dòng)子以無(wú)活性的包涵體形式在胞內(nèi)大量表大，在表達(dá)該酶的同時(shí)，一起表達(dá)其天然抑制劑蛋白，以消除極少量有活性的核酸酶對(duì)細(xì)胞的強(qiáng)毒性，并利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)置換掉一個(gè)非活性中心氨基酸，減少了復(fù)性時(shí)形成多聚體的可能性，提高了復(fù)性效率。從提高表達(dá)效率和復(fù)性效率兩方面提高了產(chǎn)量。
通過(guò)化學(xué)合成法合成來(lái)源于Anabaena sp的非特異性核酸內(nèi)切酶基因(SEQ IDNO.1)及其抑制劑蛋白基因(SEQ ID NO.3)。
采用定點(diǎn)突變技術(shù)將非特異性核酸內(nèi)切酶基因(SEQ ID NO.1)中第496位的T突變?yōu)锳得到突變的非特異性核酸內(nèi)切酶基因(SEQ ID NO.5)，在相應(yīng)表達(dá)的蛋白中第166位的Cys就變?yōu)镾er(SEQ ID NO.6)。
采用反向PCR技術(shù)用抑制劑蛋白基因(SEQ ID NO.3)取代pLysE質(zhì)粒(Novagen公司產(chǎn)品)中的溶菌酶基因，再用改造后的的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)細(xì)胞，作為表達(dá)突變的非特異性核酸內(nèi)切酶的宿主細(xì)胞(已含有表達(dá)抑制劑蛋白基因的質(zhì)粒)。
采用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)去除突變的非特異性核酸內(nèi)切酶基因(SEQ ID NO.5)信號(hào)肽，加入起始密碼子ATG，并在起始密碼子(ATG)后引入6個(gè)組氨酸密碼子(CATCACCATCACCATCAC)，得到新的序列(SEQ ID NO.7)，相應(yīng)得氨基酸序列為(SEQID NO.8)。在片斷的首尾引入合適的限制性酶切位點(diǎn)，裝配入質(zhì)粒pET-11a(Novagen公司產(chǎn)品)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(已含有表達(dá)抑制劑蛋白基因的質(zhì)粒)，完成工程菌的構(gòu)建。
將構(gòu)建好的工程菌發(fā)酵，離心得到菌體，洗滌后破菌。再離心得到包涵體，洗滌包涵體后增溶溶解，溶液離心后采用鎳粒子親和層析純化蛋白，純化的蛋白通過(guò)透析復(fù)性，加入穩(wěn)定劑后低溫儲(chǔ)存。



圖1、人工合成Anabaena sp的非特異性核酸內(nèi)切酶全基因(SEQ ID NO.1)裝配于pUC18質(zhì)粒中得到新質(zhì)粒pUC18-nse的圖譜。
圖2、人工合成抑制劑蛋白全基因(SEQ ID NO.3)裝配于pUC18質(zhì)粒中得到新質(zhì)粒pUC18-inh的圖譜。
圖3、采用定點(diǎn)突變技術(shù)將質(zhì)粒pUC18-nse中第930位的T突變?yōu)锳(非特異性核酸內(nèi)切酶基因(SEQ ID NO.1)中第496位的T突變?yōu)锳、得到突變的非特異性核酸內(nèi)切酶基因(SEQ ID NO.5))，得到突變的新質(zhì)粒pUC18-nse-mut的圖譜。
圖4、采用反向PCR技術(shù)擴(kuò)增pLysE質(zhì)粒中的非溶菌酶基因并引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，環(huán)化后得到的新質(zhì)粒pLysE-(+)的圖譜。
圖5、將抑制劑蛋白基因裝配入質(zhì)粒pLysE-(+)后得到新質(zhì)粒pLE-inh的圖譜。
圖6、將最終要表達(dá)的新的非特異性核酸內(nèi)切酶基因(SEQ ID NO.7)裝配于pET-11a質(zhì)粒中得到新質(zhì)粒pEa-nse-5的圖譜。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1非特異性核酸內(nèi)切酶基因及其抑制劑蛋白基因的合成 根據(jù)已公布的基因序列，人工合成來(lái)源于Anabaena sp的非特異性核酸內(nèi)切酶基因(SEQID NO.1)及其抑制劑蛋白基因(SEQ ID NO.3)，相應(yīng)得氨基酸序列為(SEQ ID NO.2)和(SEQID NO.4)將合成的基因裝配于克隆質(zhì)粒pUC18中，得到質(zhì)粒pUC18-nse(圖1)和質(zhì)粒pUC18-inh(圖2)，轉(zhuǎn)化克隆大腸桿菌DH5α。
實(shí)施例2定點(diǎn)突變 采用Stratagene公司的

Site-directed Mutagenesis Kit來(lái)完成定點(diǎn)突變。將非特異性核酸內(nèi)切酶基因中(SEQ ID NO.1)第496位的T突變?yōu)锳，得到質(zhì)粒pUC18-nse-mut(圖3)。在相應(yīng)表達(dá)的蛋白中第166位的Cys就變?yōu)镾er(SEQ IDNO.6)。
(一)建立反應(yīng)體系 (1)引物設(shè)計(jì) 按如下序列合成引物 引物-15’-gggaaatttagaagattattgtcgagaattaggtctcag-3’ 引物-25’-ctgagacctaattctcgacaataatcttctaaatttccc-3’ (2)準(zhǔn)備對(duì)照反應(yīng) 10×反應(yīng)緩沖液5μl pWhitescriptTM 4.5-kb對(duì)照質(zhì)粒(5ng/μl)2μl 對(duì)照引物-1(100ng/μl) 1.25μl 對(duì)照引物-2(100ng/μl) 1.25μl dNTP混合液1μl 加H2O至 50μl

DNA polymerase(2.5U/μl)1μl (3)準(zhǔn)備樣品反應(yīng) 10×反應(yīng)緩沖液5μl pUC18-nse質(zhì)粒(5ng/μl)2μl 引物-1(100ng/μl) 1.25μl 引物-2(100ng/μl) 1.25μl dNTP混合液1μl 加H2O至 50μl

DNA聚合酶(2.5U/μl) 1μl (4)PCR循環(huán)條件 1)一次循環(huán)95℃ 30s 2)12次循環(huán)95℃ 30s 55℃ 1min 68℃ 8min 3)一次循環(huán)4℃ 1min 反應(yīng)結(jié)束可以取10μl進(jìn)行電泳檢測(cè)。
(二)消化程序 (1)向上述反應(yīng)體系中直接加入1μl Dpn I(10U/μl) (2)輕輕吸打混勻，離心10s，37℃溫浴1h。
(三)轉(zhuǎn)化XL1-Blue細(xì)胞 (1)冰上溶解XL1-Blue感受態(tài)細(xì)胞，各取50μl加入1.5ml Ep管中。
(2)分別加1μl以上經(jīng)消化的PCR產(chǎn)物入1.5ml Ep管中，輕輕混勻，置于冰上30min。
(3)42℃加熱45s，然后插入冰中。
(4)加500μl LB，230r/min，37℃培養(yǎng)1h。
(5)鋪皿分別取對(duì)照組和樣品培養(yǎng)液250μl，加入含Amp的瓊脂培養(yǎng)皿，瓊脂含20μl 10％的X-gal和20μl 100mM的IPTG。
(6)37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
(四)結(jié)果檢查 對(duì)照組上可見(jiàn)到500～800個(gè)菌落，大于80％的菌落含有突變點(diǎn)，菌落的顏色為藍(lán)色。樣品培養(yǎng)皿上也有菌落，通過(guò)測(cè)序確定突變與否。
實(shí)施例3表達(dá)核酸酶抑制劑蛋白質(zhì)粒pLE-inh的構(gòu)建 pLE-inh質(zhì)粒是將pLysE質(zhì)粒(Novagen公司產(chǎn)品)中的溶菌酶基因(lys)替換為抑制劑蛋白基因(inh)衍生而來(lái)。pLysE的主要表達(dá)產(chǎn)物是溶菌酶，是T7RNA聚合酶的天然抑制劑。之所以選擇pLysE，是因?yàn)楸竞怂崦敢种苿┑鞍着c溶菌酶在相應(yīng)細(xì)胞中的作用相似，都是天然抑制劑，都是為了消除所要表達(dá)的目標(biāo)蛋白對(duì)細(xì)胞的毒性。
為了構(gòu)建pLE-inh，采用反向PCR技術(shù)，擴(kuò)增pLysE的非溶菌酶部分，并在兩端加入限制性酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增后用引入的同一限制性內(nèi)切酶酶切、連接環(huán)化，轉(zhuǎn)化克隆宿主，篩選測(cè)序，制備質(zhì)粒pLysE-(+)(圖4)。
再采用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)擴(kuò)增核酸抑制劑蛋白基因，并在兩端入加限制性酶切位點(diǎn)，限制酶酶切后，裝在上述衍生質(zhì)粒相應(yīng)酶切位點(diǎn)間，轉(zhuǎn)化克隆宿主，篩選測(cè)序，制備質(zhì)粒pLE-inh(圖5)。完成構(gòu)建。具體操作如下 (1)PCR引物設(shè)計(jì) ATG引物(引入Nde I、Pst I酶切位點(diǎn)) 5’-AACTGCAGCATATGTATTTCTTTCCTCCTTTC-3’ TAA引物(引入Pst I、Xho I酶切位點(diǎn)) 5’-AACTGCAGCTCGAGTTAATTGAACTCACTCAC-3’ (2)準(zhǔn)備樣品反應(yīng) 10×反應(yīng)緩沖液5μl pLysE質(zhì)粒(5ng/μl)2μl ATG引物(100ng/μl)1.25μl TAA引物(100ng/μl)1.25μl dNTP混合液1μl 加H2O至 50μl

DNA聚合酶(2.5U/μl) 1μl (3)PCR循環(huán)條件 1)一次循環(huán)95℃ 30s 2)12次循環(huán)95℃ 30s 55℃ 1min 68℃ 10min 3)一次循環(huán)4℃ 1min 反應(yīng)結(jié)束可以取10μl進(jìn)行電泳檢測(cè)。
(4)PCR產(chǎn)物回收 用QIAGEN公司的

PCR Purification Kit回收上述PCR產(chǎn)物。
(5)用Pst I酶切回收后的PCR產(chǎn)物，再用T4DNA連接酶環(huán)化，轉(zhuǎn)化克隆大腸桿菌DH5α，篩選、測(cè)序。
(6)測(cè)序正確，提取質(zhì)粒，用Nde I和Xho I對(duì)回收的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切并用堿性磷酸酯酶脫磷酸化，回收脫磷酸化載體，用于與下面的片斷連接。
(7)制備抑制劑蛋白基因片段 1)引物設(shè)計(jì) 上游引物(引入Nde I) 5’-GGAATTCCATATGACCAAAACCAACTCAGAAATTTTAG-3’ 下游引物(引入Xho I) 5’-CCGCTCGAGTCAAGTTTCCACAACTTTAGTAGAAATAC-3’ 2)反應(yīng)體系 10×反應(yīng)緩沖液5μl pUC18-inh質(zhì)粒(5ng/μl)2μl 上游引物(100ng/μl) 1.25μl 下游引物(100ng/μl) 1.25μl dNTP混合液1μl 加H2O至 50μl TaqDNA聚合酶(2.5U/μl)1μl 3)PCR循環(huán)條件 1)1次循環(huán)94℃5min 2)30次循環(huán)94℃ 30s 55℃ 30s 72℃ 45s 3)1次循環(huán)72℃10min 4)4℃或-20℃保存。
反應(yīng)結(jié)束可以取10μl進(jìn)行電泳檢測(cè)。
4)PCR產(chǎn)物回收 用QIAGEN公司的

PCR Purification Kit回收上述PCR產(chǎn)物。
5)用Nde I和Xho I對(duì)回收的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用于連接。
(8)將(6)和(7)制備的片段用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化克隆大腸桿菌DH5α，篩選、測(cè)序。
(9)測(cè)序正確，完成pLE-inh質(zhì)粒構(gòu)建，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，再將含有pLE-inh質(zhì)粒的細(xì)胞制備為感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)pLE-inh。
實(shí)施例4表達(dá)非特異性核酸內(nèi)切酶質(zhì)粒pEa-nse-5的構(gòu)建及工程菌的構(gòu)建 將突變的非特異性核酸內(nèi)切酶基因通過(guò)PCR反應(yīng)，切除信號(hào)肽，引入Nde I和BamH I酶切位點(diǎn)，并在起始密碼子ATG后加上六個(gè)組氨酸密碼子(CATCACCATCACCATCAC)，得到最后要表達(dá)的核酸酶基因(SEQ ID NO.4)，然后裝配入pET-11a質(zhì)粒(Novagen公司產(chǎn)品)的Nde I和BamH I之間，完成質(zhì)粒pEa-nse-5(圖6)的構(gòu)建，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)pLE-inh，完成工程菌的構(gòu)建BL21(DE3)pLE-inh/pEa-nse-5 (1)PCR引物設(shè)計(jì) 上游引物(引入Nde I酶切位點(diǎn)及六個(gè)組氨酸密碼子) 5’-GGAATTCCATATGCATCACCATCACCATCACGGAATTTGTGGAAAATTG-3’ 下游引物(引入BamH I酶切位點(diǎn)) 5’-CGGAATCCCTAATTATCAACTTTACTCTC-3’ (2)準(zhǔn)備樣品反應(yīng) 10×反應(yīng)緩沖液5μl pUC18-nse-mut質(zhì)粒(5ng/μl)2μl 上游引物(100ng/μl) 1.25μl 下游引物(100ng/μl) 1.25μl dNTP混合液1μl 加H2O至 50μl Taq DNA聚合酶(2.5U/μl) 1μl (3)PCR循環(huán)條件 1)1次循環(huán)94℃ 5min 2)30次循環(huán)94℃30s 55℃30s 68℃45s 3)1次循環(huán)72℃ 10min 4)4℃或-20℃保存。
反應(yīng)結(jié)束可以取10μl進(jìn)行電泳檢測(cè)。
(4)PCR產(chǎn)物回收 用QIAGEN公司的

PCR Purification Kit回收上述PCR產(chǎn)物。
(5)用Nde I和BamH I對(duì)回收的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，用于連接。
(6)提取pET-11a質(zhì)粒，用Nde I和BamH I對(duì)回收的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切并用堿性磷酸酯酶脫磷酸化，回收脫磷酸化載體，用于連接。
(7)將(5)和(6)制備的片段用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化克隆大腸桿菌DH5α，篩選、測(cè)序。
(10)測(cè)序正確，完成pEa-nse-5質(zhì)粒構(gòu)建，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)pLE-inh感受肽細(xì)胞，鑒定，完成工程菌BL21(DE3)pLE-inh/pEa-nse-5的構(gòu)建。
實(shí)施例5重組非特異性核酸內(nèi)切酶的表達(dá) 取經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定的種子液，接入含有100μg/ml氨芐青霉素和25μg/ml氯霉素的滅菌LB培養(yǎng)基中。37℃下250rpm培養(yǎng)過(guò)夜。以1％的接種量接入含有100μg/ml氨芐青霉素和25μg/ml氯霉素的滅菌LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)。當(dāng)A600值達(dá)到0.6時(shí)，加入IPTG使其終濃度達(dá)到0.4mmol/l。誘導(dǎo)表達(dá)3h，離心(4℃，5000×g，10min)收集菌體，再用PBS(pH8.0)懸浮菌體，離心(4℃，5000×g，10min)收集菌體，-20℃保存或直接純化。
實(shí)施例6重組非特異性核酸內(nèi)切酶的純化 (1)破菌 菌體解凍、按濕重1∶10加入破胞液，懸浮菌體，用高壓勻漿器破菌，離心，收集沉淀。
(2)洗滌包涵體 沉淀用1∶10洗滌液II洗滌一次，離心，收集沉淀。
(3)溶解包涵體 沉淀用增溶液溶解，離心，收集上清。
(4)上鎳離子親和柱 ①層析柱預(yù)處理 a)柱床高度5cm，至少用2BV蒸餾水沖洗柱床。
b)用0.2BV的0.2M NiSO4溶液上柱，以掛Ni2+。
c)用5BV蒸溜水洗滌柱床，以除多余Ni2+。
②平衡 至少用2BV的增溶液平衡，使平衡流出液的pH與增溶液相同。
③上樣 ④洗滌 至少用2BV的增溶液洗滌，使A280基線穩(wěn)定。
⑤洗脫 用洗脫液洗脫洗脫，收集A280洗脫峰流出液。
⑥柱床的再生、清洗與貯存 a)用0.5BV的0.2M EDTA溶液，0.5M NaCl溶液，拔除金屬離子。
b)用1BV的2MNaCl溶液上柱，保持15min。
c)用1BV的1MNaOH溶液上柱，保持1～2h。
d)用蒸餾水洗滌柱床至pH7.0左右。
e)柱床貯存于20％乙醇或0.01M NaOH溶液中。
(5)復(fù)性 收集到的A280洗脫峰流出液對(duì)10倍量的透析液透析24小時(shí)，每12小時(shí)換液一次，換2次。
(6)分裝 加入100％甘油，使甘油的終濃度達(dá)50％，按需要分裝，-20℃保存。
以上操作如無(wú)特別說(shuō)明，均要求在4℃環(huán)境下進(jìn)行！ 實(shí)施例7降低大腸肝菌裂解液黏度 取大腸桿菌BL21(DE3)7.5g(濕重)懸浮于15ml緩沖液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH9.0)。加入MgCl2使其終濃度為6mM。分別取5ml大腸桿菌懸浮液，加入核酸酶使其濃度遞增。
加入核酸酶后，懸浮液通過(guò)高壓勻質(zhì)器(10000psi)，然后立即放入0℃下。在不同的時(shí)間間隔，用槍頭吸入懸浮液，然后滴下，獲得“水滴”效果時(shí)，判定黏度降低。
實(shí)施例8除去核酸 將鯡魚(yú)精子DNA溶于緩沖液(50mM Tris-HCl，1mM MgCl2，0.1mg/ml BSA，pH8.0)中，制備成供試液。供試液在不同溫度下(0℃、23℃、37℃)用不同濃度的重組非特異性核酸內(nèi)切酶處理。在不同的時(shí)間間隔，取出10μl(最初含有500ng DNA)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。以用32P標(biāo)記的鯡魚(yú)精子DNA為探針，進(jìn)行斑點(diǎn)雜交。標(biāo)準(zhǔn)DNA量從100ng到10pg，用于核酸殘留半定量計(jì)算。
供試液在不同溫育時(shí)間下殘留DNA量(ng) 核酸酶濃度為90U/ml，供試液在不同溫育時(shí)間下殘留DNA量(ng) 核酸酶濃度為90U/ml，供試液在不同溫育時(shí)間下殘留DNA量(ng)
一種新型非限制性核酸內(nèi)切酶在大腸桿菌中的表達(dá)及應(yīng)用SEQUENCE LISTING
<110>上海拜朗生物科技有限公司
<120>一種新型非限制性核酸內(nèi)切酶在大腸桿菌中的表達(dá)及應(yīng)用
<130>無(wú)
<140>200710041024.1
<141>2007-05-22
<160>8
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>825
<212>DNA
<213>絲狀體藍(lán)藻魚(yú)腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)
<400>1
atgggaattt gtggaaaatt gggtgtagcg gcgttggtgg cgttgattgt cgggtgttcg 60
cctgtccaat cccaagtgcc accattaact gaactttccc catcaatcag cgtgcattta120
ctgctgggaa atcccagtgg tgcaacgcca acaaagctta cacctgataa ttacctgatg180
gtcaaaaatc aatatgcact ctcctacaac aacagcaagg gaactgctaa ctgggtagct240
tggcagctta actcctcatg gctagggaac gcagagcgtc aagataactt ccgcccagac300
aaaacattgc ctgcgggttg ggtgcgagtg actccttcta tgtactctgg gagtggttat360
gaccgggggc atattgcacc ttcagcagac cgcaccaaga caacagaaga taatgcggct420
actttcctga tgacaaacat gatgccccaa acacccgata acaatagaaa tacgtgggga480
aatttagaag attattgtcg agaattagtc agtcagggta aagagcttta cattgttgcc540
gggcctaatg gtagtcttgg caaacccctc aaaggtaagg tgacagttcc caaatccact600
tggaagattg ttgtcgtact agatagccca ggctcagggc ttgaaggtat tactgctaat660
actcgcgtta tcgcagtaaa tattcccaac gacccagaat taaataatga ctggagggct720
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<211>274
<212>PRT
<213>絲狀體藍(lán)藻魚(yú)腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)
<400>2
一種新型非限制性核酸內(nèi)切酶在大腸桿菌中的表達(dá)及應(yīng)用
Met Gly Ile Cys Gly Lys Leu Gly Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Ile
1 5 10 15
Val Gly Cys Ser Pro Val Gln Ser Gln Val Pro Pro Leu Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Pro Ser Ile Ser Val His Leu Leu Leu Gly Asn Pro Ser Gly Ala
35 40 45
Thr Pro Thr Lys Leu Thr Pro Asp Asn Tyr Leu Met Val Lys Asn Gln
50 55 60
Tyr Ala Leu Ser Tyr Asn Asn Ser Lys Gly Thr Ala Asn Trp Val Ala
65 70 75 80
Trp Gln Leu Asn Ser Ser Trp Leu Gly Asn Ala Glu Arg Gln Asp Asn
85 90 95
Phe Arg Pro Asp Lys Thr Leu Pro Ala Gly Trp Val Arg Val Thr Pro
100 105 110
Ser Met Tyr Ser Gly Ser Gly Tyr Asp Arg Gly His Ile Ala Pro Ser
115 120 125
Ala Asp Arg Thr Lys Thr Thr Glu Asp Asn Ala Ala Thr Phe Leu Met
130 135 140
Thr Asn Met Met Pro Gln Thr Pro Asp Asn Asn Arg Asn Thr Trp Gly
145 150 155 160
Asn Leu Glu Asp Tyr Cys Arg Glu Leu Val Ser Gln Gly Lys Glu Leu
165 170 175
Tyr Ile Val Ala Gly Pro Asn Gly Ser Leu Gly Lys Pro Leu Lys Gly
180 185 190
Lys Val Thr Val Pro Lys Ser Thr Trp Lys Ile Val Val Val Leu Asp
195 200 205
Ser Pro Gly Ser Gly Leu Glu Gly Ile Thr Ala Asn Thr Arg Val Ile
210 215 220
一種新型非限制性核酸內(nèi)切酶在大腸桿菌中的表達(dá)及應(yīng)用
Ala Val Asn Ile Pro Asn Asp Pro Glu Leu Asn Asn Asp Trp Arg Ala
225 230 235 240
Tyr Lys Val Ser Val Asp Glu Leu Glu Ser Leu Thr Gly Tyr Asp Phe
245 250 255
Leu Ser Asn Val Ser Pro Asn Ile Gln Thr Ser Ile Glu Ser Lys Val
260 265 270
Asp Asn
<210>3
<211>408
<212>DNA
<213>絲狀體藍(lán)藻魚(yú)腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)
<400>3
atgaccaaaa ccaactcaga aattttagaa cagctaaaac aggcatccga tggcttgtta 60
tttatgagtg agtctgaata cccatttgag gtttttttgt gggaaggatc tgcacctcct 120
gttacacatg aaatagtttt gcagcaaaca ggtcacggac aagatgcgcc ttttaaagtg 180
gtagacattg acagcttttt tagcagagcc actactcccc aagactggta tgaggatgaa 240
gaaaatgctg tagttgctaa atttcaaaaa ctgctagagg taataaaatc gaacttaaaa 300
aacccgcagg tgtatcgact gggtgaggta gaacttgatg tttatgttat tggtgaaact 360
ccagcaggaa atttagctgg tatttctact aaagttgtgg aaacttga 408
<210>4
<211>135
<212>PRT
<213>絲狀體藍(lán)藻魚(yú)腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)
<400>4
Met Thr Lys Thr Asn Ser Glu Ile Leu Glu Gln Leu Lys Gln Ala Ser
1 5 10 15
Asp Gly Leu Leu Phe Met Ser Glu Ser Glu Tyr Pro Phe Glu Val Phe
20 25 30
Leu Trp Glu Gly Ser Ala Pro Pro Val Thr His Glu Ile Val Leu Gln
35 40 45
一種新型非限制性核酸內(nèi)切酶在大腸桿菌中的表達(dá)及應(yīng)用
Gln Thr Gly His Gly Gln Asp Ala Pro Phe Lys Val Val Asp Ile Asp
50 55 60
Ser Phe Phe Ser Arg Ala Thr Thr Pro Gln Asp Trp Tyr Glu Asp Glu
65 70 75 80
Glu Asn Ala Val Val Ala Lys Phe Gln Lys Leu Leu Glu Val Ile Lys
85 90 95
Ser Asn Leu Lys Asn Pro Gln Val Tyr Arg Leu Gly Glu Val Glu Leu
100 105 110
Asp Val Tyr Val Ile Gly Glu Thr Pro Ala Gly Asn Leu Ala Gly Ile
115 120 125
Ser Thr Lys Val Val Glu Thr
130 135
<210>5
<211>825
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
atgggaattt gtggaaaatt gggtgtagcg gcgttggtgg cgttgattgt cgggtgttcg 60
cctgtccaat cccaagtgcc accattaact gaactttccc catcaatcag cgtgcattta120
ctgctgggaa atcccagtgg tgcaacgcca acaaagctta cacctgataa ttacctgatg180
gtcaaaaatc aatatgcact ctcctacaac aacagcaagg gaactgctaa ctgggtagct240
tggcagctta actcctcatg gctagggaac gcagagcgtc aagataactt ccgcccagac300
aaaacattgc ctgcgggttg ggtgcgagtg actccttcta tgtactctgg gagtggttat360
gaccgggggc atattgcacc ttcagcagac cgcaccaaga caacagaaga taatgcggct420
actttcctga tgacaaacat gatgccccaa acacccgata acaatagaaa tacgtgggga480
aatttagaag attatagtcg agaattagtc agtcagggta aagagcttta cattgttgcc540
gggcctaatg gtagtcttgg caaacccctc aaaggtaagg tgacagttcc caaatccact600
tggaagattg ttgtcgtact agatagccca ggctcagggc ttgaaggtat tactgctaat660
actcgcgtta tcgcagtaaa tattcccaac gacccagaat taaataatga ctggagggct720
tataaagtca gtgttgatga attagaaagt ttgacgggtt atgatttttt gtctaatgtt780
一種新型非限制性核酸內(nèi)切酶在大腸桿菌中的表達(dá)及應(yīng)用
tcccccaata ttcaaacaag tattgagagt aaagttgata attag 825
<210>6
<211>274
<212>PRT
<213>人工序列
<400>6
Met Gly Ile Cys Gly Lys Leu Gly Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Ile
1 5 10 15
Val Gly Cys Ser Pro Val Gln Ser Gln Val Pro Pro Leu Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Pro Ser Ile Ser Val His Leu Leu Leu Gly Asn Pro Ser Gly Ala
35 40 45
Thr Pro Thr Lys Leu Thr Pro Asp Asn Tyr Leu Met Val Lys Asn Gln
50 55 60
Tyr Ala Leu Ser Tyr Asn Asn Ser Lys Gly Thr Ala Asn Trp Val Ala
65 70 75 80
Trp Gln Leu Asn Ser Ser Trp Leu Gly Asn Ala Glu Arg Gln Asp Asn
85 90 95
Phe Arg Pro Asp Lys Thr Leu Pro Ala Gly Trp Val Arg Val Thr Pro
100 105 110
Ser Met Tyr Ser Gly Ser Gly Tyr Asp Arg Gly His Ile Ala Pro Ser
115 120 125
Ala Asp Arg Thr Lys Thr Thr Glu Asp Asn Ala Ala Thr Phe Leu Met
130 135 140
Thr Asn Met Met Pro Gln Thr Pro Asp Asn Asn Arg Asn Thr Trp Gly
145 150 155 160
Asn Leu Glu Asp Tyr Ser Arg Glu Leu Val Ser Gln Gly Lys Glu Leu
165 170 175
Tyr Ile Val Ala Gly Pro Asn Gly Ser Leu Gly Lys Pro Leu Lys Gly
一種新型非限制性核酸內(nèi)切酶在大腸桿菌中的表達(dá)及應(yīng)用
180 185 190
Lys Val Thr Val Pro Lys Ser Thr Trp Lys Ile Val Val Val Leu Asp
195 200 205
Ser Pro Gly Ser Gly Leu Glu Gly Ile Thr Ala Asn Thr Arg Val Ile
210 215 220
Ala Val Asn Ile Pro Asn Asp Pro Glu Leu Asn Asn Asp Trp Arg Ala
225 230 235 240
Tyr Lys Val Ser Val Asp Glu Leu Glu Ser Leu Thr Gly Tyr Asp Phe
245 250 255
Leu Ser Asn Val Ser Pro Asn Ile Gln Thr Ser Ile Glu Ser Lys Val
260 265 270
Asp Asn
<210>7
<211>774
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
atgcatcacc atcaccatca ccaagtgcca ccattaactg aactttcccc atcaatcagc 60
gtgcatttac tgctgggaaa tcccagtggt gcaacgccaa caaagcttac acctgataat 120
tacctgatgg tcaaaaatca atatgcactc tcctacaaca acagcaaggg aactgctaac 180
tgggtagctt ggcagcttaa ctcctcatgg ctagggaacg cagagcgtca agataacttc 240
cgcccagaca aaacattgcc tgcgggttgg gtgcgagtga ctccttctat gtactctggg 300
agtggttatg accgggggca tattgcacct tcagcagacc gcaccaagac aacagaagat 360
aatgcggcta ctttcctgat gacaaacatg atgccccaaa cacccgataa caatagaaat 420
acgtggggaa atttagaaga ttatagtcga gaattagtca gtcagggtaa agagctttac 480
attgttgccg ggcctaatgg tagtcttggc aaacccctca aaggtaaggt gacagttccc 540
aaatccactt ggaagattgt tgtcgtacta gatagcccag gctcagggct tgaaggtatt 600
actgctaata ctcgcgttat cgcagtaaat attcccaacg acccagaatt aaataatgac 660
tggagggctt ataaagtcag tgttgatgaa ttagaaagtt tgacgggtta tgattttttg 720
一種新型非限制性核酸內(nèi)切酶在大腸桿菌中的表達(dá)及應(yīng)用
tctaatgttt cccccaatat tcaaacaagt attgagagta aagttgataa ttag774
<210>8
<211>257
<212>PRT
<213>人工序列
<400>8
Met His His His His His His Gln Val Pro Pro Leu Thr Glu Leu Ser
1 5 10 15
Pro Ser Ile Ser Val His Leu Leu Leu Gly Asn Pro Ser Gly Ala Thr
20 25 30
Pro Thr Lys Leu Thr Pro Asp Asn Tyr Leu Met Val Lys Asn Gln Tyr
35 40 45
Ala Leu Ser Tyr Asn Asn Ser Lys Gly Thr Ala Asn Trp Val Ala Trp
50 55 60
Gln Leu Asn Ser Ser Trp Leu Gly Asn Ala Glu Arg Gln Asp Asn Phe
65 70 75 80
Arg Pro Asp Lys Thr Leu Pro Ala Gly Trp Val Arg Val Thr Pro Ser
85 90 95
Met Tyr Ser Gly Ser Gly Tyr Asp Arg Gly His Ile Ala Pro Ser Ala
100 105 110
Asp Arg Thr Lys Thr Thr Glu Asp Asn Ala Ala Thr Phe Leu Met Thr
115 120 125
Asn Met Met Pro Gln Thr Pro Asp Asn Asn Arg Asn Thr Trp Gly Asn
130 135 140
Leu Glu Asp Tyr Ser Arg Glu Leu Val Ser Gln Gly Lys Glu Leu Tyr
145 150 155 160
Ile Val Ala Gly Pro Asn Gly Ser Leu Gly Lys Pro Leu Lys Gly Lys
165 170 175
Val Thr Val Pro Lys Ser Thr Trp Lys Ile Val Val Val Leu Asp Ser
一種新型非限制性核酸內(nèi)切酶在大腸桿菌中的表達(dá)及應(yīng)用
180 185 190
Pro Gly Ser Gly Leu Glu Gly Ile Thr Ala Asn Thr Arg Val Ile Ala
195 200 205
Val Asn Ile Pro Asn Asp Pro Glu Leu Asn Asn Asp Trp Arg Ala Tyr
210 215 220
Lys Val Ser Val Asp Glu Leu Glu Ser Leu Thr Gly Tyr Asp Phe Leu
225 230 235 240
Ser Asn Val Ser Pro Asn Ile Gln Thr Ser Ile Glu Ser Lys Val Asp
245 250 255
Asn
權(quán)利要求
1.一種編碼新型非限制性核酸內(nèi)切酶的DNA序列，其特征在于該DNA序列與來(lái)源于Anabaena sp.Anabaena sp.PCC 7120的染色體DNA序列相比，第496位的胸苷酸變異為腺苷酸，并在起始密碼子ATG后加上六個(gè)組氨酸密碼子(CATCACCATCACCATCAC)。
2.一種重組表達(dá)載體，其特征在于該重組表達(dá)載體為質(zhì)粒pET-11a，并含有權(quán)利要求1所述的編碼新型非限制性核酸內(nèi)切酶的DNA序列。
3.一種重組表達(dá)載體，其特征在于該重組表達(dá)載體為質(zhì)粒pLysE，并含有編碼來(lái)源于Anabaena sp.的非限制性核酸內(nèi)切酶抑制劑蛋白質(zhì)的DNA序列。
4.一種重組細(xì)胞，其特征在于該重組細(xì)胞的宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21(DE3)，并被權(quán)利要求2和3所述的重組表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化。
5.一種編碼新型非限制性核酸內(nèi)切酶的氨基酸序列，其特征在于該氨基酸序列由權(quán)利要求1所述的DNA序列所編碼，。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的新型非限制性核酸內(nèi)切酶的氨基酸序列，其特征在于該氨基酸序列與來(lái)源于Anabaena sp.的非限制性核酸內(nèi)切酶的氨基酸序列相比，第166位的半氨酸變異為絲氨酸、切除了信號(hào)肽、并在起始蛋氨酸后加入六個(gè)連續(xù)的組氨酸序列。
7.一種生產(chǎn)如權(quán)利要求5或6所述的新型非限制性核酸內(nèi)切酶的方法，其特征在于該方法包括如下步驟
(1)合成編碼來(lái)源于Anabaena sp.的非限制性核酸內(nèi)切酶的DNA序列；
(2)采用定點(diǎn)突變技術(shù)將步驟(1)所述的DNA序列第496位的T變異為A；
(3)采用標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)去除步驟(2)所述的DNA序列的信號(hào)肽，并在起始密碼子(ATG)后引入6個(gè)組氨酸密碼子；
(4)如權(quán)利要求2所述表達(dá)載體的構(gòu)建；
(5)合成編碼來(lái)源于Anabaena sp.的非限制性核酸內(nèi)切酶抑制劑蛋白質(zhì)的DNA序列；
(5)如權(quán)利要求3所述表達(dá)載體的構(gòu)建；
(6)如權(quán)利要求4所述的重組細(xì)胞的構(gòu)建；
(7)步驟(6)所獲得的重組細(xì)胞的培養(yǎng)表達(dá)；
(8)步驟(7)所獲得的表達(dá)產(chǎn)物的分離純化；
(9)步驟(8)所獲得的分離純化產(chǎn)物的復(fù)性；
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的新型非限制性核酸內(nèi)切酶在去除生物材料中的核酸和降低核酸對(duì)生物材料提取、分析影響的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明利用來(lái)源于Anabaena sp.的非特異性核酸內(nèi)切酶具有天然抑制劑蛋白的性質(zhì)，改變了非特異性核酸內(nèi)切酶原有的表達(dá)形式，即改分泌表達(dá)為胞內(nèi)高效表達(dá)，采用強(qiáng)啟動(dòng)子以無(wú)活性的包涵體形式在胞內(nèi)大量表大，在表達(dá)該酶的同時(shí)，一起表達(dá)其天然抑制劑蛋白，以消除極少量有活性的核酸酶對(duì)細(xì)胞的強(qiáng)毒性，并利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)置換掉一個(gè)非活性中心氨基酸，減少了復(fù)性時(shí)形成多聚體的可能性，提高了復(fù)性效率。從提高表達(dá)效率和復(fù)性效率兩方面提高了產(chǎn)量。
文檔編號(hào)C12P19/30GK101311268SQ20071004102
公開(kāi)日2008年11月26日 申請(qǐng)日期2007年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月22日
發(fā)明者汪寄宇, 張建新 申請(qǐng)人:上海拜朗生物科技有限公司