專利名稱：：利用基因組改組技術改良多拉菌素生產菌的方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于細胞生物學領域；更具體地，本發(fā)明涉及一種制備原生質體融合的菌株的方法，利用所述方法可進行各種工業(yè)菌株(如多拉菌素生產菌)的育種和改良。
背景技術：
：在工業(yè)微生物育種中，原生質體誘變與原生質體融合技術已經被廣泛應用，并取得了良好的效果。而將兩者相結合的誘變融合技術也被不斷應用與發(fā)展，尤其是基因組改組(GenomeShuffling)技術的誕生，為工業(yè)微生物的育種帶來了新的思路。在一般的原生質體融合中，都會使得兩親本帶上可以識別的選擇性遺傳標記以篩選融合子。然而，目前傳統(tǒng)采用的選擇性標記主要是整合型標記、抗藥性標記、營養(yǎng)缺陷型標記等。利用上述這些傳統(tǒng)的標記存在的問題是操作難度大、步驟煩瑣、成本高，有些標記可造成對染色體的損害，并且有些標記在加上后無法通過簡單的手段脫去標記，而抗性標記的存在經常會造成菌株中目的蛋白產量的下降。因此，本領域迫切需要找到一種適合用于工業(yè)微生物育種的，易于操作的菌株選擇標記手段。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于提供一種制備原生質體融合的菌株的方法。本發(fā)明的另一目的在于提供利用所述方法進行多拉菌素生產菌育種和改良的方法。在本發(fā)明的第一方面，提供一種制備原生質體融合的菌株的方法，所述方法包括(1)在適合原生質體融合的條件下，將第一親本菌株與第二親本菌株進行混合，形成第一親本菌株與第二親本菌株的混合物，其中，第一親本菌株含有攜帶第一抗性標記的質粒，第二親本菌株含有攜帶第二抗性標記的質粒，并且所述的第一抗性標記和第二抗性標記是不同的；和(2)從所述混合物中選出耐受第一抗性標記和第二抗性標記的菌株，從而獲得原生質體融合的菌株。在另一優(yōu)選例中，在步驟(1)之前，還包括步驟將攜帶第一抗性標記的質粒導入一親本菌株中，獲得第一親本菌株；和/或將攜帶第二抗性標記的質粒導入一親本菌株中，獲得第二親本菌株。在另一優(yōu)選例中，在步驟(2)之后，還包括步驟(3):從所獲得的原生質體融合的菌株中，進一步選出性能改良的菌株。在另一優(yōu)選例中，在步驟(3)之后，還包括以選出的性能改良的菌株作為第一親本菌株和/或第二親本菌株，重復步驟(1)-(3)1-1000次，從而獲得性能優(yōu)異的菌株。在另一優(yōu)選例中，在步驟(2)之后還包括步驟去除原生質體融合的菌株中攜帶第一抗性標記的質粒和/或攜帶第二抗性標記的質粒。在另一優(yōu)選例中，所述去除步驟是在非抗性選擇的條件下，繼續(xù)培養(yǎng)所述原生質體融合的菌株(如培養(yǎng)2-20代)，從而選擇出脫去攜帶第一抗性標記的質粒和/或攜帶第二抗性標記的質粒的原生質體融合的菌株。在另一優(yōu)選例中，所述的第一親本菌株和/或第二親本菌株是經誘變處理的。在另一優(yōu)選例中，第一抗性標記或第二抗性標記選自(但不限于)氨芐青霉素抗性標記(Amp)，阿伯拉霉素抗性標記(Apra)，壯觀霉素抗性標記(Spc)，硫鏈絲菌素抗性標記(Tsr)，卡那霉素抗性標記(Kn)，四環(huán)素抗性標記(Tetr)，氯霉素抗性基因(Cmr)。在另一優(yōu)選例中，所述的第一親本菌株和第二親本菌株來自相同的屬或種。在另一優(yōu)選例中，所述的第一親本菌株和/或第二親本菌株選自(但不限于)鏈霉菌、細菌、糖多孢菌、剌糖多孢菌等。更佳地，所述的鏈霉菌是除蟲鏈霉菌。在另一優(yōu)選例中，所述的第一親本菌株和/或第二親本菌株是bkdF基因和olmAl基因中斷的除蟲鏈霉菌。在本發(fā)明的第二方面，提供一種改良多拉菌素生產菌的方法，所述方法包括步驟(a)將除蟲鏈霉菌的bkdF基因中斷，獲得第一除蟲鏈霉菌；(b)將除蟲鏈霉菌的olmAl基因中斷，獲得第二除蟲鏈霉菌；(c)將步驟(a)獲得的第一除蟲鏈霉菌和步驟(b)獲得的第二除蟲鏈霉菌進行原生質體融合，獲得bkdF基因和olmAl基因中斷的除蟲鏈霉菌；(d)在前一步驟獲得的一部分bkdF基因和olmAl基因中斷的除蟲鏈霉菌中導入攜帶第一抗性標記的質粒；在另一部分bkdF基因和olmAl基因中斷的除蟲鏈霉菌中導入攜帶第二抗性標記的質粒，所述的第一抗性標記和第二抗性標記是不同的；(e)在適合原生質體融合的條件下，將(d)獲得的分別含有攜帶第一抗性標記的質粒和攜帶第二抗性標記的質粒的除蟲鏈霉菌進行原生質體融合，選擇耐受第一抗性標記和第二抗性標記的菌株，即為原生質體融合的菌株；和(f)鑒定(e)獲得的原生質體融合的菌株的多拉菌素產量，選擇多拉菌素產量高的菌株。在另一優(yōu)選例中，步驟(e)中，在進行原生質體融合前，進行原生質體誘變。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。圖1顯示了獲得Apra和Spc雙抗性且olmAl基因和bkdF基因中斷的菌株的融合示意圖。圖2顯示了pPFMkn質粒的示意圖譜。圖3顯示了pPFMtsr質粒的示意圖譜。圖4顯示了不同分子量的PEG對原生質體融合的影響的測試結果。圖5顯示了NTG誘變時間對于致死率的影響。圖6顯示了第一次融合后獲得的融合菌株進行第一批發(fā)酵，各菌株的效價分布圖。圖7顯示了第一次融合后獲得的融合菌株進行第二批發(fā)酵，各菌株的效價分布圖。圖8顯示了NTG誘變后發(fā)生誘變的菌株的效價分布。圖9顯示了第二次誘變融合后獲得的融合菌株進行發(fā)酵，各菌株的效價分布圖。圖10顯示了利用鏈霉菌作為親本來篩選發(fā)生原生質體融合的菌株的示意圖。具體實施例方式本發(fā)明人經過長期而廣泛的研究，首次公開一種利用標記質粒制備發(fā)生原生質體融合的菌株的方法。所述方法具有易標記，易脫去標記的優(yōu)點，可方便地用于進行基于基因改組技術的菌株育種和改良，操作簡單、成本低、設備要求低。在此基礎上完成了本發(fā)明。標記質粒通常工業(yè)生產菌株沒有標記，無法進行遺傳操作與改造。本發(fā)明人通過質粒載體對工業(yè)生產菌株進行遺傳標記，進而對其進行融合等改良。如本文所用，所述的"標記質粒"是指一種質粒，所述的質粒中含有抗性標記基因，所述的標記質粒在導入到菌株中后，可使得該宿主菌株產生相應的抗性。本發(fā)明對于所采用的抗性標記沒有特別的限制，只要其在被連接入質粒且導入到菌株中后，能夠使得該菌株與不帶有抗性標記的菌株相區(qū)分。所述的抗性標記包括但不限于氨芐青霉素抗性標記(A即)，阿伯拉霉素抗性標記(Apra)，壯觀霉素抗性標記(Spc)，硫鏈絲菌素抗性標記(Tsr)，卡那霉素抗性標記(Kn)，四環(huán)素抗性標記(Tetr)，氯霉素抗性基因(Cmr)等。攜帶抗性標記的菌株的選擇技術是本領域人員所熟知的。本發(fā)明對于可用于制備標記質粒的質粒沒有特別的限制，只要其具有可操作的位點，可被連接入抗性標記，并在被導入宿主菌株后能夠使該宿主菌株具備與所述抗性標記相應的抗性。通常，所述的標記質粒上還可操作地連接有其它功能性位點。包括但不限于啟動子、終止子、多克隆位點等。應理解，將特定的抗性標記連接入適當?shù)馁|粒，將該質粒導入到適當?shù)乃拗骷毎?，以及啟動子等的應用均是本領域常規(guī)的技術。與傳統(tǒng)的整合型標記，抗藥性標記等相比，質粒標記具有易標記，易脫去標記的特點。脫去抗性標記后，可進行后續(xù)的遺傳操作，如再次融合，基因操作等。與營養(yǎng)缺陷型標記，單親、雙親滅活等標記方法相比，該方法不傷害菌株染色體，有利于遺傳性狀的保持。與熒光標記、報告基因標記等方法向比，標記質粒的方法成本低，操作簡單，設備要求低。同時，標記質粒易于脫去，可避免因抗性標記表達帶來的產量下降問題。工業(yè)生產菌株一般不容易制備原生質體。即使可以，在制備原生質體的過程中，非原生質體化的菌絲仍然占大部分，這些非原生質體在再生過程中會先于原生質體而長出，并抑制原生質體的再生。此外，工業(yè)菌株原生質體再生效率低，只有將工業(yè)菌株帶上標記，才能高效地進行融合育種，防止非原生質體單位及未融合單位的干擾，篩選到真正的融合子。已發(fā)表的基因組改組技術(GenomeShuffling)對于原生質體制備、再生、融合等效率不高的大多數(shù)工業(yè)生產菌株而言是存在缺陷的，主要由于在原生質體再生的過程中非原生質體單位會先原生質體生長出，并抑制原生質體的再生，因此許多融合子會受到抑制，導致基因組改組的失敗。而利用標記質粒，則可通過正選擇，去除非原生質體單位，強制選擇出融合子。同時，在融合后又可去除標記，進行再一輪的改組。原生質體融合通過人為的方法，使兩株細胞的原生質體進行融合，以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過程，稱為原生質體融合。由此法獲得的重組子，稱為融合子。原生質體融合的一般操作步驟是將兩株特定的、帶有選擇性遺傳標記的細胞作為親本菌株置于等滲溶液中，用適當?shù)拿摫诿?如細菌和放線菌可用溶菌酶等處理，真菌可用蝸牛消化酶或其他相應酶處理)去除細胞壁，再將形成的原生質體聚集，加入促融合劑聚乙二醇(PEG)或借電脈沖等因素促進融合，然后用等滲溶液稀釋，再涂在能促使它再生細胞壁和進行細胞分裂的基本培養(yǎng)基平板上。待形成菌落后，通過特定的選擇方法(如抗性選擇)找到發(fā)生原生質體融合的菌株。本發(fā)明對原生質體融合的條件、方法和試劑沒有特別的限制，可以是本領域技術人員常規(guī)用于進行原生質體融合的條件、方法和試劑。原生質體融合可以實現(xiàn)菌株間的基因重組，可使遺傳物質傳遞更完整，可快速組合性狀，加速育種速度，可借助聚合劑同時將幾個親本的原生質體隨機地融合在一起，獲得綜合幾個親本性狀的重組體。制備原生質體融合的菌株的方法
技術領域：
：本發(fā)明提供了一種制備原生質體融合的菌株的方法，所述方法包括(1)在適合原生質體融合的條件下，將第一親本菌株與第二親本菌株進行混合，形成第一親本菌株與第二親本菌株的混合物，其中，第一親本菌株含有攜帶第一抗性標記的質粒，第二親本菌株含有攜帶第二抗性標記的質粒，并且所述的第一抗性標記和第二抗性標記是不同的；(2)從所述混合物中選出耐受第一抗性標記和第二抗性標記的菌株，從而獲得原生質體融合的菌株。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在步驟(1)之前，還包括步驟將攜帶第一抗性標記的質粒導入一親本菌株中，獲得第一親本菌株；禾口/或將攜帶第二抗性標記的質粒導入一親本菌株中，獲得第二親本菌株。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法還包括步驟在步驟(2)之后，還包括步驟(3):從所獲得的原生質體融合的菌株中，進一步選出性能改良的菌株。本領域人員可根據(jù)所需菌株的用途來進行選擇，獲得符合要求的改良菌株。利用本發(fā)明的方法，可進行多次的細胞融合以得到符合要求的新菌株。當分別攜帶兩種不同的標記質粒的兩種親本菌株進行混合，選擇到同時帶有兩種標記質粒的融合菌株后，可能會獲得某些方面性能改良的菌株。當該菌株還不能達到要求時，可以該菌株為親本菌株，進行新一輪的選擇。因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在步驟(3)之后，還包括以選出的性能改良的菌株作為第一親本菌株和/或第二親本菌株，重復步驟(1)-(3)，直至獲得性能優(yōu)異的菌株。由于經上述過程獲得的融合細胞中同時攜帶兩種標記質粒，因此，當需要使用所述融合細胞進行下一輪選擇時，可去除該融合細胞內的一種或兩種標記質粒后將之作為親本菌株用于下一輪選擇。當將兩種標記質粒均去除后，下輪選擇起始時需要分別在兩種親本菌株中重新導入不同的標記質粒；當去除其中一種標記質粒后，可直接用于下輪選擇。當然，本領域人員也可選擇不去除標記質粒，而在下輪選擇中導入新的標記質粒，該標記質粒攜帶的抗性標記不同于前一輪選擇中使用的抗性標記。因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在步驟(2)之后還包括步驟去除原生質體融合的菌株中攜帶第一抗性標記的質粒和/或攜帶第二抗性標記的質粒。由于本發(fā)明的方法采用標記質粒來賦予菌株抗性，其抗性標記并非整合于菌株的染色體上，因而在抗性選擇條件下可穩(wěn)定地選擇到攜帶標記質粒的菌株，而在非抗性條件下，易于選擇到丟失標記質粒的菌株。從菌株中去除標記質粒的步驟可以是在非抗性選擇的條件下，繼續(xù)培養(yǎng)所述原生質體融合的菌株(如培養(yǎng)2-20代)，從而選擇出脫去攜帶第一抗性標記的質粒和/或攜帶第二抗性標記的質粒的原生質體融合的菌株。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在進行原生質體融合前，還可進行原生質體誘變。該步驟是一個可選擇的步驟，進行原生質體融合本身即可獲得遺傳性狀改變的菌株；然而，當在融合前進行誘變步驟后，可提高獲得遺傳性狀改變的菌株的數(shù)量或遺傳性狀改變的幅度。本發(fā)明對于誘變方法或誘變劑的選擇沒有特殊的限制，采用的誘變方法比如可以是紫外照射法，采用的誘變劑比如可以是亞硝基胍(NTG)。本發(fā)明的方法對于所用的親本菌株的種類沒有特別的限制，所述方法適用于多種多樣的菌株。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的第一親本菌株和第二親本菌株可來自相同的屬或種。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的親本菌株選自(但不限于)鏈霉菌、細菌、糖多孢菌、刺糖多孢菌等。更佳地，所述的鏈霉菌是除蟲鏈霉菌。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的第一親本菌株和/或第二親本菌株是bkdF基因和olmAl基因中斷的除蟲鏈霉菌。作為本發(fā)明的具體實施方式，提供了一種利用鏈霉菌作為親本來制備發(fā)生原生質體融合的菌株的方法，所述方法的示意圖見圖10。親本l含有攜帶Kn抗性的pPFMkn質粒，親本2含有攜帶tsr抗性的pPFMtsr質粒，在進行原生質體融合后，染色體發(fā)生重組交換，并且融合菌株中同時含有攜帶Kn抗性的pPFMkn質粒和攜帶tsr抗性的pPFMtsr質粒，從而可在后續(xù)工作中通過tsr和kn雙抗性選擇來獲得融合菌株。改良多拉菌素生產菌的方法多拉菌素是一種在阿維菌素基礎上開發(fā)出的更高效低毒的農用抗生素。基于所述篩選原生質體融合的菌株的方法，本發(fā)明還提供了一種改良多拉菌素生產菌的方法，所述方法包括步驟(a)將除蟲鏈霉菌的bkdF基因中斷，獲得第一除蟲鏈霉菌；(b)將除蟲鏈霉菌的olmAl基因中斷，獲得第二除蟲鏈霉菌；(c)將步驟(a)獲得的第一除蟲鏈霉菌和步驟(b)獲得的第二除蟲鏈霉菌進行原生質體融合，獲得bkdF基因和olraAl基因中斷的除蟲鏈霉菌；由于代謝途徑的改變，該除蟲鏈霉素可產生多拉菌絲和阿維菌素；(d)在前一步驟獲得的一部分bkdF基因和olmAl基因中斷的除蟲鏈霉菌中導入攜帶第一抗性標記的質粒；在另一部分bkdF基因和olmAl基因中斷的除蟲鏈霉菌中導入攜帶第二抗性標記的質粒，所述的第一抗性標記和第二抗性標記是不同的；(e)在適合原生質體融合的條件下，將(d、獲得的分別含有攜帶第一抗性標記的質粒和攜帶第二抗性標記的質粒的除蟲鏈霉菌進行原生質體融合，選擇耐受第一抗性標記和第二抗性標記的菌株，即為原生質體融合的菌株；(f)鑒定(e)獲得的原生質體融合的菌株的多拉菌素產量，選擇多拉菌素產量高的菌株。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在進行原生質體融合前，進行原生質體誘變。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，步驟(f)中，選擇多拉菌素(Dm)產量相對高而阿維菌素(Av)產量相對低的菌株即優(yōu)選Av:Dm的比值低。在本發(fā)明中，通過對親本進行標記質粒，然后利用原生質體誘變融合，達到基因組改組的目的。利用該技術成功地提高了多拉菌素產生菌的優(yōu)良性狀，如抗生素產量、抗生素組分等。運用本發(fā)明的方法能迅速構建出新的工業(yè)生產菌株；能集中各個親本的優(yōu)勢；能迅速改變工業(yè)菌的特性；能在較小的群體中迅速篩選到性狀改良的菌株；對菌株無傷害；可進行連續(xù)地遺傳操作；同時用于標記的質粒具有廣泛的宿主范圍與良好的相容性，應用范圍廣，具有較高的應用價值。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于-本發(fā)明首次建立了一種新的制備原生質體融合的菌株一一利用標記質粒進行原生質體融合篩選。所述方法具有易標記，易脫去標記的優(yōu)點，脫去抗性標記后，可方便地進行后續(xù)的遺傳操作，如再次融合。利用本發(fā)明的方法，可方便地用于進行基于基因改組技術的菌株育種和改良，操作簡單、成本低、設備要求低?；谒鲋苽湓|體融合的菌株的方法，可進行一次或多次的原生質體融合選擇，從而獲得具有某一優(yōu)良性狀(例如高產多拉菌素)的菌株。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。I.材料和方法1.菌株除蟲鏈霉菌高產株畫R78，購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司，或也可購自美國農業(yè)研究機構保藏中心(NRRL)。2.培養(yǎng)基(1)原生質體菌絲培養(yǎng)基YEME培養(yǎng)基(每升)酵母膏3g，蛋白胨5g，麥芽膏3g，葡萄糖10g，蔗糖250g;對上述材料進行滅菌，滅菌后再加入:MgCl2.6H20(2.5M)0.2ml，甘氨酸(20%)2.5ml。(2)原生質體再生培養(yǎng)基西15培養(yǎng)基(每升)蔗糖K2SO,MgCl2.6H20糊精酪蛋白氨基酸微量元素溶液酵母膏加入2%瓊脂粉，NaOH(lM)KH'PO,,(0.5%)CaCl2.2H20(5M)L-pro(20%)200g，0.25g，10.12g，10g，0.lg，2ml，5g。高壓滅菌。滅菌后，每86.4ml加入;0.7ml，1.Oml，0.4ml，1.5ml，TES(O.25M，pH6.8)10ml。微量元素溶液(每升)ZnCl240mg,FeCl3.6H20200mg，CuCl2.2H20lOrag，MnCl2.4H20lOmg，Na2B407.跳OlOmg，(肌)6Mo7024.4H20lOtng。(3)阿維菌素發(fā)酵種子培養(yǎng)基每升中(pH7.2):200710043687.7淀粉25g，豆餅粉(熱榨)10g，酵母粉(東立)5g，花生餅粉10g，CoCl2(10%)0,3ml/L。(4)阿維菌素發(fā)酵培養(yǎng)基每升中(pH7.2):淀粉90g，黃豆餅粉(熱搾)20g，酵母粉(東立)12g，a-淀粉酶0.2g，a-CoCl2(10%)0.4ml/L。(5)多拉菌素發(fā)酵種子培養(yǎng)基每升中(pH7.1-7.3):淀粉20g，黃豆餅粉(熱搾)10g，葡萄糖5g，棉籽餅10g。(6)多拉菌素發(fā)酵培養(yǎng)基每升中(pH7.0):淀粉100g，黃豆粉10g，棉籽餅粉10g，淀粉酶0.2g，NaCllg'K2HP042g，MgS04lg，CaC037g。(7)除蟲鏈霉菌產孢培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基(每升)黃豆粉20g，D-甘露醇20g，瓊脂粉20g。(8)除蟲鏈霉菌生長培養(yǎng)基YMS培養(yǎng)基(每升)麥芽膏10g，可溶性淀粉4g，酵母粉4g，pH7.2-7.4。3.方法將標記質粒導入鏈霉菌采用接合轉移的方法，首先將標記質粒通過電轉導入大腸桿菌ET12567(參見美國專利US7217511)中，利用抗性平板選擇導入了標記質粒的菌株。挑單菌落于3ml試管過夜培養(yǎng)。次日，以5-10。/。的量轉接25mlLB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至0D=0.4-0.6。離心收菌，6000rpm，IO分鐘，棄上清。加入25-30mlLB培養(yǎng)基，將菌體打散，洗滌。以6000rpm離心，去上清，并重復一次。以6000rpm離心，去上清，將菌體打散在lral的LB培養(yǎng)基中。同時，進行鏈霉菌孢子預萌，將約108-109量的孢子加入到2XYT培養(yǎng)基中，5(TC熱激10分鐘，完后自然冷卻。取200ml左右用LB打散的大腸桿菌菌液與2XYT孢子懸液混合，以7000rpm離心10分鐘，打散在100ul體系中，涂布到MS培養(yǎng)基上。16-20小時后鋪上層。其中，每lral體系中含有25mg/ml的萘咬酮酸20-50ul，抗生素Apra(50mg/ml)25ul;spc(50mg/ml)25ul;tsr(50mg/ml)12.5ul;Kn(50mg/ml)12.5ul。用雙蒸水補至lml。3至5天后，接受質粒的鏈霉菌會長出。將轉化子在含萘啶酮酸與抗生素的MS板上傳一代，徹底殺死剩余的大腸桿菌。原生質體的制備接種菌株于50ml添加5mmol/LMgCl2、0.6%Gly的YEME培養(yǎng)基的250ml搖瓶中。28。C培養(yǎng)30-36小時。離心收集菌絲體(5000r/min，10min)。棄去上清液，將菌絲體懸浮于15ml10.3%的蔗糖溶液中，離心(5000r/min，10min)。重復一次。將菌絲體重懸于10ml含2mg/ml溶菌酶的改良P緩沖液中，37°〇處理120min。其間每5分鐘輕搖一次。完后用裝有脫脂棉的試管過濾，濾液轉入離心管中。離心(3000r/min，10min)，溫和地沉淀原生質體。棄去上清液，將原生質體懸浮于lml改良P緩沖液中，待用。其中，改良P緩沖液(每800ral)含蔗糖200g，K2S040,25g，MgCl2.6H201.22g，微量元素溶液2ml，分裝80ral/瓶；滅菌后，每瓶加入0.5%KH2P04，4.4%CaCl2.2H2010ml，0.25mol/LTES(p服.8)10ml。原生質體誘變(可選擇的步驟)稱取5mg左右的NTG加入到用lml改良P緩沖液打散的原生質體中，輕輕彈擊，上下顛倒，將NTG溶解。放置于30。C水浴處理30-45分鐘，立即加入到50ml的改良P緩沖液中稀釋，4000rpm離心10分鐘，棄上清。加入50ml改良P緩沖液洗滌，反復洗滌3次。完后離心收集，并打散于100-200ul的改良P緩沖液中，混勻，并盡量減小體積。原生質體融合將打散于100-200ul中的原生質體溶液加入到用P緩沖液配制的PEG4000溶液中，使得PEG4000的終濃度為45%-50%，并在30。C水浴中放置5分鐘。完后鋪腹15平板，每板10-200ul。在16-20小時后鋪軟瓊脂培養(yǎng)基上層。每板3ml。抗生素的用量Tsr(50mg,/ml)10ul，Kn(50mg/ml)10ul。在抗生素平板上生成的菌落為發(fā)生了原生質體融合的菌株。阿維菌素與多拉菌素的發(fā)酵方法將成熟斜面上的孢子用無菌接種鏟接種于種子搖瓶中，種子搖瓶裝量40ml/250ml三角瓶，于28°C220r/min培養(yǎng)24-48h。以5%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵搖瓶裝量50ml/250ml搖瓶，于28°C220r/min培養(yǎng)9-12d，最終pH6.6-7.5。Doramectin發(fā)酵在24h后每瓶加入225u1無菌的20%環(huán)己甲酸鈉，阿維菌素的發(fā)酵不需要添加任何前體。阿維菌素與多拉菌素的檢測方法阿維菌素產量的HPLC測定如下1.取lml發(fā)酵液加入4ml無水乙醇。2.28'C靜置過夜或超聲波破碎0.5-lh。3.12000r/min離心10min，取上清液直接用于HPLC分析。HPLC分析條件色譜柱AgilentZorbaxEclipseXDB-C84.6XI2.5(5um)檢測波長246nm流動相甲醇:水=85:15流速0.85ml/min多拉菌素產量的HPLC測定如下1.取lml發(fā)酵液加入4ml無水乙醇。2.28'C靜置過夜或超聲波破碎0.5-lh。3.12000r/min離心，取上清液直接用于HPLC分析。HPLC分析條件色譜柱AgilentZorbaxSB-C18460X250mm(5um)+AgilentZorbaxExtend-C184.6x150mm檢測波長246nm流動相甲醇:乙腈:水=81:7:12流速0.85ml/min標準品的配制方法阿維菌素Bla(由浙江海正藥業(yè)提供)lmg/ml，甲醇配制。多拉菌素標準品(由浙江海正藥業(yè)提供)500ug/ml，甲醇配制。效價與HPLC結果換算如下本文后續(xù)給出的單位均為效價，效價單位為ug/ml，利用HPLC測定產物濃度時，其單位為mg/100ml，而在取樣時又稀釋了5倍(lml菌液加入到4ral甲醇溶液中)，所以將HPLC的結果乘以50即得到最終的效價值。原生質體融合率的測定原生質體制備完成后，利用血球計數(shù)板計算每毫升中原生質體的數(shù)量，計作A。分別用PBuffer與0.01%的SDS水溶液稀釋后鋪RM15再生板，使用SDS稀釋后長出的為非原生質體單位，可計算出每毫升中的非原生質體單位數(shù)B。而用PBuffer稀釋后長出的為原生質體再生與非原生質體單位的總和，可計算出每毫升的總數(shù)C。融合后，稀釋鋪板，利用抗性篩選，得出每毫升中的融合子數(shù)目D。融合率R1-D/(C-B)。NTG致死率的測定原生質體制備完成后，利用血球計數(shù)板計算每毫升中原生質體的數(shù)量，計作A。分別用PBuffer與0.01%的SDS水溶液稀釋后鋪RM15再生板，使用SDS稀釋后長出的為非原生質體單位，可計算出每毫升中的非原生質體單位數(shù)B。而用PBuffer稀釋后長出的為原生質體再生與非原生質體單位的總和，可計算出每毫升的總數(shù)C。用NTG處理原生質體后，分別用PBuffer與0.01%的SDS水溶液稀釋后鋪RM15再生板使用SDS稀釋后長出的為非原生質體單位，可計算出每毫升中的非原生質體單位數(shù)E。而用PBuffer稀釋后長出的為原生質體再生與非原生質體單位的總和，可計算出每毫升的總合數(shù)F。致死率R2=N[(F-E)/(C-B)]。原生質體化產生的抗性突變率原生質體制備完成后，利用血球計數(shù)板計算每毫升中原生質體的數(shù)量，計作A。分別用PBuffer與0.01%的SDS水溶液稀釋后鋪RM15再生板，使用SDS稀釋后長出的為非原生質體單位，可計算出每毫升中的非原生質體單位數(shù)B。而用PBuffer稀釋后長出的為原生質體再生與非原生質體單位的總和，可計算出每毫升的總數(shù)C。再生時，鋪上含有相應抗性的上層，待生長3-5天后計數(shù)G。突變率R3=G/(C-B)。NTG誘變總突變率原生質體制備完成后，利用血球計數(shù)板計算每毫升中原生質體的數(shù)量，計作A。分別用PBuffer與0.01%的SDS水溶液稀釋后鋪RM15再生板，使用SDS稀釋后長出的為非原生質體單位，可計算出每毫升中的非原生質體單位數(shù)B。而用PBuffer稀釋后長出的為原生質體再生與非原生質體單位的總和，可計算出每毫升的總合數(shù)C。原生質利用NTG誘變相應時間后，再生，鋪上含有相應抗性的上層，待生長3-5天后計數(shù)H。NTG誘變總突變率R=H/C。質粒穩(wěn)定性測試將含有抗性質粒的鏈霉菌菌株先在非抗性平板上傳一代。再利用稀釋分單孢的方法，在非抗性平板上分單菌落傳一代，并得到單菌落。將鏈霉菌單菌落劃于抗性平板上生長，檢測每ioo株中非抗性菌落(質粒丟失的菌落)的比例。II.具體實施例實施例1利用融合構建多拉菌素產生菌1.畫R78的bkdF基因中斷株利用常規(guī)的PCR打靶技術，對MMR78的bkdF基因進行中斷，中斷位置為MMR78染色體第5356308至5357522個堿基。中斷后，該區(qū)段被oriT+spc基因替代，序列如SEQIDNO:1。利用spc抗性選擇獲得經過改造的菌株，獲得的菌株呈spc抗性。2.MMR78的olmAl基因中斷株利用常規(guī)的PCR打耙技術，對畫R78的olmAl基因進行中斷，中斷位置為MMR78染色體第3607909至3626345個堿基。中斷后，該區(qū)段被oriT+apra基因替代，序列如SEQIDNO:2。利用apra抗性選擇獲得經過改造的菌株，菌株呈apra抗性。除蟲鏈霉菌(Avermitilis)的相關序列信息可參考網(wǎng)站http://avermitilis.Is.kitasato-u.ac.jp/。3.融合方法融合方法的示意圖見圖1。將具有apra抗性且0lmAl中斷的鏈霉菌醒R78與具有spc抗性且bkdF中斷的鏈霉菌MMR78進行融合，通過apra和spc抗性選擇獲得具有apra和spc雙抗性且olmAl和bkdF中斷的融合菌株。4.融合后結果融合分平行的兩批進行，兩次的獲得的融合菌株分別是33株和10株，本發(fā)明人還測定這些融合菌株的阿維菌素和多拉菌素效價以及它們發(fā)酵生產的阿維菌素(Av)和多拉菌素(Dm)的比例，結果發(fā)現(xiàn)，在第一批融合后有6株融合菌株的效價較高，且Av/Dm數(shù)值較低(即Dm的產量相對比Av較高)；在第二批融合后有2株融合菌株的效價較高，且Av/Dm數(shù)值較低，可進一步用于后續(xù)選擇更優(yōu)的多拉菌素生產菌。實施例2標記質粒的原生質體融合誘變方法的建立1.標記載體pPBItsr的構建以內切酶Bell酶切plj702質粒(購自中科院微生物研究所)，獲得兩端攜帶BclI酶切位點的tsr-melC基因，將之克隆入經過BglII(Bell的同尾酶)酶切的pSP72質粒內，獲得pQC156質粒，該質粒含有tsr位點等。以天藍色鏈霉菌A3(2)(購自中科院微生物研究所)總染色體為模板，以正向弓i物GAATTCGCAGCGTGAAGTAGTACC(SEQIDNO:7)和反向引物GAATTCGGCCTCCTACTAGCGACC(SEQIDNO:8)進行PCR擴增，獲得兩端攜帶EcoRI酶切位點的SCP2-oriC基因，將之克隆入經過EcoRI酶切的pQC156質粒內，獲得pZR156質粒，該質粒含有tsr位點、SCP2位點等。以通用載體pIJ773(購自中科院微生物研究所)為模板，以正向引物AAATCTAGAGAGAATAGGAACTTCGGAATA(SEQIDNO:3)，反向引物CCGTCTAGAAAGTATAGGAACTTCGAAGTTCCC(SEQIDNO:4)擴增出apra-oriT基因，用XbaI酶切后，克隆入經同樣酶切的載體pZR156的Xbal酶切位點中，獲得標記載體pPFMtsr，該載體的圖譜見圖3。2.標記載體pPFMkn的構建以通用Cosmid載體Supercosl(購自Stratagene公司)為模板，以正向引物AAATCTAGACACGCTGCCGCAAGCACTCA(SEQIDNO:5)，反向引物CCGTCTAGAGATTCCGAAGCCCAACC(SEQIDNO:6)，擴增出卡那霉素抗性基因(Kn)，用Xbal酶切后連接入經同樣酶切的載體pKC1139(購自中科院微生物研究所)中，獲得標記載體pPFMkn，該載體的質粒圖譜見圖2。實施例3原生質體融合與誘變條件的選擇(1)PEG對于融合的影響分別在鏈霉菌MMR78的染色體上帶上Apra與Spc標記，獲得染色體中同時帶有Apra與Spc抗性標記的鏈霉菌塵R78;此夕卜，將前述制備的標記質粒pPFMkn與pPMFtsr導入鏈霉菌MMR78中；測試不同標記情況下不同分子量的PEG(分子量見表l)對原生質體融合的影響，融合方法以及融合率的測定如前述。不同分子量的PEG對原生質體融合的影響的測試結果見表1和圖4。從結果可以看出，隨著PEG分子量的增大，融合的效率提高。在PEG4000的條件下，染色體標記的融合率高于標記質粒的融合率，這可能是由于在原生質體制備的過程中，有小部分菌株的質粒發(fā)生了丟失。表1<table>complextableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>(2)NTG誘變時間對于致死率的影響由于誘變時的致死率與突變率相關，進而本發(fā)明人又測試了NTG誘變時的致死率，測試菌為鏈霉菌廳R78，在其中分別導入pPFMtsr和pPFMtkn。誘變的方法以及NTG致死率的測定如前所述。誘變劑量為5mg/ml，原生質體量為5.0X108-1.0X109。NTG誘變時間對于致死率的影響見表2和圖5。通過誘變致死曲線的繪制，確定了誘變時間與致死率的關系。在放線菌的誘變育種中，致死率高容易產生高產的突變，但整體的正向突變率低；致死率低不容易得到高產突變，但是正向突變率比較高。因此，本發(fā)明人分別選擇了75%的致死率與90%的致死率進行了融合誘變。同時，本發(fā)明人還測定了在NTG作用下產生Kn與tsr突變的概率，見表3，結果發(fā)現(xiàn)Kn與tsr的雙突變率小于l(T，因此，在進行誘變融合時挑到假陽性的概率很小。表2<table>complextableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表3<table>complextableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>實施例4標記系統(tǒng)的測試對實施例2構建的標記載體進行測試，即帶有tsr標記的pPFMtsr與帶有kn標記的pPFMkn。pPFMtsr所帶的oriC來自于scp2，pPFMkn的oriC來自于pSG5，這兩個oriC都具有較廣的宿主范圍，且pSG5屬于滾環(huán)復制，兩個oriC可以共存。鏈霉菌中的質粒，在沒有選擇壓力(如抗性)的條件下傳代時很容易丟失，本發(fā)明人所選擇的標記質粒pPFMtsr(標記l)與pPFMkn(標記2)在非抗性的條件下傳代時，都有一定的比例會丟失。同時，在制備原生質體的過程中，這兩個質粒又具有很好的穩(wěn)定性，因此這兩個標記適合作為原生質體融合時的標記質粒。該兩種標記質粒的特性以及測試結果見表4。表4<table>complextableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實施例5第一次誘變融合(1)第一次融合從實施例l獲得的融合菌株中選擇8株為出發(fā)菌株，用于融合誘變，這些菌株的效價高，但Av:Dm比例既有高值又有低值。具體的，這些菌株的效價介于145-195之間，平均效價(M)是164;Av:Dra值介于0.38:1-6.33:1之間。以期得到效價提高，組分改善的菌株。將上述出發(fā)菌株分為兩組，通過接合轉移的方法，一組菌株中轉入pPFMtsr，另一組菌株中轉入pPFMkn，將這些菌株進行原生質誘變融合，方法同前述。然后，在涂布有Kn和tsr的平板上篩選具有Kn和tsr抗性的菌株，即為發(fā)生融合的菌株。(2)第一次融合第一批發(fā)酵將(l)選擇出的一些發(fā)生融合的菌株進行發(fā)酵，統(tǒng)計獲得的菌株的效價范圍、處于該效價范圍內的菌株數(shù)量，效價的測定結果見表5和圖6。表5<table>complextableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>由結果可見，獲得一株效價高于200的菌株，經測定其效價為231，其產生的阿維菌素和多拉菌素的比例(Av:Dm)為3.39:1。效價提高幅度如下計算效價提高幅度S=((融合后最高效價H-對照菌株平均效價M)/對照菌株平均效價M)X100%=((23H64)/164)X100%二40.85%。但是，盡管融合菌株的效價有明顯提高，但沒有獲得效價高且多拉菌素產量高的菌株，這可能是由于高阿維比例的菌在融合中起到了優(yōu)勢作用。(3)第一次融合第二批發(fā)酵將(l)選擇出的另一些發(fā)生融合的菌株進行發(fā)酵，統(tǒng)計獲得的菌株的效價范圍、處于該效價范圍內的菌株數(shù)量，效價的測定結果見表6和圖7。其中有8個菌株的效價大于200。但這些效價高的菌株的阿維菌素和多拉菌素的比例(Av:Dm)介于4.03-6.47之間，均是生產阿維菌素量高于多拉菌素的菌株。在這些融合菌株中具有兩個菌株的Av:Dm比例分別是0.30:1和0.11:1，屬于多拉菌素生產占優(yōu)勢的菌株，然而其它們的效價分別是96和45，效價過低。<table>complextableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>經計算該批菌株的效價提高幅度為26.37%。因此，本批中盡管獲得一些效價高的菌株但多拉菌素生產占優(yōu)勢的菌株沒有，盡管獲得兩株菌株的Av:Dm比例較低(生產多拉菌素的量比阿維菌素多)，但它們的效價不是很高。實施例6單純NTG誘變以實施例1獲得的融合菌株為出發(fā)菌株(這些出發(fā)菌的平均效價是147)，用單純的NTG誘導突變，方法如下先按制備原生質體的方法制備突變菌株的原生質體。完成后，用NTG對原生質體誘變，誘變的方法以及NTG的用量與原生質體誘變融合的過程中所提及的方法相同。原生質體誘變后，在RM15培養(yǎng)基上再生，隨機挑選菌株進行發(fā)酵篩選。然后對選擇出的變異菌株進行發(fā)酵，統(tǒng)計獲得的菌株的效價范圍、處于該效價范圍內的菌株數(shù)量，效價的測定結果見表7。NTG誘變后發(fā)生誘變的菌株的效價分布見圖8。表7<table>complextableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>結果，在誘變后沒有效價高于140的菌株，因此單純使用NTG獲得的菌株的效價提高值是負值。實施例7第二次誘變融合(1)第二次融合從實施例l獲得的融合菌株中選擇6株菌株為出發(fā)菌株，用于融合誘變，該6株菌株的效價較高，且Av:Dm比例較低。具體的，這些菌株的效價介于129-165之間；Av:Dm比例介于0.3:1-0.70:1之間。將上述出發(fā)菌株分為兩組，通過接合轉移的方法，一組菌株中轉入pPFMtsr，另一組菌株中轉入pPF敗n，將這些菌株進行原生質誘變融合，方法同前述。然后，在涂布有Kn和tsr的平板上篩選具有Kn和tsr抗性的菌株，即為發(fā)生融合的菌株。(2)第二次融合發(fā)酵將前述選擇出的發(fā)生融合的菌株進行發(fā)酵，統(tǒng)計獲得的菌株的效價范圍、處于該效價范圍內的菌株數(shù)量，效價的測定結果見表8和圖9。結果顯示，獲得一株效價高于200的菌株(效價為220)和一株效價介于181-200的菌株(效價為181)。測定該兩個菌株的Av:Dm比例，分別是0.55:1和0.30:1。經計算，該兩株菌的效價提高幅度分別為49.66%%與22.45。表8<table>complextableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>上述結果可見，獲得兩株具有較高效價的菌株，并且組分Av:Dm比例值較低，可見相對來說該兩個菌株的多拉菌素產量較高。本發(fā)明的質粒標記的融合方法可用于其它各種菌株的融合和育種，并非限于鏈霉菌?？刹捎萌缟戏椒?，或者以選擇出的效價高且Av:Dm比例值低的菌株為出發(fā)菌株，進行進一步的選擇，從而找到效價更高且多拉菌素產量更高的理想菌株。綜上，從前述第一次以及第二次誘變融合結果中可以看出1.融合后的菌株的生理代謝情況可發(fā)生明顯變化，所得到的菌株的效價范圍從0到230均有。2.可選擇到效價提高的多拉菌素產生菌，第一次第一批中效價最高的菌上升了40.85%,第一次第二批中效價最高的菌上升了26.37%;在第二次融合所得到的結果中，最高的兩株菌分別上升了22.45%與49.66%。各批次中，最高效價均上升到了220-230左右。在第一次誘變融合中，本發(fā)明人將高組分與低組分的同時融合，以期望得到效價提高，組分改善的菌株。但遺憾的是，融合菌株的效價雖有明顯提高，但組分并未得到改善，這可能是由于高阿維比例的菌在融合中起到了優(yōu)勢作用(實施例5)。而在第二次誘變融合中，本發(fā)明人選擇了組分較好的菌進行融合，終于得到了兩株組分改善，產量提高的多拉菌素產生菌。它們的效價與組分已經達到了效價181、組分0.3:1與效價220、組分0.55:1(實施例7)，較為理想。同時，本發(fā)明人也看到由于鏈霉菌具有細胞壁，在制備原生質體的過程中，可能會存在非原生質體化單位。這些殘存的菌體會率先在再生培養(yǎng)基中長成菌落，并抑制周圍原生質體的再生，導致融合的失敗。而在實際操作中，通過誘變融合，每ioo個融合子中就有可能有性狀優(yōu)良的融合子，相對于誘變后大量篩選而言，也節(jié)省了工作量。因此，本發(fā)明人通過這項工作，建立了一種新的融合方法，并應用于育種中，提高了產量，保持了良好的組分。實踐證明，標記質粒的原生質體融合技術在工業(yè)育種中有著良好的前景。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。序列表<110〉中國科學院上海生命科學研究院<120〉利用基因組改組技術改良多拉菌素生產菌的方法<130〉073422<160〉8<170〉Patentlnversion3.3<20〉1<211>1412<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉oriT基因和spc基因融合基因<400〉1tgtaggctggagctgcttcgaagttcctatactttctagagaataggaacttcggaatag60g犯CttC3tgagctcagccaatcgactggcgagcggcatcttatttgccgactaccttgg120tgatctcgcctttcacgtagtggacaaattcttcc犯ctgatctgcgcgcgaggccaagc180gatcttcttcttgtccaagataagcctgtctagcttcaagtatgacgggctgatactggg240ccggcaggcgctccattgcccagtcggcagcgacatccttcggcgcgattttgccggtta300ctgcgctgtacca肌tgcgggacaacgtaagcactacatttcgctcatcgccagcccagt360cgggcggcgagttccatagcgttaaggtttcatttagcgcctcaaatagatcctgttcag420gaaccggatcaaagagttcctccgccgctggacctaccaaggcaacgctatgttctcttg480cttttgtcagcaagatagccagatcaatgtcgatcgtggctggctcgaagatacctgcaa540gaatgtcattgcgctgccattctccaaattgcagttcgcgcttagctggataacgccacg600gaatgatgtcgtcgtgcacaacaatggtgacttctacagcgcggagaeitctcgctctctc660caggggaagccgaagtttccaaaaggtxgttgaitca^agctcgccgcgttgtttcatcaa720gccttacggtcaccgtaacctatcactgtgtggcttcaggccgccatcca780ctgcggagccgtac犯atgtacggccagcaacgtcggttcgagatggcgctcgatgacgc840caactacctctgatagttgagtcgatacttcggcgatceiccgcttccctc3tgscattgc900actccaccgctgatgacatcagtcgatcatagcacgatcaacggcactgttgcaaatagt960cggtggtgatELaacttatcatccccttttgctgatggagctgcacatgaacccattcaaa1020ggccggcattttcagcgtgacatcattctgtgggccgtacgctggtactgcaaatacggc1080atca^gttaccgtgagctgcattttccgctgcataaccctgcttcggggtc1140ttttttcggtatatccatcctttttcgcacgatatacaggattttgccaaagggttcgtg1200tagactttccttggtgtatccaacggcgtc3gCCgggC3ggataggtgaagtaggcccac1260ccgcgsgcgggtgttccttcttcactgtcccttattcgcacctggcggtgctcaacggga1320atcctgctctgcgaggctggcgggaacttcgaagttcctatactttctag1380cttcgaactgcaggtcgacggatccccggaat141<210〉2<211〉1370<212〉腿<213〉人工序列<220><221〉misc—feature<223〉oriT基肉和apra基因的融合基因<400〉2tgt3ggctggagctgcttcg33gttCCt3tactttctagattcggsataig60gaacttatgagctcagccaatcgactggcgagcggcatcgcattcttcgcatcccgcctc120tggcggatgcaggaagatcaacggatctcggcccagttgacccagggctgtcgccacaat180gtcgcgggagcgg3tcaaccgagca,gcatgaccgactggaccttccttctgaaggct240cttctccttgagccacctgtccgccaaggcaaagcgctcacagcagtggtcattctcgag300ataatcgacgcgtaccaeicttgccatcctgaagaatggtgcagtgtctcggcaccccata360ggg犯cctttgccatcaactcggc,atgc,gtcgtgttggcatcgtgtcccacgcc420gaggagaagtacctgcccatcgagttcatggacacgggcgaccgggcttgcaggcgagtg480aggtggcaggggcaatggatcagatgatgeitctgctctgcctgtggccccgctgccgca犯540ggcaaatggatgggcgctgcgctttacatttggcaggcgccagaatgtgtcagagacaac600tccaaggtccggtgtaacgggcgacgtggcaggatcgaacggctcgtcgtccagacctga660ccacgagggcatgacgagcgtccctcccggacccagcgcagC3CgC3gggcctcgatcag720tccaagtggcccatcttcgaggggccggacgctacggaaggagctgtggaccagcagcac780accgccgggggtaaccccaaggttgagaagctgaccgatgagctcggcttttcgccattc840gt3ttgcacgacattgcactccaccgctgatgacatcagtcgatcatagcacgatcaacg900gcactgttgca犯tagtcggcttatcatccccttttgctgatggagctgc960acatgaacccattcaaaggccggcattttcagcgtgacatcattctgtgggccgtacgct1020ggtactgcaaatacggcatcagttaccgtgagctgcattttccgctgcataaccctgctt1080cggggtcattatagcgattttttcggtatatccatcctttttcgcacgatatacaggatt1140ttgccaaagggttcgtgtagactttccttggtgtatccaacggcgtcagccgggcaggat1200aggtgaagtaggcccacccgcgagcgggtgttccttcttcactgtcccttattcgcacct1260ggcggtgctc肌cgggaatcctgctctgcgaggctggcgggaacttcgaagttcctatac1320tttctagagaatagg33cttcgaactgcaggtCg3Cgg3tCCCCgg33ta1370<210〉3<211>30<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400>3aaatctagagagaataggaacttcggaata30<210>4<211〉33<212〉DNA<213〉人工序列<220〉<221>misc—feature〈223〉人工序列<400>4ccgtctagaaagtataggaacttcgaagttccc<210>5<211〉29<212〉腿<213〉人工序列33<220〉<221〉raisc_feature<223>引物<400>5犯atctagacacgctgccgcaagcactca<210〉6<211〉26<212〉DNA<213〉人工序列<220><221〉raisc一feature<223>引物<400>6ccgtctagagattccgaagcccaacc<210〉7<211>24<212〉廳<213〉人工序列<220〉<221〉raise—feature〈223〉引物<400〉7gaattcgcagcgtgaagtagtacc<210〉8<211〉24<212〉DNA<213〉人工序列〈220〉<221〉misc—feature<223〉引物<400〉8gaattcggcctcctactagcgacc權利要求1.一種制備原生質體融合的菌株的方法，其特征在于，所述方法包括(1)在適合原生質體融合的條件下，將第一親本菌株與第二親本菌株進行混合，形成第一親本菌株與第二親本菌株的混合物，其中，第一親本菌株含有攜帶第一抗性標記的質粒，第二親本菌株含有攜帶第二抗性標記的質粒，并且所述的第一抗性標記和第二抗性標記是不同的；和(2)從所述混合物中選出耐受第一抗性標記和第二抗性標記的菌株，從而獲得原生質體融合的菌株。2.如權利要求l所述的方法，其特征在于，在步驟(1)之前，還包括步驟將攜帶第一抗性標記的質粒導入一親本菌株中，獲得第一親本菌株；和/或將攜帶第二抗性標記的質粒導入一親本菌株中，獲得第二親本菌株。3.如權利要求l所述的方法，其特征在于，在步驟(2)之后，還包括步驟(3):從所獲得的原生質體融合的菌株中，進一步選出性能改良的菌株。4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，在步驟(3)之后，還包括以選出的性能改良的菌株作為第一親本菌株和/或第二親本菌株，重復步驟(1)-(3)1-1000次。5.如權利要求l所述的方法，其特征在于，在步驟(2)之后還包括步驟去除原生質體融合的菌株中攜帶第一抗性標記的質粒和/或攜帶第二抗性標記的質粒。6.如權利要求l所述的方法，其特征在于，第一抗性標記或第二抗性標記選自氨芐青霉素抗性標記，阿伯拉霉素抗性標記，壯觀霉素抗性標記，硫鏈絲菌素抗性標記，卡那霉素抗性標記，四環(huán)素抗性標記，氯霉素抗性基因。7.如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述的第一親本菌株和第二親本菌株來自相同的屬或種。8.如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述的第一親本菌株和/或第二親本菌株選自鏈霉菌、細菌、糖多孢菌、刺糖多孢菌。9.如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述的第一親本菌株和/或第二親本菌株是bkdF基因和olinAl基因中斷的除蟲鏈霉菌。10.—種改良多拉菌素生產菌的方法，其特征在于，所述方法包括步驟(a)將除蟲鏈霉菌的bkdF基因中斷，獲得第一除蟲鏈霉菌；(b)將除蟲鏈霉菌的olmAl基因中斷，獲得第二除蟲鏈霉菌；(c)將步驟(a)獲得的第一除蟲鏈霉菌和步驟(b)獲得的第二除蟲鏈霉菌進行原生質體融合，獲得bkdF基因和olmAl基因中斷的除蟲鏈霉菌；(d)在前一步驟獲得的一部分bkdF基因和olniAl基因中斷的除蟲鏈霉菌中導入攜帶第一抗性標記的質粒；在另一部分bkdF基因和olmAl基因中斷的除蟲鏈霉菌中導入攜帶第二抗性標記的質粒，所述的第一抗性標記和第二抗性標記是不同的；(e)在適合原生質體融合的條件下，將(d)獲得的分別含有攜帶第一抗性標記的質粒和攜帶第二抗性標記的質粒的除蟲鏈霉菌進行原生質體融合，選擇耐受第一抗性標記和第二抗性標記的菌株，即為原生質體融合的菌株；和(f)鑒定(e)獲得的原生質體融合的菌株的多拉菌素產量，選擇多拉菌素產量高的菌株。全文摘要本發(fā)明公開了一種利用標記質粒制備發(fā)生原生質體融合的菌株的方法，所述方法具有易標記，易脫去標記的優(yōu)點，可方便地用于進行基于基因改組技術的菌株育種和改良。所述方法操作簡單、成本低、設備要求低，并且不傷害菌株自身的染色體。文檔編號C12N15/03GK101343630SQ20071004368公開日2009年1月14日申請日期2007年7月12日優(yōu)先權日2007年7月12日發(fā)明者夏海洋,胡敏杰,覃重軍申請人:中國科學院上海生命科學研究院