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一種重組腺病毒在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法

文檔序號:434159閱讀:282來源:國知局
專利名稱:一種重組腺病毒在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域,具體地說是涉及一種攜帶人wwox基因的重組腺病毒在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用,特別是用于制備化療藥 增敏劑。
背景技術(shù)
肺癌是死亡率極高的惡性腫瘤,高發(fā)病率、低手術(shù)治愈可能性和化療療效反應(yīng)差是最主要的原因。肺癌中80%的患者為非小細(xì)胞肺癌, 大約40%的非小細(xì)胞肺癌被確診時已經(jīng)晚期,全身化療成為主要的治 療方法。但是我們不得不面對這樣的事實,那就是絕大多數(shù)非小細(xì)胞 肺癌(NSCLC)在體內(nèi)和體外都被證實對化療不敏感。腫瘤化學(xué)治療最大障礙之一是腫瘤細(xì)胞對藥物的耐受性。有些腫 瘤,如大腸癌細(xì)胞對藥物存在固有的抗藥性(Intrinsicresistance;consti tutiveresistance)亦稱原發(fā)性耐藥,在治療開始時就表現(xiàn)出對藥物的高 度耐受;另一些腫瘤,如乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、淋巴瘤等,化療開始時 有效,久用則產(chǎn)生抗藥,出現(xiàn)獲得性抗藥性(Acquiredresis Tance)亦稱 繼發(fā)性耐藥。原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性耐藥區(qū)別是:原發(fā)性耐藥是未接觸 藥物就已存在的,繼發(fā)性耐藥是接觸藥物后才產(chǎn)生的。多藥耐藥性 (multidrugresistance,MDR)是腫瘤細(xì)胞長期接觸某一化療藥物,不僅對 此種化療藥物產(chǎn)生耐藥,而且對其它結(jié)構(gòu)和功能不同的多種藥物產(chǎn)生 交叉耐藥性。腫瘤的多藥耐藥特性,其產(chǎn)生機制可歸納為四種類型 一般包括 一,細(xì)胞內(nèi)有效藥物濃度不足(一)藥物攝入不足;(二)藥物泵 出被細(xì)胞攝入的化療藥物在起效前,若被重新泵出,則使得藥效無 法發(fā)揮,這是導(dǎo)致胞內(nèi)有效藥物濃度不足的另一原因。①經(jīng)典多藥耐 藥(MDR, multidrug resistance);②非P-糖蛋白型多藥耐藥(也稱
MRP, multidrug resistance protein );③乳腺癌耐藥蛋白(BRCP, breast cancer resistance); ④月市耐藥相關(guān)蛋白(LRP, lung resistance-protein)。 (三)細(xì)胞內(nèi)藥物被"封閉"從而不能到達(dá)作用靶點,引起藥物相對 不足。二、通過干擾藥物作用機制、降低藥物活性產(chǎn)生耐藥。三、通 過DNA修復(fù)途徑產(chǎn)生耐藥腫瘤細(xì)胞自身的DNA修復(fù)功能可與化療藥 物的DNA毒性發(fā)生拮抗,導(dǎo)致耐藥。四、可以通過細(xì)胞凋亡相關(guān)改變 產(chǎn)生耐藥凋亡相關(guān)因子的異??梢鹉[瘤細(xì)胞對化療藥物(如紫杉 醇)的促凋亡作用不敏感。目前了解較清楚的凋亡相關(guān)因子包括p53、 Bcl-2、 NF-kB、 Rb等。研究已證實突變型p53加強腫瘤對化療的耐 受性,檢測p53的表達(dá)水平有助于對化療效果的評估。針對上述的臨床耐藥問題,有必要找出合適的方法克服化療的耐 藥性。多藥耐藥的克服途徑逆轉(zhuǎn)MD R的藥物稱為多藥耐藥修飾劑 (RM,resistancemodifer)或M D R逆轉(zhuǎn)劑。如l丐通道阻滯劑異博定 Ver(Vpl)、Psc833、托瑞米芬、三氟拉嗪、丁硫氨酸亞砜胺(B S O)等。理想的MD R逆轉(zhuǎn)劑最好具備:①對正常組織毒性小,安全性大; ②在體內(nèi)能達(dá)到體外有效藥物濃度;③本身具有一定的抗腫瘤作用; ④穩(wěn)定性好,體內(nèi)半衰期長;⑤代謝產(chǎn)物亦能有效。目前所發(fā)現(xiàn)的M D R逆轉(zhuǎn)劑遠(yuǎn)沒達(dá)到上述要求,并且目前所用RM大多毒性較大,在 體內(nèi)難達(dá)到體外有效濃度,因而臨床效果不理想。近年來隨著對腫瘤發(fā)病分子機制及細(xì)胞生長調(diào)控機理研究的深 入,腫瘤的基因治療研究取得了巨大的進展。研究人員根據(jù)腫瘤的類 型和分布,采用了多種技術(shù)來逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥,現(xiàn)在有許多己經(jīng)應(yīng)用到 了臨床試驗。如"今又生"(Gendicine,重組腺病毒-p53基因注 射液)已經(jīng)在臨床上使用,其主要通過以下機理特異性殺傷腫瘤細(xì)胞: 1)啟動腫瘤細(xì)胞凋亡信號通路;2)抑制腫瘤細(xì)胞生存信號傳遞;3) 抑制腫瘤組織血管生成及腫瘤細(xì)胞物質(zhì)及能量代謝;4)抑制腫瘤細(xì) 胞浸潤轉(zhuǎn)移;5)逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞放/化療抗性;6)阻滯腫瘤細(xì)胞周期 的運轉(zhuǎn),使腫瘤細(xì)胞處于嚴(yán)重冬眠狀態(tài);7)啟動"旁殺傷效應(yīng)",調(diào) 節(jié)機體免疫反應(yīng),殺傷腫瘤細(xì)胞。因此p53己經(jīng)作為化療藥物抗性的 逆轉(zhuǎn)劑。
臨床逆轉(zhuǎn)試驗的根本性突破有待于多藥耐藥機理的進一步明確, 隨著高效低毒逆轉(zhuǎn)劑的不斷發(fā)現(xiàn)并逐步用于臨床,基因治療的探索, 傳統(tǒng)的細(xì)胞毒藥物治療向分子靶向藥物治療過渡,應(yīng)用循證醫(yī)學(xué)指導(dǎo) 臨床實踐,最終解決惡性腫瘤的耐藥問題有待時日,并且有理由相信 基因治療對抗癌藥物的耐受性將在不久的將來逐漸占重要地位。目前研究表明,WWOX基因(genebank號NMJ)16373;網(wǎng)址 http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi db=nucleotide&val=770 6522)是跨越了整個常見染色體脆性部位FRA16D的一個新的抑癌基 因。WWOX蛋白含有414個氨基酸,在它的氨基末端有兩個麗結(jié)構(gòu)域, 麗結(jié)構(gòu)域主要與蛋白之間相互作用有關(guān),其中WWOX的鼎l區(qū)域特異 性結(jié)合細(xì)胞內(nèi)含有PPXY配體的蛋白;蛋白之間的這種相互作用是機體 抑癌基因通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制腫瘤生長所必需。在WWOX蛋白的 中心部位有一短鏈氧化還原酶功能域(SRD),結(jié)合WWOX基因在激素 調(diào)節(jié)組織如前列腺、卵巢癌高表達(dá),WWOX基因被推測為一參與性 激素調(diào)節(jié)的酶,在前列腺癌、卵巢癌中WWOX基因的頻發(fā)異常更加 支持上述推測。WWOX和甾體激素、乳腺癌致癌作用有重要的作用 和復(fù)雜的關(guān)聯(lián)。有研究報道,通過重組腺病毒(Ad-WW0X)和藥物誘 導(dǎo)系統(tǒng)(松甾酮A、 ponA),在肺癌細(xì)胞株中恢復(fù)WWOX的表達(dá),內(nèi) 源性鼎0X蛋白陰性的細(xì)胞株(A549, H460, and H1299)通過激活內(nèi)源 性凋亡caspase級聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。經(jīng)過重組腺病毒(Ad-WW0X) 和藥物(松甾酮A、 ponA)誘導(dǎo)系統(tǒng)兩種方法,異位表達(dá)WWOX導(dǎo)致 A549、 H460和H1299細(xì)胞株在裸鼠致腫瘤性受到顯著抑制。實驗證實 WWOX是一種抑癌基因,并且高效率抑制肺癌異種移植物的生長。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種重組腺病毒在制備抗腫瘤藥物中的 應(yīng)用,特別是在制備化療藥增敏劑(Chemosensitizer)中的應(yīng)用。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是構(gòu)建攜帶人WWOX基因的重組腺 病毒(Ad-WWOX),并進行WWOX逆轉(zhuǎn)A549/紫杉醇耐藥細(xì)胞 (A549/T)對化療藥物(紫杉醇和順鉑)耐藥的研究。本發(fā)明提供一種攜帶人wwox基因的重組腺病毒在制備抗腫瘤 上述應(yīng)用是指用于制備化療藥增敏劑,特別是肺癌化療藥增敏劑。所述的化療藥增敏劑也稱為多藥耐藥修飾劑或MD R逆轉(zhuǎn)劑。本發(fā)明的技術(shù)方案1. 構(gòu)建攜帶人WWOX基因的重組腺病毒通過細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒同源重組人全長wwox基因整合到腺病毒載體上,獲得重組腺病毒, 并制備和純化一定量的病毒顆粒;具體步驟首先構(gòu)建pDC316-IRES-EGFP質(zhì)粒;其次構(gòu)建攜帶人 WWOX基因的穿梭質(zhì)粒,命名為pDC316-WWOX-IRES-EGFP(如圖2所示)。 將pDC316-麗0X-IRES-EGFP與攜帶腺病毒基因組的骨架質(zhì)粒 pBHGloxAEl, 3Cre共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,兩者在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組, 形成攜帶人全長WWOX的重組腺病毒,命名為Ad-麗OX (如圖3所示)。2. 建立耐藥模型A549紫杉醇耐藥株和基因轉(zhuǎn)移方法,觀察腺 病毒在A549/T細(xì)胞的表達(dá);3. 通過體外藥敏實驗(CCK-8法),證明WWOX能顯著逆轉(zhuǎn)紫 杉醇和順鉑的耐藥性,尤其是對紫杉醇的耐藥性。本發(fā)明可逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞耐藥,為最終解決惡性腫瘤的耐藥問題提 供新的方法。本發(fā)明將使腫瘤對抗癌藥物的耐受性在不久的將來被逐 漸克服。


圖1是AdMax腺病毒包裝試劑盒中穿梭質(zhì)粒^pDC316質(zhì)粒的圖 譜圖2是pDC316- WWOX-IRES-EGFP的圖譜 圖3是Ad-WWOX的結(jié)構(gòu)示意4是感染Ad-WWOX-IRES-EGFP的A549/T細(xì)胞形態(tài) 其中A是感染Ad-WWOX-IRES-EGFP前A549/T細(xì)胞形態(tài) 相差倒置顯微鏡X100 B是感染Ad-WWOX-IRES-EGFP 48小時A549/T細(xì)胞形態(tài)相差倒置顯微鏡X100 C是感染Ad-WWOX-IRES-EGFP 48小時A549/T細(xì)胞形態(tài)
熒光顯微鏡xioo圖5是westblot檢測腺病毒感染A549/T后WWOX的表達(dá)
其中1泳道是感染Ad-IRES-EGFP的A549細(xì)胞 2泳道是感染Ad-IRES-EGFP的A549/T細(xì)胞 3泳道是感染Ad-WWOX-IRES-EGFP的A549/T細(xì)胞 4泳道是陽性對照MCF-7細(xì)胞
圖6是A549/T感染含目的基因腺病毒組和對照組的TAX生存曲線圖7是A549/T感染含目的基因腺病毒組和對照組的DDP生存曲線
具體實施例方式
現(xiàn)結(jié)合附圖和實施例,對本發(fā)明作進一步描述,但本發(fā)明的實施 并不僅限于此。
實施例l:重組腺病毒(Ad-WWOX)的構(gòu)建和制備
(一)重組腺病毒的構(gòu)建復(fù)制缺陷性腺病毒AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)(加拿大MicrobixBiosystems公司產(chǎn)品,穿梭質(zhì)粒-pDC316質(zhì)粒的圖譜如圖l所示,骨架質(zhì)?!猵BHGlox_El, 3Cre。)
293細(xì)胞為加拿大MICROBIX BIOSYSTEMS公司產(chǎn)品。 1. pDC316-IRES-EGFP質(zhì)粒構(gòu)建 1. 1從質(zhì)粒pIRES-EGFP上擴增序列IRES-EGFP設(shè)計引物(引物設(shè)計軟件oligo6.0),從質(zhì)粒pIRES-EGFP(購 自clontech公司)上擴增序列IRES-EGFP , 構(gòu)建質(zhì)粒 pDC316-IRES-EGFP。引物序列為
IRES up 5'-GCCAGTCGACACCGCATCGAGCTGA-3' IRES down 5'-CTGCCAAGTTGCTCGAAGTCGACT-3'利用引物IRES叩和IRES down從pIRES-EGFP質(zhì)粒上擴增片斷 IRES-EGFPPCR體系為名稱 ul IRES up 2 IRES down 2 dNTP 0.510Xprobest buffer 5 Probest 0.5H20 39 Template 1 Total 50 95度5min, 94度30sec, 60度30sec, 72度lmin30sec, 25cycles; 72度7min。1%瓊脂糖電泳,用PCR產(chǎn)物膠純化柱純化PCR產(chǎn)物。從 pIRES-EGFP擴增IRES-EGFP基因,條帶大小為723bp。1. 2載體和PCR產(chǎn)物均用酶Sal I酶切,用Sal I單酶切載體pDC316 的電泳條帶大小為3913bp;回收載體和PCR產(chǎn)物。1.3連接 體系名稱 體積(ul)Vector (Sal I) 4IRES-EGFP (Sal I) 4Ligase 0.510 X buffer 1.5H20 5Total 15 16度過夜連接,轉(zhuǎn)化,挑菌。 1.4篩選構(gòu)建好的載體用Hind lll單酶切鑒定,正確的載體能夠切 出大小為243bp的條帶,該質(zhì)粒的圖譜見圖2。 1.5經(jīng)英駿(Invitrogen)生物科技有限公司測序證實構(gòu)建成功。2. 構(gòu)建pDC316- WW0X-IRES-EGFP2. 1以pINCY-WWOX質(zhì)粒(美國open biosystens公司,CATALOG IHS1380-97652595)為模板,根據(jù)而0X的CDS序列合成上、下游引物
引物序列如下WW0X-EcoR I-UP: 5'-GGAATTCATGGCAGCGCTGCGCTACGCGGGGCTGGAC-3' WWOX-BamH I-DW: 5'-GGGATCCTTAGCCGGACTGGCTGCCAAGCCGTTC-3' PCR反應(yīng)參數(shù)如下94度30秒 58度30秒 72C 1分鐘 30個循環(huán),最后72度延伸5分鐘 結(jié)果從plNVY-WWOX質(zhì)粒上擴增WWOX基因,條帶大小為1259bp2.2酶切體系2. 2. 1 PCR產(chǎn)物用DNA膠回收試劑盒純化后,用EcoRI/BamHI雙酶切 酶切反應(yīng)體系如下■ 5ul (0.4 ug/ul)H Buffer(Roch) 3 ulEcoRI 1 ul (20u/ul)BamHI 1 ul (20u/ul)DD Water 20 ul37。C 3h酶切產(chǎn)物電泳后用膠回收試劑盒純化 2.2.2載體酶切體系同上,將BamHI換成BglII并將DNA量減半 2. 3連接與轉(zhuǎn)化按《分子克隆》操作手冊常規(guī)方法進行2.3. l連接反應(yīng)體系DNA (質(zhì)粒DNA+PCR酶切產(chǎn)物) 5ulLigation buffer (10x) lulddH20 3ulligase lulTotal 10ul 160C overnight 2. 3. 2構(gòu)建好的載體用EcoR I和Hind III雙酶切鑒定,正確的質(zhì)粒 應(yīng)該切出大小為1.3k的條帶;用PCR鑒定陽性克?。凰徒粶y序證實 與,測序由英駿(Invitrogen)生物科技有限公司完成。3. Ad5-WW0XLIRES-EGFP重組腺病毒毒種制備3. 1293細(xì)胞的培養(yǎng)和傳代將凍存的一管293細(xì)胞在37'C水浴輕輕晃動融化,融化后在超 凈臺無菌條件下用70%乙醇將凍存管的蓋沿檫拭干凈,加入 10mll0。/。DMEM重懸,600Xg離心5分鐘,棄上清后用10mllO。/。DMEM重 懸,輕輕打勻,轉(zhuǎn)入75cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),在5。/。C02孵箱中37。C培養(yǎng), 將生長至90%左右的細(xì)胞用PBS洗三次,室溫下胰酶消化30-120秒 使細(xì)胞脫落,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓、脫落,加入少許培養(yǎng) 基中止消化,吹打細(xì)胞,收集細(xì)胞,離心,稀釋細(xì)胞懸液,1: 3-5 轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶中。3.2雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,同源重組產(chǎn)生重組腺病毒腺病毒包裝系統(tǒng)AdMax (骨架質(zhì)粒pBHGlox_El, 3Cre,穿梭質(zhì)粒pDC316-WW0X-IRES-EGFP) 熒光觀察有(V )、無(),其它出毒時間轉(zhuǎn)染后第8天 收毒時間轉(zhuǎn)染后第ll天毒種名稱Ad5-WW0X-IRES-EGFP (圖3) 具體流程如下3. 2. 1轉(zhuǎn)染前一天,將293細(xì)胞接種于六孔板中,每孔5 X 105個細(xì)胞, 培養(yǎng)DMEM+1096胎牛血清,置37°(:含5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。 3. 2. 2轉(zhuǎn)染當(dāng)天換液,用新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培 養(yǎng)。待細(xì)胞生長至底面積的80-90%時,取骨架質(zhì)粒和穿梭質(zhì)粒,用 Lipofectamine2000脂質(zhì)體(invitrogen公司產(chǎn)品)按其所附說明書 進行轉(zhuǎn)染。具體步驟為1) 每個轉(zhuǎn)染孔取骨架質(zhì)粒4ug,穿梭質(zhì)粒lPg,混和均勻。2) 質(zhì)粒用300ul的DMEM培養(yǎng)液進行稀釋,室溫放置5min。 3) 取10 y 1的脂質(zhì)體用300 ul的DMEM培養(yǎng)液進行稀釋,室溫 放置5min。4) 將兩者混和,室溫避光放置30min。然后將混合物加入到細(xì) 胞中。3.2.3轉(zhuǎn)染后第二天,將長滿的細(xì)胞傳代于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,用 含5。/。胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),每天觀察,待細(xì)胞長滿瓶底 時,再傳入75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,每天觀察細(xì)胞出毒跡象。出毒現(xiàn)象 為細(xì)胞變大變圓,呈葡萄狀,并開始出現(xiàn)明顯噬斑。待細(xì)胞大部分病 變并從底部脫落進行收毒。3.2.4收毒將出毒的細(xì)胞培養(yǎng)瓶先后置于-7(TC冰箱和37。C水浴鍋 中反復(fù)凍融三次,使病毒從病變細(xì)胞中充分釋放。將凍融液3000rpm 離心5min,收集含病毒的上清液,棄沉淀。該上清即為第一代毒種(Pl),作為隨后大量病毒擴增的毒種。 3. 3毒種鑒定3.3.1引物上游WW0X-UP 、下游WWOX-DO麗(同實施例1 (一) 中2. 1中的引物)3.3.2擴增片段大小1200bp左右 3.3.3具體流程如下1) 模板準(zhǔn)備在25cm2細(xì)胞瓶中培養(yǎng)293細(xì)胞,待細(xì)胞生長至90%滿時,取上 述第一代毒種500u 1接種于細(xì)胞上,待細(xì)胞完全病變時按前述方法 凍融細(xì)胞三次,離心收集病毒上清液,此即為第二代毒種(P2)。目的基因的PCR鑒定取50ixlP2毒種上清液,力口入2ul蛋白 酶K, 56。C溫育,煮沸10分鐘,冰浴冷卻,取1 u 1作為模板,用PCR水稀釋。2) PCR體系模板 lul■X-叩 0. 5ul麗OX-down 0.5ul10XPCRBuffer 2.5ul(2. 5uM)dNTP 2ul Taq 0.25ulddH20 18.25ul25ul3) PCR條件94°C 5min , 94°C 30s , 56°C 30s , 72°Clmin , 72°C 5min , 4°C-30Cycles。3.4毒種滴度測定重組腺病毒TCID50測定(Reed和Muench兩氏法,參考文獻Reed U, Muench H. A simple method for estimating fifty percent end points. Am J Hyg 1938:27:493-497)。 (二)病毒擴增與純化1) 毒種生產(chǎn)與粗純化在l個75cm2方瓶中接種4X 106 2 93細(xì)胞,培養(yǎng)過夜,待細(xì)胞生長 至9(Fo滿時,取2ml P2代毒種接種培養(yǎng)瓶內(nèi),24小時,顯微鏡下觀察 發(fā)現(xiàn)有60°/。細(xì)胞病變,44小時后細(xì)胞完全病變。收獲病變細(xì)胞混懸液 后,凍融三次,離心,取上清,按同樣方法接種于另外4個75 cri^方 瓶中,44小時完全出毒,收獲病毒,用于接種轉(zhuǎn)瓶。在每個轉(zhuǎn)瓶中接 種1.8X108個293細(xì)胞,共接種4個轉(zhuǎn)瓶,等細(xì)胞生長至90%融合時, 按10ml/轉(zhuǎn)瓶(M0I約為1)接種第2步收獲的病毒上清,染毒后70小時 收獲病變細(xì)胞混懸液。混懸液3000rpm離心,棄上清,細(xì)胞沉淀用腺 病毒保存液重懸浮,反復(fù)凍融三次,6000rpm離心,取上清,即為粗 純化的重組腺病毒Ad5-麗0X病毒液,分裝保存于-70。C冰箱中(短期 內(nèi)使用可保存于4'C)。2) 病毒的純化反復(fù)擴增腺病毒至需要病毒量,氯化銫密度梯度離心純化病毒, 預(yù)冷離心機轉(zhuǎn)頭至4'C, 50ml離心管12000g,十分鐘,取上清,棄沉淀, 每lml上清加入lml20%PEG8000/2. 5M NaCL,混勻,冰浴1小時,4 。C,12500g,30分鐘,棄上清,沉淀充分重懸于5mlCsCL l.lg/ml,4 t:,8000g,5分鐘,取上清,在超速離心管中緩慢加入2ml CsCL 1.4 g/ml,非常小心輕輕順管壁加入另一層3ml CsCL 1.3 g/ml,沿管壁小 心加滿病毒顆粒,約5ml上清l. lg/ml,平衡離心管,4°C, 60, 000g離心2
小時,取出離心管,固定于離心管架上,用5ml注射器,18G針頭,在病毒 層的最低點刺破管壁,在CsCLl. 3g/ml和CsCL1. 4g/ml交界處吸出病毒 顆粒層,病毒層溶液轉(zhuǎn)移到一個無菌的容器,4'C,透析過夜,換液三次, 病毒置于-8(TC保存。(三)實驗?zāi)P团c基因轉(zhuǎn)移1) 構(gòu)建A549紫杉醇耐藥細(xì)胞株(短時間作用法)對數(shù)生長期(生長密度達(dá)60-70%)的A549細(xì)胞(購自中國科學(xué)院 上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心)與泰素(紫杉醇、TAXOL,美國百時美 施寶公司產(chǎn)品)作用lh,細(xì)胞經(jīng)不含藥物的培養(yǎng)液洗滌后置入不含藥 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期(生長密度達(dá)80%)傳代,加大劑量重復(fù)上 訴誘導(dǎo)過程。TAX0L10—100ng/ml,從低濃度開始,每次上升幅度為 10ng/ml,中毒征象(細(xì)胞增殖減慢、細(xì)胞漿顆粒明顯增多)時停用 藥物刺激,常規(guī)培養(yǎng)(1: 2傳代,增加胎牛血清濃度至12-15%),中 毒征象好轉(zhuǎn)(細(xì)胞顆粒減少、增殖正常)后繼續(xù)加藥刺激。歷時6月, 獲得在100ng/ml TAXOL中生長狀態(tài)良好的A549/T細(xì)胞株。2) 基因轉(zhuǎn)移A549/T細(xì)胞撤TAX0L—周后按2-4X 107孔接種于六孔板中,每孔 補充DMEM培養(yǎng)液至2.5ml,細(xì)胞貼壁生長24小時后,細(xì)胞密度達(dá) 85-90%,吸凈每孔培養(yǎng)基。選擇兩孔為T+組(即A549/T+),加 Ad-WWOX-IRES-EGFP+1640完全培養(yǎng)基(含胎牛血清及雙抗)IOOOUL, 十字形晃動培養(yǎng)板三次,放入孵箱5小時后,補足1640完全培養(yǎng)基至 每孔兩毫升,繼續(xù)放入孵箱,48小時后收集細(xì)胞以備后續(xù)的檢測。另 選兩孔加等量Ad-IRES-EGFP 50UL者(T-組,即A549/T-)及兩孔未加 腺病毒者(T組)為陰性對照,培養(yǎng)方法同T+組。同時,A549細(xì)胞按 l-2X106/孔接種于六孔板中,每孔補充1640培養(yǎng)液至2. 5ml,細(xì)胞貼 壁生長,細(xì)胞密度達(dá)85-90y。用Ad-IRES-EGFP50UL感染接種于A549 (A-組,艮卩A549—組)。(四)攜帶綠色熒光蛋白的重組腺病毒(Ad-EGFP)在A549/T細(xì) 胞中的表達(dá)熒光纖維鏡下觀察熒光蛋白的表達(dá):A-組、T-組和T+組細(xì)胞感染 腺病毒24-48小時后在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白(EGFP)的 綠色熒光(圖4)。WESTEN-BLOT法檢測麗OX的表達(dá):MCF-7、 A549/T+細(xì)胞均見大小為 46KDa雜交信號帶,A549-和A549/T-細(xì)胞未見雜交條帶,其中46KDa 位置的信號條帶與文獻報告一致,證實腺病毒攜帶的麗OX目的基因成 功表達(dá)(圖5)。兔抗WW0Xl+4多克隆抗體(abl4691)采用英國ABcom公司產(chǎn)品。實施例2:重組腺病毒介導(dǎo)人WWOX基因?qū)θ朔蜗侔┘?xì)胞耐藥基因 治療的實驗研究(一)肺腺癌耐藥細(xì)胞耐藥性基因治療檢測(體外藥物敏感性實驗 -CCK-8法)A549/T+組、A549/T-組和A549-組生長達(dá)80%感染Ad (MOI: 50), 48小時收集細(xì)胞;加入96孔培養(yǎng)板中(100ul完全培養(yǎng)基+8000個細(xì) 胞/孔),培養(yǎng)12小時,加入不同濃度的CDDP (澳大利亞科鼎制藥有 限公司產(chǎn)品)或TAX (每孔設(shè)三個復(fù)孔);37。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時, 接真空泵的一次性輸液針頭吸盡所測孔培養(yǎng)液,加入完全培養(yǎng)基(預(yù) 混的5ul CCK-8+100ul含10。/o胎牛的培養(yǎng)基/ L),培養(yǎng)3. 5小時;測 定450nm吸光度(參比波長650nm),計算細(xì)胞存活率公式細(xì)胞 存活率(%) =[ (A1-A3) / (A2-A3)],其中,Al:實驗孔(含有細(xì) 胞的培養(yǎng)基、CCK-8、化療藥物)A2:對照孔(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、沒有化療藥物)、A3:空白 孔(不含細(xì)胞和化療物質(zhì)的培養(yǎng)基、CCK-8);通過excel表計算IC50 值;計算耐藥指數(shù)(RI)^耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50,計算逆轉(zhuǎn)倍 數(shù)(RF):A549/T-細(xì)胞IC50/A549/T+細(xì)胞IC50 (RK5為低度耐藥, RI5-15為中度耐藥,RI〉15為高度耐藥);統(tǒng)計學(xué)處理:兩組均數(shù)比較 采用t檢驗,IC50計算采用加權(quán)直線回歸分析。Cell counting kit-8 (CCK-8)試劑盒采用DOJIDO株式會社同 仁化學(xué)研究所產(chǎn)品。 (二)肺腺癌耐藥細(xì)胞株對紫杉醇和順鉑耐藥基因治療的效果采用CCK-8法進行了體外藥物敏感性分析,計算出A549-、 A549/T-、 A549/T+三組細(xì)胞對不同藥物的細(xì)胞生存率(圖6和7),按
照所得細(xì)胞生存率的數(shù)據(jù)計據(jù)計算IC50、 RI和RF (表l, 2)。 表1 Ad-WW0X感染A549/T細(xì)胞對化療藥物的IC50值(均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差,ug/ml)A549-A549/T-A549/T+TAXOL 0.05 ±0.010. 97±0. 05 *0. 36±0. 01 *DDP0.02±0.010. 39±0, 01 *0. 14±0.01 ** A549/T+和A549/T-細(xì)胞IC50值相比,p<0. 01表2感染腺病毒的A549/T細(xì)胞的耐藥指數(shù)(RI)和麗OX對耐藥的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(RF)耐藥指數(shù)— 逆轉(zhuǎn)倍數(shù)A549/T-A549/T+泰素 21.398. 012. 69順鉑 13.997. 151. 96由表1可見,感染含WWOX的腺病毒后A549/T(T+)細(xì)胞和感染空 腺病毒載體的A54T(T-)細(xì)胞,兩組細(xì)胞經(jīng)TAXOL或CCDP分別作用72 小時,體外藥敏實驗(CCK-8法)測定IC50值,T+組IC50較T-組低,t 檢驗發(fā)現(xiàn)有顯著差異(-0.01),因此,冊0X增強耐藥細(xì)胞對TAX和 CDDP敏感性的結(jié)論。由表2可見,A549/T感染空腺病毒載體組(T-)和感染麗0X腺 病毒組(T+),經(jīng)泰素作用72小時,逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2. 69;耐藥指數(shù)從21. 39 下降至8. 01,即從高度耐藥降至中等度耐藥,充分說明A549/T細(xì)胞對 泰素敏感性增強,耐藥性下降。A549/T感染空腺病毒載體組(T-)和 感染W(wǎng)WOX腺病毒組(T+)加順鉑作用72小時,逆轉(zhuǎn)倍數(shù)達(dá)1.96;72 小時耐藥指數(shù)分別從13. 99下降至7. 15,說明A549/T細(xì)胞對順鉑敏 感性增強,耐藥性下降。因此,從定量角度上講,可得出WW0X顯著增強 了耐藥細(xì)胞對TAXOL和CDDP (尤其是TAX0L)的敏感性的結(jié)論。
權(quán)利要求
1、一種重組腺病毒在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用,其中所述的重組腺病毒攜帶人WWOX基因。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,所述的重組腺病毒用于制備化療藥 增敏劑。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用,所述的重組腺病毒用于制備肺癌化 療藥增敏劑。
4、 根據(jù)權(quán)利要求l、 2或3所述的應(yīng)用,所述的重組腺病毒是通過細(xì) 胞內(nèi)質(zhì)粒同源重組人全長WWOX基因整合到腺病毒載體上獲得的。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用,其中的腺病毒載體是AdMax腺病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域。肺癌是死亡率極高的惡性腫瘤,全身化療成為主要的治療方法,但決大多數(shù)NSCLC在體內(nèi)和體外都被證實對化療不敏感。本發(fā)明的目的是提供一種攜帶人WWOX基因的重組腺病毒在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用,特別是用于制備化療藥增敏劑。本發(fā)明首先構(gòu)建攜帶人WWOX基因的重組腺病毒,然后建立耐藥模型A549紫杉醇耐藥株和基因轉(zhuǎn)移方法,觀察腺病毒在A549/T細(xì)胞的表達(dá);最終通過體外藥敏實驗證明WWOX能顯著逆轉(zhuǎn)紫杉醇和順鉑的耐藥性。本發(fā)明可逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞耐藥,為最終解決惡性腫瘤的耐藥問題提供新的方法。
文檔編號C12N15/861GK101130092SQ20071004384
公開日2008年2月27日 申請日期2007年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月17日
發(fā)明者吳俊杰, 強 李 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)
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