專利名稱：用于造血細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物反應(yīng)器系統(tǒng)，具體地說涉及一種用于造血細(xì)胞體 外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)。
技術(shù)背景造血干細(xì)胞是一種具有高度的自我更新和多向分化能力的成體干細(xì) 胞。造血干細(xì)胞移植已被廣泛應(yīng)用于惡性血液病、非惡性難治性血液病、 遺傳性疾病和某些實體瘤的治療。還可以通過細(xì)胞因子誘導(dǎo)造血干細(xì)胞向 紅系、粒系和巨核細(xì)胞/血小板分化，用于成分輸血和治療腫瘤放療、化療 所致的中性粒細(xì)胞和血小板減少等癥。臍血是優(yōu)良的造血干細(xì)胞來源，具 有來源豐富，采集方便；造血干細(xì)胞含量豐富，原始干/祖細(xì)胞比例高；免 疫排斥性低；對供體無傷害等優(yōu)點，在臨床上日益受到關(guān)注。但每份臍血 的造血干細(xì)胞數(shù)量有限，單份斷血僅能滿足較低體重兒童的移植需要。所 以為了拓寬臍血造血干細(xì)胞的臨床應(yīng)用，需要對臍血造血干細(xì)胞進(jìn)行體外 擴增來增加其數(shù)量并保持其生物學(xué)特性。理想的造血干細(xì)胞體外培養(yǎng)方式是模擬造血干細(xì)胞的體內(nèi)生長環(huán)境， 使造血干細(xì)胞體外擴增同時又保持其體內(nèi)造血重建的生物學(xué)功能。造血干 細(xì)胞的體外擴增主要有兩種方法(1)有基質(zhì)細(xì)胞支持的造血細(xì)胞共培養(yǎng)； (2)無基質(zhì)細(xì)胞作用的造血細(xì)胞單獨培養(yǎng)?；|(zhì)細(xì)胞主要是通過分泌細(xì)胞因子刺激或支持造血干細(xì)胞的擴增，但 人源的基質(zhì)細(xì)胞系較難獲得，異源基質(zhì)細(xì)胞與人造血干細(xì)胞共培養(yǎng)擴增不 能滿足臨床應(yīng)用的要求。而隨著基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的細(xì)胞因子被成功鑒 定和克隆表達(dá)，使用細(xì)胞因子組合促使造血干細(xì)胞擴增成為可能。目前應(yīng) 用于無基質(zhì)造血干細(xì)胞的培養(yǎng)模式有靜態(tài)培養(yǎng)、動態(tài)培養(yǎng)和細(xì)胞固定化培養(yǎng)。靜態(tài)培養(yǎng)是造血干細(xì)胞的體外擴增培養(yǎng)中最常用的一種方式，它在較 簡單的培養(yǎng)裝置中進(jìn)行，包括孔板、方瓶以及透氣培養(yǎng)袋等。它具有操作 簡便、細(xì)胞易于收獲等優(yōu)點，但由于缺少混合，使得培養(yǎng)環(huán)境不均一，培養(yǎng)基中pH、溶氧、營養(yǎng)物(細(xì)胞因子)和代謝物存在濃度梯度，此濃度梯 度還會由于初始條件如接種密度、細(xì)胞類型的分布、培養(yǎng)基成分和細(xì)胞的 擴增程度不同而在各批培養(yǎng)之間造成很大的差異。與靜態(tài)培養(yǎng)相比，動態(tài)培養(yǎng)能提供了均一的生長環(huán)境，具有良好的混 合和傳質(zhì)效果，便于培養(yǎng)參數(shù)的在線檢測和控制，有利于過程放大，己成 功地應(yīng)用于動物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。如Zandstra等報道的攪拌式反應(yīng)器已 成功應(yīng)用于造血干細(xì)胞的體外培養(yǎng)，然而，由于造血干細(xì)胞對剪切力相當(dāng) 敏感，攪動會影響表面標(biāo)志的表達(dá)，包括細(xì)胞因子受體，這在一定程度上 影響了造血干細(xì)胞的增殖和分化。而且攪拌會使細(xì)胞與細(xì)胞間處于相對分 散的狀態(tài)，這不利于細(xì)胞之間的相互作用。采用連續(xù)灌注培養(yǎng)方式能增加培養(yǎng)基的交換速率和可溶生長因子的供 應(yīng)，改善傳質(zhì)限制，維持主體培養(yǎng)基的相對均一性，且不會對造血干細(xì)胞 造成機械損傷。如Sandstrom， C.E. et al. (1996) Development of novel perfusion chamber to retain nonadherent cells and its use for comparison of human 'mobilized' peripheral blood mononuclear cell cultures with and without irradiated bone marrow stroma.萬z'otec/zwo/. 50， 493—504所t艮道的 瞿、注式培養(yǎng)體系。這種培養(yǎng)腔底部有多個微槽(與培養(yǎng)基流動方向垂直)，可 以很好地將細(xì)胞保留在腔內(nèi)，促進(jìn)細(xì)胞間通訊。并且提供了較均一的培養(yǎng) 環(huán)境，但收獲細(xì)胞較困難。而譚文松等發(fā)明的"一種造血細(xì)胞灌注培養(yǎng)方法 和裝置"(中國專利ZL200410016212.5)，雖然能實現(xiàn)連續(xù)灌注培養(yǎng)，但細(xì)
胞處于懸浮離散狀態(tài)，存在細(xì)胞與細(xì)胞之間通訊困難的缺欠。造血干細(xì)胞固定化培養(yǎng)是指利用有孔載體或類似于胞外基質(zhì)的材料， 模擬骨髓微環(huán)境的特點，將造血細(xì)胞限制在一定的生長范圍內(nèi)，使細(xì)胞高 密度生長。由于三維培養(yǎng)系統(tǒng)改善了細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用， 因此，構(gòu)建的三維微環(huán)境有促進(jìn)造血細(xì)胞增殖，然而造血細(xì)胞固定化培養(yǎng) 的最顯著缺點是細(xì)胞收獲不如懸浮培養(yǎng)那么簡便。在體內(nèi)，造血干細(xì)胞居于骨髓內(nèi)，骨髓造血腔內(nèi)的生化參數(shù)如氧壓等 可能會決定造血干細(xì)胞的擴增和分化趨向。體外培養(yǎng)系統(tǒng)的氧分壓不同也 會影響造血干細(xì)胞的擴增和分化，有文獻(xiàn)報道，與常氧相比，在低氧情況 下，造血干細(xì)胞的擴增較少，但同時分化也較少，較原始的造血干細(xì)胞所 占的比例較高。因此，控制體外培養(yǎng)系統(tǒng)的氧分壓，有望獲得更好的細(xì)胞 擴增效果。造血干細(xì)胞在體內(nèi)分布于骨髓腔內(nèi)，其周圍有許多基質(zhì)細(xì)胞。這些基 質(zhì)細(xì)胞及其分泌的胞外基質(zhì)和生長因子等形成的造血微環(huán)境會影響造血干 細(xì)胞的增殖和分化，本反應(yīng)器通過設(shè)置在底面的肋條使細(xì)胞聚集在一定空 間范圍內(nèi)，加強了細(xì)胞間的通訊，克服了動態(tài)攪拌式反應(yīng)器的缺點；同時 又通過循環(huán)培養(yǎng)的方式，克服了靜態(tài)的缺點，減少了局部濃度梯度問題。 而且，造血干細(xì)胞在體內(nèi)是處于一種低氧的環(huán)境下，而本反應(yīng)器也能通過 氣體控制裝置體外調(diào)控氧分壓，所以說本反應(yīng)器比較適合造血干細(xì)胞的培 養(yǎng)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于造血細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)， 以克服現(xiàn)有培養(yǎng)過程和技術(shù)存在的缺陷，滿足細(xì)胞體外擴增的需要。 本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思發(fā)明人認(rèn)為，造血細(xì)胞體外培養(yǎng)過程會不斷產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物的和消耗
營養(yǎng)物。靜態(tài)培養(yǎng)無法消除因此帶來的濃度梯度；動態(tài)攪拌培養(yǎng)雖能及時 消除這種局部濃度梯度，但細(xì)胞處于分散的狀態(tài)，不利于細(xì)胞之間的相互 作用，且剪切力較大。發(fā)明人認(rèn)為，若能實現(xiàn)連續(xù)灌注或循環(huán)培養(yǎng)則可克 服以上缺點，而其中的反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)是十分關(guān)鍵的。本發(fā)明的用于造血細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，包括補料瓶、氣 體混合裝置和截面積為矩形的管狀反應(yīng)器；所說的管狀反應(yīng)器的一端的靠下部處設(shè)有進(jìn)液口，另一端靠上部處設(shè) 有出液口，靠近進(jìn)液口一端的上底面設(shè)有接種口，反應(yīng)器內(nèi)部下表面上設(shè)有肋條；所說的氣體混合裝置用于造血細(xì)胞體外培養(yǎng)所需要的空氣、氧氣、氮 氣和二氧化碳?xì)怏w的混合，并通過調(diào)節(jié)四種氣體的比例控制系統(tǒng)的氧分壓； 氣體混合裝置通過管線與補料瓶相連接； 進(jìn)液口與出液口分別通過管線與補料瓶相連通； 所說的混合氣體包括C02、 02、 N2和空氣；所說的造血細(xì)胞是指來源于骨髓、外周血和臍血的單個核細(xì)胞及造血 干/祖細(xì)胞，如CD34+細(xì)胞；本發(fā)明的反應(yīng)器是這樣操作的-在補料瓶中加入液體培養(yǎng)基，并添加血清和細(xì)胞因子，將造血細(xì)胞經(jīng) 接種口接種于反應(yīng)器；通過管線使培養(yǎng)基從進(jìn)液口經(jīng)過反應(yīng)器后，由出液 口回流到補料瓶，并使液體培養(yǎng)基的體積保持在補料瓶體積的10% 15%， 不斷循環(huán)直到反應(yīng)結(jié)束。整個培養(yǎng)在37'C恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行，并通過氣體混合裝置控制培養(yǎng)所 需的氧分壓。由上述公開的技術(shù)方案可見，本發(fā)明通過培養(yǎng)裝置底面局部的肋條使 細(xì)胞不會被流動的培養(yǎng)液沖出而起到截流細(xì)胞的作用，能較好地使細(xì)胞聚
集在一個有限的空間范圍內(nèi)，更好地發(fā)揮細(xì)胞間的相互作用。通過循環(huán)流 動培養(yǎng)液可減少局部濃度梯度，較好地解決局部濃度梯度所產(chǎn)生的生長抑 制問題。此外，連續(xù)灌注或循環(huán)培養(yǎng)類似靜態(tài)的培養(yǎng)方式還能減少攪拌反 應(yīng)器中細(xì)胞所受的剪切力的影響。由于補料瓶中氣體的體積遠(yuǎn)大于液體所 占的體積，能很好地起到緩沖的作用，減少了由于細(xì)胞呼吸帶來的氧分壓 的波動，從而彌補了較小型的反應(yīng)器無法對氧分壓進(jìn)行在線檢測、控制的 缺陷。


圖1為用于造血細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為用于造血細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意圖。 圖3為用于造血細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器俯視圖。
具體實施方式
參見圖1，所說的用于造血細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，包括補料 瓶(5)、氣體混合裝置(7)和截面積為矩形的管狀反應(yīng)器(1);參見圖2和圖3，所說的管狀反應(yīng)器(1)的一端的靠下部處設(shè)有進(jìn)液 口 (2)，另一端靠上部處設(shè)有出液口 (3)，靠近進(jìn)液口 (2) —端的上底面 設(shè)有接種口 (4)，反應(yīng)器(1)內(nèi)部下表面上設(shè)有肋條(6);所說的氣體混合裝置(7)用于造血細(xì)胞體外培養(yǎng)所需要的空氣、氧氣、 氮氣和二氧化碳?xì)怏w的混合，并對系統(tǒng)進(jìn)行氧分壓的控制;氣體混合裝置(7)通過管線與補料瓶(5)相連接；進(jìn)液口 (2)與出液口 (3)分別通過管線與補料瓶(5)相連通； 優(yōu)選的，所說的反應(yīng)器(l)的長度為寬度的3 10倍，比表面積為l 3厘米"，肋條間隔為0.5 1.0厘米，高度為0.05 0.2厘米； 比表面積的定義如下底面積與體積之比。優(yōu)選的反應(yīng)器采用低毒生物玻璃制作，如上海玻璃儀器一廠生產(chǎn)的GG17玻璃，反應(yīng)器內(nèi)部在使用前用硅化液(二甲基硅烷2%/甲苯)進(jìn)行硅 化處理。以下實施例中，管狀反應(yīng)器(1)的結(jié)構(gòu)參數(shù)如下 所說的反應(yīng)器(1)的長度為6.5厘米，寬度為1.5厘米，比表面積為2 厘米-1，肋條間隔為1.0厘米，高度為0.1厘米。 液體培養(yǎng)基的體積保持在補料瓶體積的10%。實施例1在補料瓶內(nèi)加入10ml含20XFBS(v/v)的IMDM培養(yǎng)基，并添加SCF、 FL、 TPO三種細(xì)胞因子，其濃度分別為50ng/ml、 50ng/ml和20ng/ml。從 新鮮臍血(取自國際和平婦幼保健院)中分離得CD34+細(xì)胞。用含20XFBS(v/v)的IMDM培養(yǎng)基(Gibco)懸浮，以lxl05cells/ml密度由接種口接 種于反應(yīng)器。分別采用循環(huán)與靜置兩種方式培養(yǎng)，循環(huán)培養(yǎng)時流速為lml /min，培養(yǎng)在含5。ZC02 (v/v)的37'C恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行。培養(yǎng)7天，測定 總細(xì)胞、CD34+細(xì)胞以及CD34+38—細(xì)胞的擴增倍數(shù)。在循環(huán)與不循環(huán)情況 下總細(xì)胞擴增分別為7.29倍和13.94倍；CD34+細(xì)胞含量分別為45.11%和 32.95%; CD34+細(xì)胞擴增情況分別為3.91倍和5.46倍；CD34+38鄰胞含量 分別為40.1%和10.8%; CD34+38,胞擴增情況分別為4.31倍和2.22倍。 由此可見，雖然循環(huán)條件下細(xì)胞的擴增不如不循環(huán)的情況，但循環(huán)條件更 有利于造血干/祖細(xì)胞(CD34+細(xì)胞)尤其是較原始的造血千/祖細(xì)胞(CD34+38-細(xì)胞)的擴增。實施例2在補料瓶內(nèi)加入10ml含20% (v/v) FBS的IMDM培養(yǎng)基，并添加 SCF、 IL-3、 IL-6三種細(xì)胞因子，其濃度分別為50ng/ml、 5ng/ml和20ng/ml。 從新鮮臍血(取自國際和平婦幼保健院)分離得CD34+細(xì)胞。用含20 % ( v/v )FBS的IMDM培養(yǎng)基(Gibco)懸浮，以I.lxl05cells/ml密度由接種口接種 于反應(yīng)器。靜置2小時后，以lml/min的流速不斷進(jìn)行循環(huán)。分別在在21 % (Wv)氧分壓(常氧)和5% (v/v)氧分壓(低氧)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。 培養(yǎng)7天，測定總細(xì)胞、CD34+細(xì)胞以及集落形成單位(CFC)的擴增倍數(shù)。 在常氧與低氧情況下總細(xì)胞擴增分別為15.27倍和4.77倍；CD34+細(xì)胞含量 分別為34.93%和33.74%; CD34+細(xì)胞擴增情況分別為5.33倍和1.61倍； 每1000個細(xì)胞生成的CFC集落數(shù)分別為18±2.83和18±1.41。9
權(quán)利要求
1.用于造血細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，包括補料瓶(5)和氣體混合裝置(7)，其特征在于，還包括截面積為矩形的管狀反應(yīng)器(1)；所說的管狀反應(yīng)器(1)的一端的靠下部處設(shè)有進(jìn)液口(2)，另一端靠上部處設(shè)有出液口(3)，靠近進(jìn)液口(2)一端的上底面設(shè)有接種口(4)，反應(yīng)器(1)內(nèi)部下表面上設(shè)有肋條(6)；氣體混合裝置(7)通過管線與補料瓶(5)相連接；進(jìn)液口(2)與出液口(3)分別通過管線與補料瓶(5)相連通。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于造血細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)， 其特征在于，所說的反應(yīng)器(1)的長度為寬度的3 10倍。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于造血細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)， 其特征在于，所說的反應(yīng)器(1)的比表面積為1 3厘米"。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于造血細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)， 其特征在于，肋條間隔為0.5 1.0厘米，高度為0.05 0.2厘米。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1 4任一項所述的用于造血細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反 應(yīng)器系統(tǒng)，其特征在于，反應(yīng)器采用低毒生物玻璃制作。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于造血細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)， 其特征在于，所說的造血細(xì)胞是指來源于骨髓、外周血和臍血的單個核細(xì) 胞及造血干/祖細(xì)胞。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的用于造血細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系 統(tǒng)，其特征在于，氣體混合裝置(7)混合的氣體包括C02、 02、 &和空氣。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于造血細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，包括補料瓶和氣體混合裝置，其特征在于，還包括截面積為矩形的管狀反應(yīng)器；所說的管狀反應(yīng)器的一端的靠下部處設(shè)有進(jìn)液口，另一端靠上部處設(shè)有出液口，靠近進(jìn)液口一端的上底面設(shè)有接種口，反應(yīng)器內(nèi)部下表面上設(shè)有肋條；氣體混合裝置通過管線與補料瓶相連接；進(jìn)液口與出液口分別通過管線與補料瓶相連通。本發(fā)明的優(yōu)點在于采用該生物反應(yīng)器系統(tǒng)可實現(xiàn)循環(huán)或連續(xù)灌注培養(yǎng)可減少局部濃度梯度，保持培養(yǎng)環(huán)境的均一。在培養(yǎng)過程中可根據(jù)需要調(diào)節(jié)反應(yīng)器內(nèi)的氧分壓。同時利用底面的肋條可使細(xì)胞截流、聚集，有利于細(xì)胞之間通訊，可更好地擴增造血干細(xì)胞并保持其原有功能。
文檔編號C12M3/00GK101130745SQ20071004474
公開日2008年2月27日 申請日期2007年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月9日
發(fā)明者平 華, 周美琴, 蔡海波, 譚文松 申請人:華東理工大學(xué)