專利名稱：：一種天然藍(lán)色素的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說(shuō)，是關(guān)于一種天然藍(lán)色素的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
：合成色素發(fā)明之前，人們一直使用天然色素。但是，由于合成色素具有色澤鮮艷，著色力強(qiáng)，穩(wěn)定性高，價(jià)格低，生產(chǎn)不受季節(jié)影響等諸多優(yōu)勢(shì)，因此，在合成色素出現(xiàn)后不久，就很快占據(jù)了色素市場(chǎng)的大部分市場(chǎng)份額。但是，隨著對(duì)合成色素安全性研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)很多合成色素對(duì)人體健康有害，因而天然食用色素的開發(fā)和應(yīng)用又重新得到人們的重視。但是在眾多的天然色素中大多為紅黃兩色，而藍(lán)色素卻很稀少，缺少了藍(lán)色素就調(diào)配不出綠色，紫色，棕色等等顏色，滿足不了食品上色、著色等需求，為此研究開發(fā)天然藍(lán)色素就成為急需解決的一項(xiàng)新課題。國(guó)內(nèi)對(duì)該色素的研究起步較晚，且多采用在培養(yǎng)基中直接加入梔子果粉方法生產(chǎn)天然色素，所得的產(chǎn)品其顏色多為灰暗帶紫，得率較低，難以工業(yè)化生產(chǎn)。后有研究者改進(jìn)生成方法，采用二步法(孫立軍等，用二步法生產(chǎn)天然使用梔子藍(lán)色素，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994,17(4):98—10U，先利用p-葡萄糖苷酶催化梔子苷反應(yīng)得到中間產(chǎn)物京尼平；然后將京尼平和氨基酸在適當(dāng)條件下反應(yīng)得天然梔子藍(lán)色素，得到的梔子藍(lán)色素色澤理想，但其反應(yīng)速率較低，影響了其工業(yè)化生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就在于進(jìn)一步改進(jìn)現(xiàn)有的天然藍(lán)色素的生產(chǎn)方法，從而提供一種新型的生產(chǎn)天然藍(lán)色素的方法。本發(fā)明的天然藍(lán)色素的生產(chǎn)方法包括p-葡萄糖苷酶催化梔子苷反應(yīng)得到京尼平，以及將京尼平和氨基酸在適當(dāng)條件下反應(yīng)得天然梔子藍(lán)色素，其特征在于，在|3-葡萄糖苷酶催化梔子苷得到京尼平的反應(yīng)中加入金屬酶促進(jìn)劑。根據(jù)本發(fā)明，所述金屬酶促進(jìn)劑包括Fe3+,Zn2+，Cu2+，Co2+，Mn2+。優(yōu)選的，所述金屬酶促進(jìn)劑的加入量為每L反應(yīng)體系中添加金屬酶促進(jìn)劑21—250昭。根據(jù)本發(fā)明，所述氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、組氨酸、精氨酸和谷氨酸鈉。根據(jù)本發(fā)明，所述p-葡萄糖苷酶可以通過黑曲霉發(fā)酵獲得，也可以通過市售的途徑購(gòu)買。根據(jù)本發(fā)明的方法，在反應(yīng)獲得梔子藍(lán)色素后，還包括對(duì)獲得的梔子藍(lán)色素進(jìn)行分離純化的步驟，具體通過對(duì)最后的反應(yīng)液進(jìn)行干燥獲得梔子藍(lán)色素，優(yōu)選的，所述加熱方法包括加熱干燥、真空干燥以及噴霧干燥。本發(fā)明的天然藍(lán)色素的生產(chǎn)方法，由于在反應(yīng)過程中添加了金屬酶促進(jìn)劑，因此可以顯著加快酶促反應(yīng)的速度，縮短反應(yīng)時(shí)間，從而節(jié)約生產(chǎn)成本，有利于工業(yè)化生產(chǎn)；同時(shí)，由于所添加的金屬離子均為人體所必需的微量元素，因此，所獲得的色素不僅沒有人工色素潛在的危害，相反具有很好的保健功能，可以廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)等各領(lǐng)域中。圖1A是濃度為0.05X的梔子苷的HPLC出峰圖，圖1B為實(shí)施例3的2#樣品反應(yīng)后剩余梔子苷的HPLC出峰圖。圖2是添加不同酶促進(jìn)劑對(duì)梔子苷轉(zhuǎn)化率和反應(yīng)時(shí)間的影響。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例中使用的菌種及試劑為黑曲霉為黑曲霉IFFI2230(購(gòu)自上海微生物所)，梔子苷購(gòu)自毫州市亞強(qiáng)天然產(chǎn)物制品廠，氨酸鈉(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司)，來(lái)源于苦杏仁的P-葡萄糖苷酶購(gòu)自FLUKA公司；以下實(shí)施例中使用的分析方法如下梔子苷的測(cè)定采用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定，色譜條件為ds反相柱；柱溫為35°C;檢測(cè)器為UV238nm;流動(dòng)相中甲醇水=60:40，其流速為1.0mL/min;進(jìn)樣體積為10nL;梔子藍(lán)的測(cè)定分光光度計(jì)在波長(zhǎng)590nm下測(cè)定。酶活測(cè)定方法酶活測(cè)定步驟配制醋酸水楊苷溶液0.5%水楊苷，O.IM醋酸；用移液搶準(zhǔn)確移取0.25ml醋酸水楊苷溶液至lml的小離心管中，再準(zhǔn)確移取過濾后的酶液0.02ml，最后移取0.73ml蒸餾水；空白對(duì)照0.25ml醋酸水楊苷加0.75ml水；把小離心管放入水浴鍋中，6(TC水浴10min，取出后立即用生物分析儀測(cè)定葡萄糖量。酶活計(jì)算方法生物傳感分析儀的標(biāo)準(zhǔn)液為100mg/dl葡萄糖溶液，若生物傳感分析儀數(shù)字顯示為10即代表10mg/dl=0.1mg/ml，按上述酶活測(cè)定步驟，若生物傳感分析儀數(shù)字顯示為10ml則說(shuō)明被0.02ml酶液還原的葡萄糖O.lmg/mlXlm卜0.1mg，那么根據(jù)酶活定義，1個(gè)小時(shí)底物在1ml酶液作用下可以產(chǎn)生0.1mgX6X50=30mg葡糖糖-166.7pmo1葡糖糖，即酶活為166.7U。酶活計(jì)算公式X(生物傳感分析儀數(shù)字顯示)X16.67。實(shí)施例1、黑曲霉發(fā)酵獲得P-葡萄糖苷酶種子培養(yǎng)基配方(g/L):可溶性淀粉20g，葡萄糖10g，KH2P04lg，MgS04lg，NaN032g，酵母膏5g，pH4。發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L):KH2P042g，MgS047H200.2g，(NH4)2S041.6g,麩皮為裝液量的3%，pH6。按照種子培養(yǎng)基配方，種子培養(yǎng)在250ml的三角瓶中進(jìn)行，裝液量為25ml，接種量約為孢子數(shù)2.0X108，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)溫度為3(TC，培養(yǎng)時(shí)間44h。按照發(fā)酵培養(yǎng)基配方，發(fā)酵培養(yǎng)在250ml的三角瓶中進(jìn)行，裝液量為15ml，接種量為750nl，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm,培養(yǎng)溫度為3(TC，培養(yǎng)時(shí)間72h。按照以上方法獲得p-葡萄糖酶液，經(jīng)上述酶活測(cè)定方法測(cè)定其酶活為175U/ml。實(shí)施例2、黑曲霉發(fā)酵獲得p-葡萄糖苷酶種子培養(yǎng)基配方(g/L):可溶性淀粉15g，葡萄糖8g，KH2P040.8g，MgS040.8g，NaN031.8g，酵母膏4.5g，pH4。發(fā)酵培養(yǎng)基配方(g/L):KH2P041.8g，MgS047H200.15g，(NH4)2S041.3g，麩皮為裝液量的5%,pH7.5。按照種子培養(yǎng)基配方，種子培養(yǎng)在250ml的三角瓶中進(jìn)行，裝液量為25ml，接種量約為孢子數(shù)2.0X108，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm,培養(yǎng)溫度為30'C，培養(yǎng)時(shí)間48h。按照發(fā)酵培養(yǎng)基配方，發(fā)酵培養(yǎng)在250ml的三角瓶中進(jìn)行，裝液量為15ml，接種量為750nl，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)溫度為30'C，培養(yǎng)時(shí)間74h。按照以上方法獲得P-葡萄糖酶液，經(jīng)上述酶活測(cè)定方法測(cè)定其酶活為170U/ml。實(shí)施例3、梔子藍(lán)色素的制備配制重量比濃度為0.05%的梔子苷溶液，取4ml，按表l所示分別加入適量實(shí)施例l、2得到的酶液以及來(lái)源于苦杏仁的P-葡萄糖苷酶(FLUKA公司)各100^1，并選擇性添加金屬酶促進(jìn)劑(按反應(yīng)液體積計(jì)，每ml的加量為0.02—0.25嗎)，于50—60'C反應(yīng)30—120min，反應(yīng)過程中每隔10min取樣，以HPLC方法測(cè)定梔子苷的含量(其中2#樣品反應(yīng)前后的HPLC圖譜如圖1A和1B所示，其余樣品基本相同，故省略)，并計(jì)算轉(zhuǎn)化率(轉(zhuǎn)化率=1一測(cè)得的梔子苷含量/初始梔子苷含量)，結(jié)果見表2。然后向反應(yīng)液中加入不同的氨基酸(按反應(yīng)液體積計(jì)，每ml的加量為37—87mg)，在65—85'C反應(yīng)l一4h后，用分光光度計(jì)檢測(cè)獲得的梔子藍(lán)的ODs9o值，結(jié)果見表2。最后經(jīng)干燥，包括加熱干燥、真空干燥以及噴霧干燥，獲得顏色鮮艷的梔子藍(lán)，對(duì)獲得的梔子藍(lán)色素進(jìn)行稱量，結(jié)果見表2。以HPLC測(cè)得的梔子苷的轉(zhuǎn)化率(％)對(duì)反應(yīng)時(shí)間(min)作圖，結(jié)果如圖2所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>#由表l、表2和圖3的結(jié)果可見，在梔子苷轉(zhuǎn)化為京尼平的第一步反應(yīng)中，加入金屬酶促進(jìn)劑可以顯著提高梔子苷的轉(zhuǎn)化速度，相同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)梔子苷的轉(zhuǎn)化率遠(yuǎn)大于不加入金屬酶促進(jìn)劑的反應(yīng)。實(shí)施例4、梔子藍(lán)色素的色價(jià)測(cè)定色價(jià)定義為單位質(zhì)量原料的提取物的吸光度(按照GB5525中2.2重鉻酸鉀溶液比色法執(zhí)行)。色價(jià)是單位質(zhì)量原料的提取物在lX濃度、以lcm比色皿在其最大吸收峰處的吸光度。計(jì)算方法為色價(jià)-AfA00m，其中A為實(shí)測(cè)試樣的吸光度，f為稀釋倍數(shù)，m為試樣質(zhì)量。具體操作如下.準(zhǔn)確稱取實(shí)施例3得到的2弁樣品色素0.1g，用去離子水稀釋于100ml容量瓶中，用紫外可見分光光度計(jì)于最大波長(zhǎng)處，用去離子水作參比液,于lcm比色皿中測(cè)定其吸光度。然后按上述計(jì)算方法計(jì)算得到樣品的色價(jià)為25?？梢姴捎帽景l(fā)明的方法獲得的藍(lán)色素的顏色較深。實(shí)施例5、梔子藍(lán)色素的穩(wěn)定性檢測(cè)將實(shí)施例3制得的2#天然藍(lán)色素放置于自然光下，在放置不同時(shí)間后，分別測(cè)其OD柳值，并計(jì)算損失率(損失率=1一測(cè)得的00590值/初始00590值)，其結(jié)果如表3所示。表3、梔子藍(lán)色素的穩(wěn)定性由表3可以看出，放置1月后，天然藍(lán)色素?fù)p失率僅為5.2%，可見采用本發(fā)明的方法獲得的藍(lán)色素在自然光條件下相當(dāng)穩(wěn)定。綜上所述，本發(fā)明提供的方法，在反應(yīng)過程中添加了金屬離子酶促進(jìn)劑，包括F^+，Zn2+，Cu2+，Co2+，Mi^+等，這些金屬離子的添加可以加快酶促反應(yīng)速度，縮短反應(yīng)時(shí)間，節(jié)約生產(chǎn)成本，并且通過本發(fā)明獲得的天然藍(lán)色素在自然光條件下相當(dāng)穩(wěn)定，有利于工業(yè)化生產(chǎn)；同時(shí)，由于所添加的金屬離子酶促進(jìn)劑中的金屬離子均為人體所必需的微量元素，因此，本發(fā)明提供的藍(lán)色素不僅沒有人工色素潛在的危害，相反具有很好的保健功能，可以廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)等各領(lǐng)域中。權(quán)利要求1、一種天然藍(lán)色素的生產(chǎn)方法，包括β-葡萄糖苷酶催化梔子苷反應(yīng)得到京尼平，以及將京尼平和氨基酸在適當(dāng)條件下反應(yīng)得天然梔子藍(lán)色素，其特征在于，在β-葡萄糖苷酶催化梔子苷得到京尼平的反應(yīng)中加入金屬酶促進(jìn)劑。2、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述金屬酶促進(jìn)劑包括Fe3+,Zn2+,Cu2+，Co2+，Mn2+。3、如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述金屬酶促進(jìn)劑的加入量為每毫升反應(yīng)體系中添加金屬酶促進(jìn)劑的量為0.02—0.25昭。4、如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述(3-葡萄糖苷酶催化梔子苷反應(yīng)得到京尼平的步驟包括向梔子苷溶液中加入P-葡萄糖苷酶液并加入金屬酶促進(jìn)劑，于50—60'C反應(yīng)30—120min。5、如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述將京尼平和氨基酸在適當(dāng)條件下反應(yīng)得天然梔子藍(lán)色素的步驟包括在反應(yīng)液中加入氨基酸，在65—85'C反應(yīng)l一4h。6、如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、組氨酸、精氨酸和谷氨酸鈉。7、如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述氨基酸的加入量為每毫升反應(yīng)體系中添加氨基酸37—87mg。8、如權(quán)利要求1一7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，還包括對(duì)獲得的梔子藍(lán)色素進(jìn)行分離純化的步驟。9、如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述分離純化包括將最后的反應(yīng)液進(jìn)行干燥。10、如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述干燥的方法包括加熱干燥,真空干燥，以及噴霧干燥。全文摘要本發(fā)明提供了一種天然藍(lán)色素的生產(chǎn)方法，包括β-葡萄糖苷酶催化梔子苷反應(yīng)得到京尼平，以及將京尼平和氨基酸在適當(dāng)條件下反應(yīng)得天然梔子藍(lán)色素，其特征在于，在β-葡萄糖苷酶催化梔子苷得到京尼平的反應(yīng)中加入金屬酶促進(jìn)劑。本發(fā)明的天然藍(lán)色素的生產(chǎn)方法，由于在反應(yīng)過程中添加了金屬酶促進(jìn)劑，因此可以顯著加快酶促反應(yīng)的速度，縮短反應(yīng)時(shí)間，從而節(jié)約生產(chǎn)成本，有利于工業(yè)化生產(chǎn)；同時(shí)，由于所添加的金屬離子均為人體所必需的微量元素，因此，所獲得的色素不僅沒有人工色素潛在的危害，相反具有很好的保健功能，可以廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)等各領(lǐng)域中。文檔編號(hào)C12P19/00GK101104745SQ20071004523公開日2008年1月16日申請(qǐng)日期2007年8月24日優(yōu)先權(quán)日2007年8月24日發(fā)明者付水林,剛劉,劉必成,劉朋波,孫海燕,女宓,衡宮,徐佳杰申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)