專利名稱：：一種新的表達(dá)酶的酵母基因工程系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種表達(dá)酶的酵母基因工程系統(tǒng)。技術(shù)背景酵母系統(tǒng)是一種重要的基因工程表達(dá)系統(tǒng)。自從1981年Hitzman首先用釀酒酵母(&cc/ara"^Mcem^fle)表達(dá)了人a干擾素以來，至今巳有多種酵母菌建成了基因工程表達(dá)系統(tǒng)，其中包舌5tA/z(Wflcc/2firA"ow[yces/ow6e、尸/c/^fljD05to/"^y、//fl"se"w/a/o(ymor//a、在這些酵母表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用最廣的是釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)(Sacc/aramyc^cereWw'ae)和畢赤酵母CP油.a戸/on力系統(tǒng)。釀酒酵母長(zhǎng)期作為一種食品微生物用于面包和啤酒的生產(chǎn)，因此，它是一種公認(rèn)的安全微生物；其次，釀酒酵母還作為一種模式生物被廣泛用于基礎(chǔ)研究，因此，具有很清楚的遺傳背景。作為基因工程表達(dá)系統(tǒng)己有大量外源基因在釀酒酵母系統(tǒng)中得到表達(dá)。其中，用釀酒酵母表達(dá)的乙型肝炎疫苗以及人a2a和人a2b干擾素都已先后投產(chǎn)上市。但是釀酒酵母對(duì)外源基因的表達(dá)量偏低，一些用量偏大、經(jīng)濟(jì)價(jià)值偏低的蛋白質(zhì)(特別是那些工業(yè)用和農(nóng)業(yè)用的蛋白質(zhì))，用釀酒酵母系統(tǒng)來表達(dá)，通常難以解決生產(chǎn)成本問題。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在上世紀(jì)80年代問世以來，隨著系統(tǒng)的不斷改進(jìn)，外源基因的表達(dá)水平有了很大提高。當(dāng)前，已經(jīng)作為首選的酵母系統(tǒng)被廣泛用于表達(dá)各種外源基因。但是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)也存在一些問題，其中最主要的是發(fā)酵周期較長(zhǎng)和發(fā)酵過程中需要用甲醇誘導(dǎo)，給設(shè)備利用和操作安全帶來了麻煩。乳酸克魯維酵母在傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中也有比較廣泛的應(yīng)用。在上世紀(jì)80年代也已經(jīng)建成了基因工程系統(tǒng)，有許多研究論文報(bào)道表達(dá)了一些外源基因[FleerR.，YehP.AmellalN.，1991,StablemulticopyvectorsforhighlevelsecretionofrecombinanthumanserumalbuminbyA7""ero攀esyeast,Biotechnology,9(10):968-975，陳新杰，高卜渝，史文格等，1992，人aA干擾素在乳酸克魯維酵母中的表達(dá)和分泌，遺傳學(xué)報(bào)，19(3):284-288]，但是至今并沒有真正用于產(chǎn)品的開發(fā)。鷹嘴豆克魯維酵母(iaw_ywra/^cMc/c"^on^)已有人試圖將其建成為基因工程表達(dá)系統(tǒng)，但是由于試驗(yàn)的載體未能實(shí)現(xiàn)對(duì)鷹嘴豆克魯維酵母的轉(zhuǎn)化(XinJieChen,MicheleM.Bianchi，KohtaSuda,andHiroshiFukuhara,ThehostrangeofpKDl-derivedplasmidsinyeast,CurrentGenetics,1989,16:95-98)，至今未見有進(jìn)一步的工作報(bào)告。本發(fā)明的發(fā)明人在對(duì)數(shù)百株不同的酵母菌進(jìn)行分泌蛋白質(zhì)總量和組分的研究中發(fā)現(xiàn)了一些分泌蛋白質(zhì)量大，分泌蛋白質(zhì)有一個(gè)主要組分的酵母菌，其中包括一株鷹嘴豆克魯維酵母(尺/""er0w3/CM"'cen^oms)。通過對(duì)鷹嘴豆克魯維酵母主要分泌蛋白的純化、蛋白質(zhì)N末端氨基酸序列分析，結(jié)果表明這個(gè)主要蛋白質(zhì)的氨基末端序列與已知的菊粉酶的氨基末端高度同源。酶學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明這個(gè)蛋白質(zhì)具有外切菊粉酶的活性。推測(cè)鷹嘴豆克魯維酵母可能是一個(gè)潛在的進(jìn)行分泌表達(dá)外源基因的宿主；鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因的基因表達(dá)元件一轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、終止子以及信號(hào)肽序列可望用來指導(dǎo)基因工程有用基因的表達(dá)。根據(jù)這一設(shè)想我們克隆了鷹嘴豆克魯維酵母WA5基因(KcWL4"，通過篩選獲得C/iA基因缺陷的鷹嘴豆克魯維酵母菌Y179ura3'，構(gòu)建了以《cf/i^3基因?yàn)檫x擇性標(biāo)記的載體pUKl和pKSUKD，實(shí)現(xiàn)了這些載體對(duì)鷹嘴豆克魯維酵母菌Y179ura3—的轉(zhuǎn)化aZhang,H.Yuan，T,Wen,F.Xu,Y.Di，K.Hou,Y,Y丄i:Cloningofthe《cC/iL43geneanddevelopmentofatransformationsystemfori3wyvero/wycesc/ceWs;oriw，Appl.Microbiol.Biotechnology,62:387-391,2003和中國(guó)發(fā)明專利ZL02137040.0);克隆了鷹嘴豆克魯維酵母菌的菊粉酶基因《c/M/7(TieqiaoWen,FengLiu，KekeHuoandYu-YangLi,Cloningandanalysisoftheinulinasegenefromfi甲eram戸scicez-!'5po麗CBS4857,WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology,2003,19:423-426);以菊粉酶基因的表達(dá)元件一轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、終止子，以及釀酒酵母a因子信號(hào)肽序列表達(dá)了人a2a干擾素(X.P.Cai,J.Zhang,H-Y.Yu叫Z-A.FangandY.陽(yáng)Y丄i,SecretoryexpressionofheterologousproteininA7wyvera附y(tǒng)cesc/cm'印or叫AppliedGeneticsandMolecularBiotechnology,2005,67:364-369)。由于鷹嘴豆克魯維酵母生長(zhǎng)快，可以縮短發(fā)酵周期；能大量高效分泌菊粉酶，對(duì)生產(chǎn)需要量大、要求成本低的酶制劑特別有利。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種發(fā)酵周期短、能大量高效表達(dá)的新的表達(dá)酶的酵母基因工程系統(tǒng)。本發(fā)明提出的新的表達(dá)酶的酵母基因工程系統(tǒng)，內(nèi)容包括1.鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因表達(dá)質(zhì)粒pUKD-S-PInuT及其構(gòu)建。2.將菊粉酶基因的表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞Y179um3-，獲得可高效分泌表達(dá)菊粉酶的鷹嘴豆克魯維酵母工程菌Y179ura37pUKD-S-PInuT。3.對(duì)鷹嘴豆克魯維酵母工程菌Y179ura37pUKD-S-PI皿T進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，高效分泌表達(dá)菊粉酶。對(duì)上述發(fā)明具體說明如下1、鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因的表達(dá)質(zhì)粒pUKD-S-PInuT的構(gòu)建，包括以下內(nèi)容①鷹嘴豆克魯維酵母載體pUKD-S及其構(gòu)建pUKD-S是在鷹嘴豆克魯維酵母細(xì)胞中高度穩(wěn)定的載體，是鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建基礎(chǔ)。它是在已經(jīng)構(gòu)建的克魯維酵母pKDl質(zhì)粒衍生載體pUKD基礎(chǔ)上構(gòu)建的載體。在載體pUKD中作為穿梭質(zhì)粒必需的大腸桿菌質(zhì)粒序列在pKDl的EcoRI位點(diǎn)插入。但是，根據(jù)BartkevciuteD等的報(bào)道(BartkevciuteDetal.:EnzymeandMicrobialTechnology,26:653-656,2000):質(zhì)粒pKDl中的EcoRI切點(diǎn)位于與該質(zhì)粒穩(wěn)定性密切相關(guān)的CSL(Cis-actingStabilityLocus)區(qū)中，對(duì)衍生質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性有影響。而質(zhì)粒pKDl具有的單一酶切位點(diǎn)Sphl則位于這個(gè)質(zhì)粒復(fù)制功能的非必要區(qū)內(nèi)。將表達(dá)載體中添加其他元件的位點(diǎn)從原來的EcoRI改為Sphl，可望提高重組質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中的穩(wěn)定性。鷹嘴豆克魯維酵母載體pUKD-S就是以這一原理構(gòu)建的。其構(gòu)建方法如圖l所示。從圖l可以看出，載體pUKD-S是由克魯維酵母質(zhì)粒pKDl,鷹嘴豆克魯維酵母KcWL43基因和大腸桿菌質(zhì)粒pUC19組成，載體pUKD-S的全序列為SEQ.ID.NOl;全長(zhǎng)8961bp;其中1-2245和8529-8961為pUC19序列,2246-7014為pKDl序列，7015-8528為《c"緒基因序列。②鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因表達(dá)盒及其構(gòu)建鷹嘴豆克魯維酵母可以高效分泌菊粉酶，編碼鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶的基因尺c/A^7已經(jīng)克隆，其核苷酸序列己經(jīng)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上登錄，登記號(hào)為AF178979。本發(fā)明利用鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因的啟動(dòng)子和終止子和帶信號(hào)肽的菊粉酶編碼序列，構(gòu)建表達(dá)鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因的表達(dá)盒。該表達(dá)盒由通過PCR分別擴(kuò)增的鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因啟動(dòng)子、終止子和帶信號(hào)肽的菊粉酶編碼區(qū)DNA片段拼接而成。該表達(dá)盒的構(gòu)建步驟為首先，以鷹嘴豆克魯維酵母Y179ura3-的總DNA為模板，分別以P1和P2，P3和P4以及P5和P6為引物，用PCR技術(shù)擴(kuò)增出菊粉酶基因的啟動(dòng)子，終止子和帶信號(hào)肽序列的菊粉酶基因編序列的DNA片段，并按照各個(gè)片段設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)進(jìn)行相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶處理，再將這3個(gè)片段與經(jīng)Sail酶切的質(zhì)粒pRS426-L四個(gè)因子連接得到質(zhì)粒426-L-PInuT，此質(zhì)粒中包括菊粉酶基因的啟動(dòng)子，終止子和帶信號(hào)肽序列的菊粉酶基因編序列的Sail片段，即為已拼接成的菊粉酶基因表達(dá)盒。其中pRS426-L來源于pRS426，pRS426的結(jié)構(gòu)可參見Sikorski,R.S.andHieter，P.:AsystemofshuttlevectorsandyeasthoststrainsdesignedforefficientmanipulationofDNAinSflfcc/wrawycescercv/w.ae,Genetics,122(1):19-27(1989)。所用的6條引物的核苷酸序列如下克隆啟動(dòng)子片段用的兩條引物的序列是PI:5，GTCGACGGATCCGAAAGG3,SailP2:5'GGGTCGACTAGTATCTAACAAAAAAAAAATTAAATGTGT3'Spel克隆終止子片段用的兩條引物的序列是P3:5，ACCCAATTTAAGCTTTGATCTGAT3'HindIIIP4:5，GTCGACGGATCCGGCAGGGCTGTGA3，Sail克隆帶信號(hào)肽的菊粉酶編碼區(qū)的兩條引物的序列是-P5:5，GAGAAGCTTGCGGCCGCTCAAAGGTTAAA3，Hi慮IP6:5:GTGACTAGTAAACGATGAAGTTAGCATACTCCCT3,Spel。③鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因表達(dá)質(zhì)粒pUKD-S-PInuT及其構(gòu)建鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因表達(dá)質(zhì)粒pUKD-S-PInuT的構(gòu)建過程如下首先，將②中制備的質(zhì)粒426-L-PIT-T用限制性內(nèi)切酶Sa11切出帶菊粉酶基因表達(dá)盒的DNA片段，片段經(jīng)分離后，用Klenow酶填平粘性末端；將鷹嘴豆克魯維酵母載體pUKD-S用限制性內(nèi)切酶Sse3871切開，也用Klenow酶填平粘性末端。然后，兩者用DNA連接酶連接，得到鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因表達(dá)質(zhì)粒pUKD-S-PInuT。2.鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因工程菌Y179ura37pUKDl-S-PInuT的構(gòu)建，具體步驟如下將菊粉酶基因表達(dá)質(zhì)粒pUKD-S-PImiT用LiAc完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入鷹嘴豆克魯維酵母Y179ura3—，篩選能在缺少尿嘧啶的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的酵母菌，即可取得鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因工程菌Yl79um3-/pUKD-S-PInuT。3.鷹嘴豆克魯維酵母基因工程菌Y179ura37pUKD-S-PInuT發(fā)酵培養(yǎng)，高效分泌表達(dá)菊粉酶，具體步驟如下將工程菌Y179ura3—/pUKD-S-PInuT進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)凝膠電泳分析及菊粉酶活性測(cè)定證明工程菌能高效分泌表達(dá)菊粉酶。每毫升發(fā)酵液可以產(chǎn)生855.4單位的菊粉酶，是野生型鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶產(chǎn)量的7.1倍。見實(shí)施例4。圖1:鷹嘴豆克魯維酵母高穩(wěn)定載體pUKD-S的構(gòu)建。圖2:鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因表達(dá)盒的構(gòu)建流程圖。圖3:鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因表達(dá)質(zhì)粒pUKD-S-PInuT的構(gòu)建圖示。圖4:工程菌Y179ura37pUKDl-S-PInuT分泌表達(dá)菊粉酶的凝膠電泳分析。其中l(wèi)為鷹嘴豆克魯維酵母Y179，2為工程菌Y179ura3—/pUKDl-S-PInuT，3為分子量標(biāo)準(zhǔn)。具體實(shí)施方式實(shí)施例1鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因表達(dá)盒的構(gòu)建首先，以鷹嘴豆克魯維酵母Y179um3-的總DNA為模板，分別以Pl和P2，P3和P4以及P5和P6為引物，用PCR技術(shù)擴(kuò)增出菊粉酶基因的啟動(dòng)子，終止子和帶信號(hào)肽序列的菊粉酶基因編序列的DNA片段，并按照各個(gè)片段設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)進(jìn)行相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶處理，再將這3個(gè)片段與經(jīng)Sail酶切的質(zhì)粒pRS426-L四個(gè)因子連接得到質(zhì)粒426-L-PInuT，此質(zhì)粒中包括菊粉酶基因的啟動(dòng)子，終止子和帶信號(hào)肽序列的菊粉酶基因編序列的Sail片段，即為已拼接成的菊粉酶基因表達(dá)盒。其中pRS426-L來源于pRS426，pRS426的結(jié)構(gòu)可參見Sikorski,R.S.andHieter,P.:AsystemofshuttlevectorsandyeasthoststrainsdesignedforefficientmanipulationofDNAin5Wcc/wra/w戸51cerev涵e，Genetics,122(1):19-27(1989)。所用的6條引物的核苷酸序列如下克隆啟動(dòng)子片段用的兩條引物的序列是PI:5'GTCGACGGATCCGAAAGG3'SailP2:5,GGGTCGACTAGTATCTAACAAAAAAAAAATTAAATGTGT3，Spel克隆終止子片段用的兩條引物的序列是P3:5'ACCCAATTTAAGCTTTGATCTGAT3，HindIIIP4:5，GTCGACGGATCCGGCAGGGCTGTGA3，Sail克隆帶信號(hào)肽的菊粉酶編碼區(qū)的兩條引物的序列是P5:5，GAGAAGCTTGCGGCCGCTCAAAGGTTAAA3，HindIIIP6:5:GTGACTAGTAAACGATGAAGTTAGCATACTCCCT3'Spel實(shí)施例2鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因表達(dá)質(zhì)粒pUKD-S-PInuT的構(gòu)建首先，將實(shí)施例1中的質(zhì)粒426-L-PIT-T用限制性內(nèi)切酶Sail切出帶菊粉酶基因表達(dá)盒的DNA片段。片段經(jīng)分離后，用Klenow酶填平粘性末端；將鷹嘴豆克魯維酵母載體pUKD-S用限制性內(nèi)切酶Sse3871切開，也用Klenow酶填平粘性末端。然后，兩者用DNA連接酶連接，得到鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因表達(dá)質(zhì)粒pUKD-S-PInuT。實(shí)施例3菊粉酶基因表達(dá)質(zhì)粒pUKD-S-PInuT用LiAc完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法①接種單菌落到3mlYEPD中3(TC振蕩培養(yǎng)過夜。②將過夜培養(yǎng)物稀釋到50mlYEPD(可做10管)中使起始濃度為O.D6of0.08，置3(TC振蕩培養(yǎng)4.5h到O.D6{)()=0.32。(起始濃度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)于轉(zhuǎn)化效率的高低影響很大。)③5K,5min離心收集菌體棄培養(yǎng)液，加入無(wú)菌水5K，5min離心收集菌體。用無(wú)菌水再洗一次，5K，5min離心收集菌體。◎加入10ml0.1MLiAC，在30'C水浴保溫10min，將細(xì)胞分裝到1.5ml離心管中，每管lml。⑦高速離心細(xì)胞，棄上清。⑧在每管中加入如下溶液50ul0.1MLiAC,10ul5mg/mlssDNA，10Ul轉(zhuǎn)化表達(dá)質(zhì)粒DNA,340UlPEG(50%w/v)/LiAC/H20(8:1:1)◎輕輕混勻細(xì)胞，置于30'C水浴30分鐘，然后42r熱擊25分鐘。⑩高速離心收集菌體，棄上清，加100lU無(wú)菌水涂SD平板。實(shí)施例4鷹嘴豆克魯維酵母基因工程菌Y179ura37pUKD-S-PInuT的發(fā)酵培養(yǎng)及菊粉酶表達(dá)分析①將鷹嘴豆克魯維酵母基因工程菌Y179um3—/pUKD-S-PInuT和野生型鷹嘴豆克魯維酵母Y179分別接入3毫升SD液體培養(yǎng)液(成分為0.67%YNB及2%葡萄糖)中，在26-30°C,250-280rpm震蕩培養(yǎng)過夜后作為種子液。②將種子液以l:18-25的比例接入YEPD培養(yǎng)液(成分為1%酵母抽提物、2%蛋白胨及2%葡萄糖，在250毫升三角瓶裝25毫升培養(yǎng)液)中，在26-3(TC下震蕩培養(yǎng)40-50小時(shí)。③發(fā)酵液經(jīng)(5000rpm)離心沉淀菌體，取上清液進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物菊粉酶的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析及菊粉酶活性分析。聚丙烯酰胺凝膠電泳采用的是濃度為12%的膠，上樣量為30微升。電泳結(jié)果見圖5，從圖5可見與野生型鷹嘴豆克魯維酵母Y179相比，工程菌的產(chǎn)酶量有明顯提高?！虬l(fā)酵上清液菊粉酶活性測(cè)定的結(jié)果表明鷹嘴豆克魯維酵母基因工程菌Y179ura37pUKD-S-PInuT產(chǎn)酶量達(dá)至l」855.4單位/毫升，而野生型鷹嘴豆克魯維酵母Y179的產(chǎn)酶量只有120.6單位/毫升，工程菌產(chǎn)菊粉酶的量是野生型菌株的7.1倍。序列表SEQ.ID.N01:gacg認(rèn)gggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggttt61cttagacgtcaggtggcacttttcggg卿atgtgcgcggaacccctatttgtttatttt121tctaaatacattc朋atatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaat181aatattgaaa卿g犯gagtatgagtELttCaac3tttccgtgtcgcccttattccctttt241ttgcggcattttgccttcctgtttttgctc3ccc3g3aacgctggtg犯a301ctgaagatcagttgggtgcac哪tgggttacatcgaactggatctcaac3gcggta卿361tccttgagagttttcgccccg犯g3acgttttCC^tg3tgagcactttt3犯gttCtgC421tatgtggcgcggtattatcccgt3ttga^cgccgggc卿agc犯ctcggtcgccgcatac481actattctcagaatgacttggttgetgtactcaccagtcacag3犯agcatcttacggatg541gcatgacagttgcagtgctgccataaccatactgcggcca601acttacttctgac犯cgatcggagg3ccgacgcttttttg661gggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacg721acgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggc肌ca^cgttgcgcaaactattaactg781gcgaactacttactctagcttcccggcaacctgg3tggaggcggataaag841ttgC3gg3CCacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgstaaatctg901gagccggtgagcgtgggtctCgCggtdtC8ttgcagcactggggcc兆atggtsagccct961cccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacga^at3gac1021agatcgctgagatsggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagacc抑gtttact腿catatatactttaaaacttcatttttaatt1141tcctttttgataatctcatgaccaasatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgt1201cagaccccgt犯aggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaa_tct1261gctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggstc肌gagc1321taccaactctttttccgaaggta^ctggcttceigc&gagcgcageitaccaaatactgtcc1381ttct3gtgtagccgtagttaggccaccacttca3g犯ctctgtagcaccgcctacatacc1441tcgctctgctaatcctgttacc敏ggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccg1501ggttggactxaag3cgat3gttaccggata郷cgc鄉(xiāng)ggtcgggctgaacggggggtt1561cgtgcacacagCCCBgCttgg3gCg犯Cg3cctacaccgaactgagatacctacagcgtg1621a_gctatgagaaagcgccacgcttcccgaaggg卿靴gcgg3C鄉(xiāng)tdtccggtaagcg1681gcagggtcgga固gg卿gcgcacgaggg3gCttCC3ggtggtalxttt1741atagtcctgtcgggUtcgccacctctgacttg8gcgtxgatttttgtgatgctcgtcag1801gggggcggagcct3tgg肌a3acgccagcaacgcggcctttttacggttcctggcctttt1861gctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggstaaccgta1921ttaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccg3a_cgaccga_gcgcagcg服t1981cagtgagcgagg犯gcggaagagcgcccaatscgceiaaccgcctctccccgcgcgttggc2041cgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactgg犯ELgCgggC8gtgagcgc32101acgcaattaatgtgagmgctcactcatt3ggcax:ccca^ggctttacactttatgcttc2161cggctcgtatgttgtgtgga3ttgtgagcggataacaatttcBcacagg3a^cagct3tg2221accatgattacgccaagcttgcatgceitcactaatgaaaagcatacgacgcctgcgtctg2281acatgcactc3ttctgaag3卿ttctgggcgcgtttcgttctcgttttcctctgtatat2341tgt3CtCtggtggacaattttctttcacctcgccattctcaM肌tgggt2401tccaattctatccaggtagcggtt組tgacggtgcttaagccgtatgctcactct犯cg2461ctaccgttgtccaaaca^cggacccctttgtgacgggtgtaa^cccatc2521acatctctaacggtatggaacggtcaagtttcctggcacgagtcaatttt258]ccctcttcgtgtagatcag3ggctatatac3tgCCg鄉(xiāng)tattcgatcactctacgatga264]cggtctgttagctcaacaacttcttctaaatgctccat朋ccgtaacgta2701ctgtcaat3ctga^gtca1:cccagtttatt2761tgttcgaatagcccaggatc3Cg鄉(xiāng)3ggt2821ttatagtctgcaaattctagaatagcattt2881gttctaccgat貼3ggatccaatgtgatta2941atcgatgtcttgttaBcaaacgctaaactc3001tcatcaattccatcggctatctcttgataa3061cgttgagttactttatgactagaaatcttc3121agctctggagagggacata^caatactttg3181aggaaatscttgttcttttgtagacgttcc3241atccattctaggitctttga^ataagtttgg3301taaatctgcgctagataagtacattgtgca3361tgcgteattatagtattattgagtggatca3421ctgtctaataaggccctgtaaatctctctg3481ctg,tcggagc3gC3gtt3541gatgcctattcaatgctgccUttgUtgg3601atgtaatacccttactaggcaatgttataa3661ctttatacgtgttgaaatat3721cttttgaggctcagcagcgcgaattctctc3781cttgaggctc鄉(xiāng)cgg犯ttataaaacatc3841tgaggctcagctgaaatttcaaaaagtcac3901aggctataacgttcgttattttaataccta3961gaggcaacgcgccgatacagggtcaatggg4021gtcattagtatggtatatag4081tctccsaacgtttgtctgat4141tcgtttttcaataataatatacatcatcac4201atcatgccaccaccgtccgctgtg3tCgC614261attggag犯cctcgtctgagataattccat4321gagctgagaaggattgagcgaccaagcgcg4381caaggctgttaccctcctcttcaagtagct4441ccttcaaaacatatatttcactgccc犯tg4501caaatacacggtcatctacagtcacactac4561tttgaatttcacggtccccagcccaattgc4621atctcgataaaaaggtcgccattaaatgtc4681tcttg犯gactggttcatcgacatgctggg4741actctggtaaaaactgatg3gtttgattag4801taggcgagca犯cacgcaaatagtcgtata4861c兆ga^gaagtt犯cgtaccgttcagttc4921c犯ttgggcccaga犯tga^ttgttgtaga4981gatcgctgtatctgcsgc犯tttcc犯cag5041gttttgtagtggttacgcaggactgatcga5101aaa/tatctttttcttttgacag犯tattag5161atttatgtgtttcctcgtagcgEitcaEiaca5221c犯caaccttgta卿aggcaatgctgatt5281ttagtct犯c3gtgaatttgataattttgt5341ttgcgctcttgta卿gcgg5401gcattgtcaag3tsgagaat鄉(xiāng)gacgccaggtgc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NO1；全長(zhǎng)8961bp；其中1-2245和8529-8961為pUC19序列，2246-7014為pKD1序列，7015-8528為KcURA3基因序列。2.—種鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因表達(dá)盒的構(gòu)建方法，具體步驟如下首先，以鷹嘴豆克魯維酵母Y179ura3-的總DNA為模板，分別以P1和P2，P3和P4以及P5和P6為引物，用PCR技術(shù)擴(kuò)增出菊粉酶基因的啟動(dòng)子，終止子和帶信號(hào)肽序列的菊粉酶基因編序列的DNA片段，并按照各個(gè)片段設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)進(jìn)行相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶處理，再將這3個(gè)片段與經(jīng)Sail酶切的質(zhì)粒pRS426-L四個(gè)因子連接得到質(zhì)粒426-L-PInuT，此質(zhì)粒中包括菊粉酶基因的啟動(dòng)子，終止子和帶信號(hào)肽序列的菊粉酶基因編序列的Sall片段，即為已拼接成的菊粉酶基因表達(dá)盒；其中pRS426-L來源于pRS426，所用的6條引物的核苷酸序列如下克隆啟動(dòng)子片段用的兩條引物的序列是Pl:5，GTCGACGGATCCGAAAGG3'SailP2:5，GGGTCGACTAGTATCTAACAAAAAAAAAATTAAATGTGT3，Spel克隆終止子片段用的兩條引物的序列是P3:5,ACCCAATTTAAGCTTTGATCTGAT3，HindIIIP4:5,GTCGACGGATCCGGCAGGGCTGTGA3，Sail克隆帶信號(hào)肽的菊粉酶編碼區(qū)的兩條引物的序列是P5:5，GAGAAGCTTGCGGCCGCTCAAAGGTTAAA3，HindIIIP6:5:GTGACTAGTAAACGATGAAGTTAGCATACTCCCT3，Spel。3、一種鷹嘴豆克魯維酵母菊粉基因的表達(dá)盒，由權(quán)利要求1所述方法構(gòu)建獲得。4、一種鷹嘴豆克魯維酵母菊粉基因表達(dá)質(zhì)粒pUKD-S-PInuT的構(gòu)建方法，具體步驟如下首先，將在權(quán)利要求2中制備的質(zhì)粒426-L-PIT-T用限制性內(nèi)切酶Sall切出帶菊粉酶基因表達(dá)盒的DNA片段，片段經(jīng)分離后，用Klenow酶填平粘性末端；將鷹嘴豆克魯維酵母載體pUKD-S用限制性內(nèi)切酶Sse3871切幵，也用Klenow酶填平粘性末端；然后，兩者用DNA連接酶連接，得到鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因表達(dá)質(zhì)粒pUKD-S-PInuT。5、一種由鷹嘴豆克魯維酵母菊粉基因表達(dá)質(zhì)粒pUKD-S-PInuT，由權(quán)利要求1所述方法構(gòu)建獲得。6、一種鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因工程菌Y179ura3卞UKD-S-PInuT的構(gòu)建方法，具體步驟如下將菊粉酶基因表達(dá)質(zhì)粒pUKD-S-PInuT用LiAc完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入鷹嘴豆克魯維酵母Y179ura3、篩選能在缺少尿嘧啶的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的酵母菌，即可取得鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因工程菌Y179ura37pUKD-S-PInuT。7、一種鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因工程菌Y179ura3'pUKD-S-PInuT，由權(quán)利要求6所述方法構(gòu)建獲得。8、一種鷹嘴豆克魯維酵母菊粉酶基因工程菌Y179ura3—pUKD-S-PInuT高效表達(dá)菊粉酶的方法，具體步驟如下將工程菌Y179ura3'/pUKD-S-PI皿T進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，經(jīng)凝膠電泳分析及菊粉酶活性測(cè)定證明工程菌能高效分泌表達(dá)菊粉酶。全文摘要本發(fā)明屬生物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體為一種表達(dá)酶的酵母基因工程系統(tǒng)。具體內(nèi)容包括構(gòu)建由鷹嘴豆克魯維酵母轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、終止子及帶信號(hào)肽的菊粉酶基因組成的表達(dá)盒，并將其插入載體pUKD-S，建成了高穩(wěn)定的菊粉酶基因表達(dá)質(zhì)粒；將該表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入鷹嘴豆克魯維酵母宿主Y179ura3^-，建成能高效分泌表達(dá)菊粉酶的基因工程菌；用將建成的鷹嘴豆克魯維酵母基因工程菌生產(chǎn)菊粉酶。本發(fā)明也可以用來表達(dá)和生產(chǎn)其他內(nèi)源的和外源的、天然的和改構(gòu)的酶。文檔編號(hào)C12N15/81GK101157935SQ20071004617公開日2008年4月9日申請(qǐng)日期2007年9月20日優(yōu)先權(quán)日2007年9月20日發(fā)明者晉張,文鐵橋,李育陽(yáng),蔡顯鵬,袁漢英申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)