專利名稱：新型耐熱植酸酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植酸酶制備工藝技術(shù)，更具體地說，是涉及一種用于動(dòng)物飼料添 加劑的細(xì)菌植酸酶的制備工藝技術(shù)。
背景技術(shù)：
植酸酶是催化植酸(肌醇六磷酸)及植酸鹽水解成肌醇與磷酸(或磷酸鹽)一 類酶的總稱。在禽畜飼料中添加植酸酶，其作用一是可以使詞料中的肌醇六磷酸 (植酸)分解成為肌醇和磷酸，有利于動(dòng)物消化吸收，使無(wú)機(jī)磷的用量降低，降低 詞料成本；二是可以消除植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用，提高飼料中礦物元素，如鈣、鋅、銅、鎂和鐵等生物學(xué)利用率；三是可以提高飼料中蛋白質(zhì)、氨基酸、淀粉和脂質(zhì) 等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率；四是可以提高動(dòng)物采食量和日增重，改善動(dòng)物生產(chǎn)性能； 五是可以顯著降低豬、禽糞便排泄物中磷的含量。在西方一些發(fā)達(dá)國(guó)家，植酸酶 作為動(dòng)物飼料添加劑被強(qiáng)制使用。植酸酶作為動(dòng)物飼料酶加劑所具有的多方面功能逐漸被人們認(rèn)識(shí)，對(duì)植酸酶 的研究探索不斷深入，以期開發(fā)生產(chǎn)出性能更好的更適合于作動(dòng)物飼料添加酶的 植酸酶。人們?cè)谥菜崦傅难芯刻剿鬟^程中，已研究開發(fā)出了無(wú)花果曲霉菌 "印e/gj77iAs/Ye""歷)植酸酶和黑曲酶(A w>er)植酸酶。這兩種植酸酶都屬 于真菌植酸酶，目前都已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)，被普遍用作動(dòng)物飼料添加酶。無(wú)花果曲 霉菌Uspe2^z'77^/Ye""yz )植酸酶和黑曲酶(A /7ige/0植酸酶作為動(dòng)物飼料添 加酶，對(duì)于降低無(wú)機(jī)磷的用量、提高詞料中礦物元素的生物學(xué)利用率和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 成分利用率、提高動(dòng)物采食量和日增重、降低畜禽糞便排泄物中磷含量等方面都 有不同程度的改善。但也存在一些問題，其一是不能完全降解飼料中的植酸，會(huì) 引起三磷酸肌醇和二磷酸肌醇的積累；二是耐熱溫度不高，80'C植酸酶基本失去 活性；三是其最適環(huán)境pH值一般為5.5左右，與動(dòng)物腸道環(huán)境pH值相差很大， 影響酶的活性。 人們?cè)趯ふ腋m于作動(dòng)物飼料添加劑植酸酶的研究過程中發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌植酸酶 相對(duì)于真菌植酸酶更適合于作動(dòng)物飼料添加酶。為了獲得更適于作動(dòng)物飼料添加劑的新菌植酸酶，人們對(duì)來源于大腸桿菌(E. C0li)的植酸酶進(jìn)行了廣泛的研究。 1993年從大腸桿菌中純化出植酸酶(appA)之后，研究人員對(duì)大腸桿菌植酸酶 的基本方面和產(chǎn)品化進(jìn)行了廣泛探索。研究表明，大腸桿菌植酸酶實(shí)際上是一種 雙功能酶，既表現(xiàn)出植酸酶活性，也表現(xiàn)出酸性磷酸酶活性。在大腸桿菌植酸酶 產(chǎn)品化研究中，現(xiàn)有技術(shù)的水平現(xiàn)狀大致如下陳寅等人將appA通過pET28載 體進(jìn)行表達(dá)，獲得的appA其最適溫度為60°C,最適pH為4. 5。 Golovan等人研 究了 appA編碼的雙功能酶的特點(diǎn)和過量生產(chǎn)，改造后的appA最適溫度60°C， 在pH為3時(shí)顯示出最大的耐熱性。采用T7聚合酶表達(dá)系統(tǒng)以分批發(fā)酵方式生產(chǎn) 植酸酶，植酸酶產(chǎn)量達(dá)到600U/ml。 Rodriguez E等人在巴氏畢赤酵母中進(jìn)行了 表達(dá)研究。美國(guó)專利US6511699采用pT7 vector在大腸桿菌中過量表達(dá)appA， 利用400fold (440mu/mg)增加酸性磷酸酶活性。另外還有報(bào)道將appA克隆到 pBBRT，轉(zhuǎn)化到假單孢菌，研制了用于植酸酶生產(chǎn)的復(fù)合介質(zhì)，在30。C下培養(yǎng)48 小時(shí)，分離植酸酶并進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的溫度和pH分別為55'C和4. 0。在30-50 。C貯藏2小時(shí)，酶的活性有所增加。但直到目前為止，以現(xiàn)有技術(shù)制備的大腸桿 菌植酸酶，其保持較高酶活力的酸性pH范圍還不夠?qū)?，與畜禽腸道的環(huán)境還不 能夠完全相適應(yīng)，還不能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。此外，工業(yè)生產(chǎn)植酸酶中，需要經(jīng)過 一個(gè)高溫制粒階段，制粒過程中的瞬間高溫會(huì)造成植酸酶的變性失活。因此，植 酸酶的耐熱性也是其改造和研究的重要方向。目前開發(fā)的植酸酶產(chǎn)品在耐熱性能 上效果不明顯，植酸酶的最適溫度在45-5(TC之間，在80'C下處理10分鐘活性 喪失90%以上，基本似活。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)制備的大腸桿菌植酸酶存在的不足，旨在提供一種新的制備大腸桿菌植酸酶工藝方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)制備的大腸桿菌植酸酶其保持較高酶活力的酸性pH范圍還不夠?qū)?，與畜禽腸道的環(huán)境還不能夠完全相適應(yīng)，耐熱溫度還不夠高等問題。上述所要解決的問題可由以下公開的技術(shù)方案來解決。本發(fā)明公開的新型耐熱植酸酶的制備方法，主要包括以下工藝步驟 (1) 基因富集將大腸桿菌SUGL用LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，提取大腸桿菌SUGL 的基因；(2) 擴(kuò)增反應(yīng)以大腸桿菌SUGL的基因組為模板，用TaqDNA聚合酶進(jìn)行 PCR反應(yīng)；(3) 酶切連接PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Kpnl和Xhol雙酶切，將雙酶切 目標(biāo)片段插入經(jīng)相同的限制性內(nèi)切酶雙酶切后的含有以硫氧還原蛋白為融合蛋 白的表達(dá)載體，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，從轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌 中提取質(zhì)粒pET32-即pA;(4) 接種培養(yǎng)將含有重組表達(dá)質(zhì)粒pET32-a卯A的BL21 (DE3)單菌落接 種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在其培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加入誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，制備 得到植酸酶。在上述技術(shù)方案中，為了確認(rèn)PCR反應(yīng)產(chǎn)物為目的產(chǎn)物，可在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束 后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以鑒定回收目的片段。在上述技術(shù)方案中，為了確認(rèn)誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)產(chǎn)物為要制備的植酸酶，可在誘導(dǎo) 培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)制備的植酸酶菌體進(jìn)行離心分離、超聲波破碎和電泳鑒定。對(duì)分 離收集到的菌體實(shí)施超聲波破碎，操作條件可控制為450W,工作9s，間歇3s， 持續(xù)20min。超聲波破碎后對(duì)離心分離得到的上清液和沉淀所實(shí)施的電泳鑒定， 通常為SDS-PAGE電泳鑒定。在上述技術(shù)方案中，PCR反應(yīng)所選用的TaqDNA聚合酶，最好是采用Ex Taq DNA型號(hào)的聚合酶。PCR擴(kuò)增反應(yīng)過程的操作可控制為93-95。C變性處理 3-65min;以94°C 45s、 58°C 60s、 72°C 90s條件循環(huán)29-40次;72。C延伸處理 lOmin。在上述技術(shù)方案中，PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Kpnl和Xhol雙酶切，酶切成 的目的片段長(zhǎng)一般為1.3kb。酶切連接所選用的表達(dá)載體最好為pET-32a ( + )。在上述技術(shù)方案中，在含有重組表達(dá)質(zhì)粒pET32-appA的BL21 (DE3)單菌 落接種于LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的過程中，最好是在單菌落接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng) 至0D600=0. 60—0. 80時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG。誘導(dǎo)劑IPTG的加入量，終濃度一般 控制為0. l—O. 5mmol/mL 。在上述技術(shù)方案中，在大腸桿菌SUGL用LB培養(yǎng)基進(jìn)行基因富集培養(yǎng)過程中，
和在含有重組表達(dá)質(zhì)粒pET32-a卯A的BL21 (DE3)單菌落接種于LB培養(yǎng)基進(jìn)行 接種培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)條件可以是相同的，培養(yǎng)條件一般控制為在37°C， 220rpm 下振蕩培養(yǎng)過夜。本發(fā)明還采取了其他一些技術(shù)措施。本發(fā)明成功地從大腸桿菌中克隆到了能夠耐PH2.5的具有植酸酶活性的 appA基因，并對(duì)appA基因進(jìn)行改造，進(jìn)而在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了融合表達(dá)。本發(fā) 明分離獲得的植酸酶，較現(xiàn)有技術(shù)制備的大腸桿菌植酸酶，其保持較高酶活力的 酸性pH值范圍更寬，在pH值2.5—5.5的范圍都具有很高的活性，與畜禽腸道 的環(huán)境更相適應(yīng)，耐熱溫度也有明顯提高。這一點(diǎn)可由后面的實(shí)施例得到證明。 且發(fā)明人按照本發(fā)明公開的方法實(shí)現(xiàn)了 100L罐發(fā)酵生產(chǎn)。本發(fā)明分離獲得的來 源于大腸桿菌植酸酶，較之目前普遍使用的無(wú)花果曲霉菌U^e/，w77^ /Yew/歷) 和黑曲酶".m>ar)植酸酶，克服了其在植酸降解過程中所存在的問題，能順 利地將植酸降解至磷酸和肌醇，不會(huì)引起三磷酸肌醇和二磷酸肌醇的積累，在很 強(qiáng)的酸性條件下也表現(xiàn)出了很高的酶活性，在較高的溫度下仍不失活性，更適應(yīng) 動(dòng)物腸道環(huán)境，且與底物植酸鹽的親和力，以及對(duì)蛋白酶的抵抗力都更好。另外， 植酸酶是迄今所知的分解植酸能力最強(qiáng)的植酸酶。隨著人們對(duì)環(huán)境保護(hù)持續(xù)發(fā)展的重視，以及對(duì)植酸酶認(rèn)識(shí)的進(jìn)一步提高，植 酸酶產(chǎn)品作為動(dòng)物飼料添加酶，在不久的將來中國(guó)必定會(huì)向西方某些發(fā)達(dá)國(guó)家一 樣，被強(qiáng)制應(yīng)用于所有的動(dòng)物飼料產(chǎn)品中。本發(fā)明的實(shí)施可為這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)提 供優(yōu)良的植酸酶，將會(huì)推動(dòng)這一目標(biāo)早日實(shí)現(xiàn)。
具體實(shí)施方式
大腸桿菌植酸酶基因富集、擴(kuò)增與酶切連接實(shí)施例大腸桿菌SUGL用LB培養(yǎng)基，在37。C, 220rpm下振蕩培養(yǎng)過夜，進(jìn)行基因 富集培養(yǎng)。富集培養(yǎng)結(jié)束后提取DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)。DNA的提取參照《精編分子 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》中小量提取細(xì)菌基因組DNA的方法進(jìn)行。大腸桿菌SUGL DNA 提取后，以大腸桿菌SUGL的基因組為模板，用Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR 反應(yīng)過程控制條件為94'C變性(使DNA雙鏈裂解成兩條單鏈)5min; 94°C 45s, 58°C 60s, 72°C 90s, 30 cycle; 72。C延伸(在引物引發(fā)DNA聚合反應(yīng))10min。
擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收目的片段。將回收的目的片段 PCR產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶KpnI和Xhol進(jìn)行雙酶切，將目的片段酶切成約為 1. 3kb大小的片段，然后回收將其插入由相同的限制性內(nèi)切酶Kpnl和Xhol酶切 成的含有硫氧還原蛋白的載體pET-32a ( + )進(jìn)行酶切連接，再以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 大腸桿菌BL21 (DE3)。之后提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定與測(cè)序分析。大腸桿菌中重組植酸酶的表達(dá)實(shí)施例將上一實(shí)施例通過擴(kuò)增、酶切、插接連接得到并經(jīng)鑒定的，含有重組表達(dá)質(zhì) 粒pET32-appA的BL21(DE3)單菌落接種于5ml的LB培養(yǎng)基中，并在37 °C ， 220rpm 振動(dòng)條件下培養(yǎng)過夜，然后再按^的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)， 培養(yǎng)至OD600=0. 6左右時(shí)加入IPTG誘導(dǎo)劑，在IPTG誘導(dǎo)下繼續(xù)培養(yǎng)。誘導(dǎo)劑 IPTG的加入量，終濃度控制為0. lmmol/mL (誘導(dǎo)劑的終濃度在0. 1—0. 5mmol/mL 范圍都可行)。經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，重組菌表達(dá)量可達(dá)到35%以上。誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié) 束后，對(duì)制備的植酸酶菌體依次進(jìn)行離心分離、超聲波破碎、再離心分離和電泳 鑒定，以確認(rèn)誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)產(chǎn)物為要制備的可以作為動(dòng)物飼料添加酶的大腸桿菌植 酸酶。對(duì)分離收集到的菌體實(shí)施超聲波破碎的操作控制條件為450W，工作9s， 間歇3s，持續(xù)20min左右。超聲波破碎后對(duì)離心分離得到的上清液和沉淀實(shí)施 聚丙酰胺(SDS-PAGE)電泳鑒定。重組菌表達(dá)的植酸酶耐酸活性測(cè)定實(shí)施例對(duì)制備的大腸桿菌，按每克菌體加入5ml的0.25mol/L乙酸緩沖液，并將 緩沖液的pH值調(diào)整為4.5,溶解測(cè)定重組菌表達(dá)植酸酶耐酸活性。植酸酶活性 測(cè)定方法參照植酸酶活性的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)測(cè)得植酸酶的酶活性為 40740. 7U/g，實(shí)驗(yàn)表明誘導(dǎo)表達(dá)后的重組菌表達(dá)的植酸酶，定確有很強(qiáng)的耐酸活 性。重組菌表達(dá)的植酸酶耐熱性測(cè)定將樣品在不同溫度下放置一段時(shí)間后，按相同的步驟，在水解反應(yīng)后測(cè)定試 樣吸光值。其中60。C、 65°C、 80。C下放置60min， 85。C下放置10min，檢驗(yàn)不同 加熱溫度對(duì)植酸酶活性的影響。
表達(dá)的植酸酶活性在37'C下為40740. 7U/g。在60'C下將樣品加熱60min (6(TC是植酸酶的最適反應(yīng)溫度)，酶活性僅喪失9%。在7(TC和8(TC下加熱 60min，植酸酶仍具有一定的耐熱性，酶活性分別喪失36%和73%。但是在85°C 下加熱10min，酶活性喪失約90%，與已有技術(shù)制備的大腸桿菌植酸酶在8(TC下 加熱10min酶活性喪失程度相近，耐熱活性明顯提高。這表明采用硫氧還蛋白融 合表達(dá)提高了植酸酶的耐熱活性。
權(quán)利要求
1、 一種新型耐熱植酸酶的制備方法，其特征在于主要包括以下工藝步驟(1) 基因富集將大腸桿菌SUGL用LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，提取大腸桿菌SUGL 的基因；(2) 擴(kuò)增反應(yīng)以大腸桿菌SUGL的基因組為模板，用TaqDNA聚合酶進(jìn)行 PCR反應(yīng)；(3) 酶切連接PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Kpnl和Xhol雙酶切，將雙酶切 目標(biāo)片段插入經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶雙酶切后的含有以硫氧還原蛋白為融合蛋白 的表達(dá)載體，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，從轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌中 提取質(zhì)粒pET32-即pA;(4) 接種培養(yǎng)將含有重組表達(dá)質(zhì)粒pET32-appA的BL21 (DE3)單菌落接 種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在其培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加入誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，制備 得到植酸酶。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型耐熱植酸酶的制備方法，其特征在于擴(kuò)增反 應(yīng)結(jié)束后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定回收目的片段。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型耐熱植酸酶的制備方法，其特征在于誘導(dǎo)培 養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)制備的植酸酶菌體進(jìn)行離心分離、超聲波破碎和電泳鑒定。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的新型耐熱植酸酶的制備方法，其特征在于超聲波 破碎的操作條件為450W，工作9s，間歇3s，持續(xù)20min。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的新型耐熱植酸酶的制備方法，其特征在于對(duì)離心 分離得到的上清液和沉淀實(shí)施SDS-PAGE電泳鑒定。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1至5中的任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的新型耐熱植酸酶的制備 方法，其特征在于PCR反應(yīng)所選用的聚合酶為Ex Taq DNA。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1至5中的任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的新型耐熱植酸酶的制備 方法，其特征在于PCR擴(kuò)增反應(yīng)過程的操作為93-95。C變性處理3-65min;以 94°C 45s、 58°C 60s、 72°C 90s條件循環(huán)29-40次；72。C延伸處理10min。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1至5中的任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的新型耐熱植酸酶的制備 方法，其特征在于PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Kpnl和Xhol雙酶切成的目的片段長(zhǎng)為1.3kb，酶切連接所選用的表達(dá)載體為pET-32a (+)。
9、 根據(jù)權(quán)利要求1至5中的任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的新型耐熱植酸酶的制備方法，其特征在于單菌落接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0. 60—0. 80時(shí)加入誘導(dǎo)劑IPTG，誘導(dǎo)劑IPTG的加入量終濃度為0. l—O. 5ramol/mL 。
10、 根據(jù)權(quán)利要求1至5中的任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的新型耐熱植酸酶的制備方法，其特征在于大腸桿菌SUGL和含有重組表達(dá)質(zhì)粒pET32-appA的BL21 (DE3) 單菌落在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的條件為在37C 220rptn下振蕩培養(yǎng)過夜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型耐熱植酸酶制備方法，主要工藝內(nèi)容包括將大腸桿菌SUGL用LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，提取大腸桿菌SUGL的基因；以提取的基因組為模板，用Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)；PCR反應(yīng)產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶KpnI和XhoI雙酶切，將雙酶切目標(biāo)片段插入經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶雙酶切后的含有以硫氧還原蛋白為融合蛋白的表達(dá)載體，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，從轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌中提取質(zhì)粒pET32-appA；將含有重組表達(dá)質(zhì)粒pET32-appA的BL21(DE3)單菌落接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在其培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期加入誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，制備得到植酸酶。本發(fā)明制備的植酸酶保持較高酶活力的酸性pH范圍夠?qū)?，與畜禽腸道的環(huán)境相適應(yīng)，耐熱溫度有明顯提高。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101121928SQ20071004950
公開日2008年2月13日 申請(qǐng)日期2007年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月12日
發(fā)明者喬代蓉, 輝 徐, 毅 曹, 白林含 申請(qǐng)人:四川陽(yáng)光博睿生物技術(shù)有限公司