專利名稱：：一種胞外膽固醇氧化酶產(chǎn)生菌的分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種胞外膽固醇氧化酶產(chǎn)生菌的分離方法，屬于應(yīng)用微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。技術(shù)背景膽固醇氧化酶(cholesteroloxidase,COD)能將膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟戠?4-烯-3-酮，同時(shí)產(chǎn)生過(guò)氧化氫01202)，&02在過(guò)氧化物酶的作用下分解，可使4-氨基-安替比林與苯酚形成亞醌類呈紅色的化合物，在500nm處有最大吸收峰，通過(guò)測(cè)量反應(yīng)液在500m處的吸光度，可定量測(cè)定膽固醇被氧化的量(RichmondW.1973，PreparationandpropertiesofacholesteroloxidasefromNocardiasp.anditsapplicationtotheenzymaticassayoftotalcholesterolinserum.ClinChem19,1350-1356)。近年來(lái)，醫(yī)學(xué)研究證明血清高膽固醇與心臟病、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、肝膽疾病等人類疾病有關(guān)(MacLachlanJ，WotherspoonAT,AnsellRO,BrooksCJ.2000,Cholesteroloxidase:sources,physicalpropertiesandanalyticalapplications.JSteroid.BiochemMolBiol.72:169-195)。臨床上方便、準(zhǔn)確地檢測(cè)血液和食品中的膽固醇含量非常重要，對(duì)于糖尿病監(jiān)測(cè)和糖尿病并發(fā)癥的預(yù)防、心腦血管疾病診斷與預(yù)防等有著極其重要的作用(AihamH,WatanabeK,NakamuraR.1988,DegradationofcholesterolinEggyorkbyi/zoifococciw，z'No.23.JFoodSci53:659-660)。因此，在臨床上，膽固醇氧化酶大量用于血漿膽固醇含量的檢測(cè)。膽固醇氧化酶作為第二代生物殺蟲(chóng)劑，能夠有效地殺滅鞘翅目、鱗翅目、直翅目的害蟲(chóng)，具有良好的環(huán)境安全性(張銳，郭三堆.植物抗蟲(chóng)基因工程研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2001:8-12)。此外，膽固醇氧化酶在生產(chǎn)低膽固醇含量食品以及制備藥物中間體等方面均具有良好的應(yīng)用前景(AiharaH,WatanabeK,NakamuraR(1988)DegradationofcholesterolinEggyorkby及/zo(iococctAye，'No.23.JFoodSci53:659-660)。但目前能真正能應(yīng)用到臨床上膽固醇含量檢測(cè)的膽固醇氧化酶的種類單一，價(jià)格昂貴，主要原因在于產(chǎn)生膽固醇氧化酶的菌株產(chǎn)酶量低，多為胞內(nèi)產(chǎn)酶，加大了生產(chǎn)成本。而作為殺蟲(chóng)劑的膽固醇氧化酶也僅僅來(lái)源于一種鏈霉菌。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種胞外膽固醇氧化酶產(chǎn)生菌的分離方法，其特點(diǎn)是從自然環(huán)境、肉制品以及肉食動(dòng)物新鮮糞便中分離高效胞外膽固醇氧化酶產(chǎn)生菌。胞外膽固醇氧化酶產(chǎn)生菌的分離方法包括以下步驟l.采集魚(yú)、雞、豬、羊、牛肉制品、肉食動(dòng)物新鮮糞便以及富含膽固醇的自然或人工環(huán)境土樣或水樣，接種在以膽固醇為唯一碳源的液體富集培養(yǎng)基中，于溫度30-37'C振蕩富集，培養(yǎng)3-4天；取200pl培養(yǎng)液至新鮮的液體分離培養(yǎng)基中按照上述條件，重復(fù)3次，消除樣品中所含碳源的干擾；2.取上述培養(yǎng)懸液200iJl用無(wú)菌水稀釋到l(r5、10-6、10-7'、10-8、10"5個(gè)濃度梯度，分別涂布于固體分離培養(yǎng)基上，于溫度30-37T:培養(yǎng)3-4天，將出現(xiàn)的菌落接種牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)保存；3.將斜面上保存的菌株活化后在3ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，于溫度30-37r振蕩培養(yǎng)48h，取發(fā)酵液，加入等體積的醋酸乙酯混勻后，靜置過(guò)夜，取上層萃取液，在硅膠薄板上點(diǎn)樣，室溫下展開(kāi)自然干燥后，于254nra的紫外燈下觀察，硅膠薄板上出現(xiàn)黑色無(wú)熒光斑點(diǎn)者為膽固醇氧化酶催化膽固醇產(chǎn)生的膽甾-4-烯-3-酮，選取黑色無(wú)熒光斑點(diǎn)較大的菌株進(jìn)行下一步篩選；4.選取膽甾-4-烯-3-酮高產(chǎn)菌株進(jìn)一步液體發(fā)酵培養(yǎng)48h，檢測(cè)其發(fā)酵上清液的膽固醇氧化酶酶活性，從而篩選得到能產(chǎn)生胞外膽固醇氧化酶的菌株。為了有效的篩選到膽固醇氧化酶產(chǎn)生菌，本發(fā)明首先在富集培養(yǎng)過(guò)程中，以膽固醇為唯一碳源，并通過(guò)重復(fù)將培養(yǎng)液至新鮮的液體分離培養(yǎng)基反復(fù)富集培養(yǎng)，消除樣品中所含碳源的干擾，達(dá)到真正富集到能分解利用膽固醇的微生物的目的；所用的液體富集培養(yǎng)基的配方為膽固醇0.1，NaN030.1，KH2P040.025，MgS04.7H200.025，F(xiàn)eS040.0001，pH7.0，加適量溴麝香草酚蘭作為指示劑，在溫度115-121°C，濕熱滅菌20min。為了使富集培養(yǎng)獲得的混合菌株得到純化，采用稀釋涂平板的方法，將富集培養(yǎng)物稀釋為10—5、10—6、10-7、、l(T、1(T5個(gè)濃度梯度，分別涂布于固體分離培養(yǎng)基上，所述的固體分離培養(yǎng)基配方為酵母粉0.5，膽固醇0.1，吐溫-800.1，NaN030.1,KH2P040.025,MgS04-7H200.025,FeS040.0001，瓊脂2%，pH7.0，在溫度115-121°C，濕熱滅菌20min。在膽固醇氧化酶胞外產(chǎn)生菌的篩選過(guò)程中，首先采用硅膠薄板層析分析發(fā)酵上層萃取液中膽固醇轉(zhuǎn)化為膽甾-4-烯-3-酮的產(chǎn)量，初步篩選到膽固醇氧化酶胞外產(chǎn)生菌，以簡(jiǎn)化篩選流程。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為酵母粉0.5，膽固醇0.1，吐溫-800.1，NaNO30.1，KH2P040.025,MgS047H200.025,FeS040.0001,pH7.0，在溫度115-121°C，濕熱滅菌20min。按照季文明等(比色法測(cè)定膽固醇氧化酶酶活.無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2000:251-254)的方法測(cè)定膽固醇氧化酶酶活，具體步驟如下3mL溶液A(4-氨基-安替比林1mmol/L;苯酚6mmol/L;疊氮鈉0.2g/L;過(guò)氧化物酶7000U/L;磷酸鉀緩沖液25mraol/L，pH7.5)，150nL溶液B(膽固醇.-8.26mg/mL;TritonX-100:體積分?jǐn)?shù)4.26%;異丙醇為溶劑)，50"酶液，37°C，反應(yīng)5min，沸水浴3min，于500nm測(cè)吸光度。酶活(U/mL):1.6832XA500，酶活定義為在37t:，pH7.5的條件下，lmin內(nèi)催化l"mol膽固醇氧化為膽甾-4-烯-3-酮所需要的酶。利用本發(fā)明提供的篩選方法，篩選獲得多株胞外膽固醇氧化酶產(chǎn)生菌來(lái)源與產(chǎn)酶情況詳見(jiàn)表l所示。因此，本發(fā)明提供的篩選方法，具有如下優(yōu)點(diǎn)1、具有分離效率高、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，2、能為醫(yī)藥和工業(yè)用酶提供更廣泛的微生物來(lái)源，具有重要的應(yīng)用和價(jià)值。具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是本實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。實(shí)施例l:(l)采集魚(yú)、雞、豬、羊、牛肉制品，取lg樣品接種在以膽固醇為唯一碳源的液體富集培養(yǎng)基中，于溫度36。C振蕩富集，培養(yǎng)3天；取200pl培養(yǎng)液至新鮮的液體分離培養(yǎng)基中按照上述條件，重復(fù)3次，消除樣品中所含碳源的干擾；(2)取上述培養(yǎng)懸液200iJl用無(wú)菌水稀釋到10—5、l(T、10—7'、10—8、1(T5個(gè)濃度梯度，取200[jl稀釋液分別涂布于固體分離培養(yǎng)基上，于溫度30'C培養(yǎng)3天，將出現(xiàn)的菌落接種牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)保存；(3)將斜面上保存的菌株活化后在3ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，于溫度30。C振蕩培養(yǎng)48h,取發(fā)酵液，加入等體積的醋酸乙酯混勻后，靜置過(guò)夜，取上層萃取液，在硅膠薄板上點(diǎn)樣，室溫下展開(kāi)自然干燥后，于254nm的紫外燈下觀察，硅膠薄板上出現(xiàn)黑色無(wú)熒光斑點(diǎn)者為膽固醇氧化酶催化膽固醇產(chǎn)生的膽甾-4-烯-3-酮，選取黑色無(wú)熒光斑點(diǎn)較大的菌株進(jìn)行下一步篩選；(4)選取膽留-4-烯-3-酮高產(chǎn)菌株進(jìn)一步液體發(fā)酵培養(yǎng)48h，檢測(cè)其發(fā)酵上清液的膽固醇氧化酶酶活性，從而篩選得到能產(chǎn)生胞外膽固醇氧化酶的菌株。實(shí)施例2:(1)采集肉食動(dòng)物新鮮糞便，取lg樣品接種在以膽固醇為唯一碳源的液體富集培養(yǎng)基中，于溫度30'C振蕩富集，培養(yǎng)4天；取200pl培養(yǎng)液至新鮮的液體分離培養(yǎng)基中按照上述條件，重復(fù)3次，消除樣品中所含碳源的干擾；(2)取上述培養(yǎng)懸液200iJl用無(wú)菌水稀釋到10—5、10"、10—7'、10—8、10—95個(gè)濃度梯度，分別涂布于固體分離培養(yǎng)基上，于溫度3(TC培養(yǎng)3天，將出現(xiàn)的菌落接種牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)保存；(3)將斜面上保存的菌株活化后在3ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，于溫度30'C振蕩培養(yǎng)48h，取發(fā)酵液，加入等體積的醋酸乙酯混勻后，靜置過(guò)夜，取上層萃取液，在硅膠薄板上點(diǎn)樣，室溫下展開(kāi)自然干燥后，于254nm的紫外燈下觀察，硅膠薄板上出現(xiàn)黑色無(wú)熒光斑點(diǎn)者為膽固醇氧化酶催化膽固醇產(chǎn)生的膽甾-4-烯-3-酮，選取黑色無(wú)熒光斑點(diǎn)較大的菌株進(jìn)行下一步篩選；(4)選取膽甾-4-烯-3-酮高產(chǎn)菌株進(jìn)一步液體發(fā)酵培養(yǎng)48h，檢測(cè)其發(fā)酵上清液的膽固醇氧化酶酶活性，從而篩選得到能產(chǎn)生胞外膽固醇氧化酶的菌株。實(shí)施例3:(1)菌株的富集采集富含膽固醇的自然或人工環(huán)境土樣，取lg樣品于裝有5ml液體富集培養(yǎng)基的試管中，在溫度37。C下振蕩富集，培養(yǎng)3天；取200pl培養(yǎng)液至新鮮的液體分離培養(yǎng)基中按照上述條件，重復(fù)3次，消除樣品中所含碳源的干擾；觀察各試管中培養(yǎng)液的顏色變化，若培養(yǎng)液的顏色由原來(lái)為藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)榕囵B(yǎng)基本色或淺黃色，該試管中的培養(yǎng)液用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。(2)菌株的分離純化取上述培養(yǎng)懸液200iJl用無(wú)菌水稀釋到l(r5、10—6、10—7'、10—8、10—95個(gè)濃度梯度，分別涂布于固體分離培養(yǎng)基上，在溫度37'C下培養(yǎng)3天，將出現(xiàn)的菌落接種牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)保存；(3)初篩將斜面上保存的菌株活化后在3ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度37'C下振蕩培養(yǎng)48h，取發(fā)酵液，加入等體積的醋酸乙酯混勻后，靜置過(guò)夜，取上層萃取液，在硅膠薄板上點(diǎn)樣，室溫下展開(kāi)自然干燥后，于254nm的紫外燈下觀察，硅膠薄板上出現(xiàn)黑色無(wú)熒光斑點(diǎn)者為膽固醇氧化酶催化膽固醇產(chǎn)生的膽甾-4-烯-3-酮，選取黑色無(wú)熒光斑點(diǎn)較大的菌株進(jìn)行下一步篩選；(4)復(fù)篩選取膽甾-4-烯-3-酮高產(chǎn)菌株進(jìn)一步液體發(fā)酵培養(yǎng)48h，檢測(cè)其發(fā)酵上清液的膽固醇氧化酶酶活性，從而篩選得到能產(chǎn)生胞外膽固醇氧化酶的菌株。實(shí)施例4:(1)菌株的富集采集富含膽固醇的自然或人工環(huán)境水樣，取lml樣品于裝有5ml液體富集培養(yǎng)基的試管中，在溫度37t:下振蕩富集，培養(yǎng)3天；取200yl培養(yǎng)液至新鮮的液體分離培養(yǎng)基中按照上述條件，重復(fù)3次，消除樣品中所含碳源的干擾；觀察各試管中培養(yǎng)液的顏色變化，若培養(yǎng)液的顏色由原來(lái)為藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)榕囵B(yǎng)基本色或淺黃色，該試管中的培養(yǎng)液用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。(2)菌株的分離純化取上述培養(yǎng)懸液200pl用無(wú)菌水稀釋到10—5、l(T、l(T'、10—8、1(T5個(gè)濃度梯度，分別涂布于固體分離培養(yǎng)基上，在溫度37t:下培養(yǎng)3天，將出現(xiàn)的菌落接種牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)保存；(3)初篩將斜面上保存的菌株活化后在3ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度37'C下振蕩培養(yǎng)48h,取發(fā)酵液，加入等體積的醋酸乙酯混勻后，靜置過(guò)夜，取上層萃取液，在硅膠薄板上點(diǎn)樣，室溫下展開(kāi)自然干燥后，于254nm的紫外燈下觀察，硅膠薄板上出現(xiàn)黑色無(wú)熒光斑點(diǎn)者為膽固醇氧化酶催化膽固醇產(chǎn)生的膽甾-4-烯-3-酮，選取黑色無(wú)熒光斑點(diǎn)較大的菌株進(jìn)行下一步篩選；(4)復(fù)篩選取膽甾-4-烯-3-酮高產(chǎn)菌株進(jìn)一步液體發(fā)酵培養(yǎng)犯h，檢測(cè)其發(fā)酵上清液的膽固醇氧化酶酶活性，從而篩選得到能產(chǎn)生胞外膽固醇氧化酶的菌株。采用本發(fā)明的分離方法，能夠從富含膽固醇的人工或自然環(huán)境中，有效地分離到能產(chǎn)生高活性胞外膽固醇氧化酶的各種細(xì)菌菌株，從而為醫(yī)藥業(yè)、工業(yè)、農(nóng)業(yè)提供豐富的膽固醇氧化酶酶源。表l為13株不同來(lái)源細(xì)菌的胞外膽固醇氧化酶的檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權(quán)利要求1、一種胞外膽固醇氧化酶產(chǎn)生菌株的分離方法，其特征在于，該分離方法包括如下步驟(1)采集魚(yú)、雞、豬、羊、牛肉制品、肉食動(dòng)物新鮮糞便以及富含膽固醇的自然或人工環(huán)境土樣或水樣，接種至以膽固醇為唯一碳源的液體富集培養(yǎng)基中，于溫度30-37℃，振蕩富集，培養(yǎng)3-4天；取200μl培養(yǎng)液至新鮮的液體分離培養(yǎng)基中按照上述條件，重復(fù)3次，消除樣品中所含碳源的干擾；(2)取上述培養(yǎng)懸液200μl用無(wú)菌水稀釋到10-5、10-6、10-7、、10-8、10-95個(gè)濃度梯度，分別涂布于固體分離培養(yǎng)基上，于溫度30-37℃培養(yǎng)3-4天，將出現(xiàn)的菌落接種牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)保存；(3)將斜面上保存的菌株活化后，在3ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，30-37℃振蕩培養(yǎng)48h，取發(fā)酵液，加入等體積的醋酸乙酯混勻后，靜置過(guò)夜，取上層萃取液，在硅膠薄板上點(diǎn)樣，室溫下展開(kāi)自然干燥后，于254nm紫外燈下觀察，硅膠薄板上出現(xiàn)黑色無(wú)熒光斑點(diǎn)者為膽固醇氧化酶催化膽固醇產(chǎn)生的膽甾-4-烯-3-酮，選取黑色無(wú)熒光斑點(diǎn)較大的菌株進(jìn)行下一步篩選；(4)選取膽甾-4-烯-3-酮高產(chǎn)菌株進(jìn)一步液體發(fā)酵培養(yǎng)48h，檢測(cè)其發(fā)酵上清液的膽固醇氧化酶酶活性，從而篩選得到能產(chǎn)生胞外膽固醇氧化酶的菌株。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的膽固醇氧化酶胞外產(chǎn)生菌的分離方法，其特征在于，所述的液體富集培養(yǎng)基的配方組分為膽固醇0.1，NaN030.1,KH2P040.025，MgS(V7H200.025，F(xiàn)eS040.0001'pH7.0，加適量溴麝香草酚蘭作為指示劑，在溫度115-12rC，濕熱滅菌20min。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的膽固醇氧化酶胞外產(chǎn)生菌的分離方法，其特征在于，所述的固體分離培養(yǎng)基配方組分為酵母粉0.5，膽固醇0.1，吐溫-800.1，NaN030.1,KH2P040.025,MgSCV7H200.025,FeS040.0001,瓊脂2%，pH7.0,在溫度115-121°C，濕熱滅菌20min。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的膽固醇氧化酶胞外產(chǎn)生菌的分離方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方組分為酵母粉0.5，膽固醇0.1,吐溫-800.1，NaN030.1,KH2P040.025，MgS047H200.025,FeS040.0001，pH7.0，在溫度115-121°C，濕熱滅菌20min。全文摘要一種胞外膽固醇氧化酶產(chǎn)生菌的分離方法，其特點(diǎn)是從自然環(huán)境、肉制品以及肉食動(dòng)物新鮮糞便中分離產(chǎn)生胞外膽固醇氧化酶的菌株。該方法包括以下步驟a.采集土樣或水樣等樣品，接種在以膽固醇為唯一碳源的液體分離培養(yǎng)基中，富集培養(yǎng)；b.利用稀釋涂平板的方法，在固體分離培養(yǎng)基上純化菌落；c.在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，用醋酸乙酯萃取發(fā)酵液，用硅膠薄板層析分析萃取液中膽甾-4-烯-3-酮的產(chǎn)量，篩選膽甾-4-烯-3-酮產(chǎn)量高的菌株；d.選取膽甾-4-烯-3-酮高產(chǎn)菌株進(jìn)一步發(fā)酵培養(yǎng)，檢測(cè)其發(fā)酵上清液的膽固醇氧化酶酶活性，從而篩選得到能產(chǎn)生胞外膽固醇氧化酶的菌株。文檔編號(hào)C12N1/20GK101215531SQ20071005102公開(kāi)日2008年7月9日申請(qǐng)日期2007年12月29日優(yōu)先權(quán)日2007年12月29日發(fā)明者維李,葛方蘭,陳貴英申請(qǐng)人:四川師范大學(xué)