專利名稱：豬產(chǎn)肉性狀相關(guān)基因btg1的克隆及其在豬分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及豬生產(chǎn)性狀相關(guān)基因BTG1基因的克隆以及其在豬分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
自古以來，豬在我國一直是六畜之首。養(yǎng)豬業(yè)的起伏，更是牽動著人民的生活水平的提高。豬肉在全世界的消費量占紅色肉類消費總量的43％，并且豬是人類身體的重要模式系統(tǒng)同時也是未來器官移植的重要來源(Rothschild.From a sow′s ear to a silk pursereal progress in porcine genomics.Cytogenetic and GenomeResearch.2003，10295-99)。因此對豬的研究不管是從國民經(jīng)濟角度出發(fā)還是從人類健康角度出發(fā)，都有著重要的實際意義。
我國是世界上養(yǎng)豬最早的國家之一，養(yǎng)豬的歷史達幾千年之久，經(jīng)過祖先辛勤的飼養(yǎng)和選育，形成了許許多多各具特色的地方品種。長期以來，豬的育種以提高生長速度、減少飼料消耗、增加瘦肉率為主要目標(biāo)，并已取得顯著成績。在豬的瘦肉率和生長速度大幅度提高的同時，傳統(tǒng)的育種手段也遭遇到發(fā)展的瓶頸，已經(jīng)很難象過去那樣大幅度地提高豬的生產(chǎn)水平和抗病能力了。豬生產(chǎn)水平的提高實際上降低了豬的體質(zhì)和適應(yīng)性，并影響到豬的肌肉品質(zhì)。隨著我國社會經(jīng)濟的發(fā)展，人民生活水平與消費水平的提高，帶來了人們膳食結(jié)構(gòu)與飲食觀念的變化，消費者對豬肉品質(zhì)的要求也越來越高。這些出現(xiàn)的一系列的新矛盾和新問題，迫切需要用新的手段和對策解決豬的育種問題。
分子生物學(xué)的飛速發(fā)展使得豬的育種工作出現(xiàn)了新的曙光。利用遺傳學(xué)或分子生物學(xué)手段對傳統(tǒng)育種工作的不足之處進行了強有力的補充，也使得豬的育種能夠突破傳統(tǒng)育種工作面臨的瓶頸問題，大大地促進了豬育種工作的發(fā)展。目前，標(biāo)記輔助選擇(MAS)、影響豬重要數(shù)量性狀的基因組區(qū)域定位(QTL)、用基因組掃描(genome scanning)法和候選基因法(Candidate gene approach)研究影響豬重要經(jīng)濟性狀的主效基因(Economic traits loci，ETLs)已經(jīng)成功地應(yīng)用到國內(nèi)外的豬育種實踐當(dāng)中，取得了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)在動物育種中的應(yīng)用，世界各國豬的育種技術(shù)已邁入分子育種階段。
通過候選基因法與標(biāo)記輔助選擇(MAS)，已經(jīng)找到了一些影響豬的生產(chǎn)性狀的基因。Casas-Carrillo等(Casas-Carrillo等，Relationship of growth hormone and insulin-like growth factor-1 genotypes with growthand carcass traits in swine.Anim Genet，1997，28(2)88-93.)在以6頭公豬與18頭無相關(guān)的母豬雜交群體中，發(fā)現(xiàn)在一個公豬家系中位于豬5號染色體上的類胰島素樣生長因子1(Insulin like growth factor 1，IGF-1)基因型與斷奶后日增重存在連鎖(LOD＝2.3)；Nezer等(Nezer等，An imprinted QTL with major effect on musclemass and fat deposition maps to the IGF2 locus in pigs.Nat Genct.1999，21(2)155-6.)以大約克與皮特蘭雜交的677頭后代作為試驗對象，研究了影響體脂與肌肉性狀的QTL，同樣發(fā)現(xiàn)了位于2號染色體短臂的QTL，同時篩選到2個候選基因MYODI和IGF-II；位于豬9號染色體上的肌細胞生成素(Myogenin)是MyoD基因家族的成員，Te Pas等(Te Pas等，Influences of myogenin genotypes on birth weight，growth rate，carcass weight，backfat thickness，and lean weight of pigs.J Anim Sci，1999，772352-2356)在兩個大白豬群中檢測了該基因的多態(tài)性，分析發(fā)現(xiàn)不同基因型的個體在出生重、生長速度和瘦肉量等性狀上有顯著差異。對兩個選擇系肌肉的MyoD基因家族成員mRNA表達水平比較發(fā)現(xiàn)F-系(選擇生長速度)中myogenin、myf-5、MyoD1的mRNA表達水平比L-系(選擇瘦肉率)高，在F-系中，背膘厚與成肌細胞的表達成負相關(guān)(Te Pas等，Messenger ribonucleic acid expression of the myoD gene family in muscle tissue at slaughter in relation toselection for porcine growth rate.J Anim Sci，2000，769-77)；Fujii等(Fujii等，Identification ofa mutation inporcine Ryanodine Receptor Associated With Malignant Hypothermia.Science，1991，253448-451.)發(fā)現(xiàn)氟烷基因(Hal)是導(dǎo)致豬產(chǎn)生灰白水樣肉(Pale，soft，exudative pork，PSE肉)的主效基因，該基因的編碼產(chǎn)物為鈣釋放通道蛋白(calcium release channel，CRC)或蘭尼定受體1(ryanodine receptor 1，RYR1)。如果豬只攜帶兩個隱性突變基因(nn)就發(fā)生豬應(yīng)激綜合征(Porcine stress syndrome，PSS)，嚴(yán)重影響到豬的存活率和豬肉品質(zhì)，導(dǎo)致豬的應(yīng)激死亡和產(chǎn)生劣質(zhì)肉(PSE肉)，但隱性基因卻對胴體性狀具有正效應(yīng)(Hamilton等，The effect of the Halothane and Rendement Napole genes on carcass and meat quality characteristics of pigs.JAnim Sci，2000，78(11)2862-7)。進一步的研究也證明，RYR1位點的突變雖然對肉質(zhì)性狀具有負效應(yīng)，但對幾乎所有的胴體組成性狀均具有正效應(yīng)，有商業(yè)價值的RYR1位點基因型的簡化DNA檢測法已成為專利并得到廣泛應(yīng)用(彭中鎮(zhèn)等，豬數(shù)量性狀基因及其標(biāo)記研究進展.國外畜牧科技，1999，26(1)28-32)；RN(Rendement Napole)基因又稱酸肉基因，Le Roy等(LeRoy等，Evidence for a new major gene influencing meatquality in pigs.Genet Res，1990，55(1)33-40)首先在漢普夏豬及其雜種中發(fā)現(xiàn)不利等位基因RN-可使肌肉中肌糖原含量升高，終端pH值降低，造成酸肉和烹調(diào)損失，豬肉工藝學(xué)品質(zhì)下降，影響火腿的產(chǎn)量。Milan等(Milan等，A mutation in PRKAG3 associated with excess glycogen content in pig skeletal muscle.Science，2000，288(5469)1248-51)通過對候選區(qū)域進行大規(guī)模的測序分析，發(fā)現(xiàn)單磷酸腺苷活化酶γ3亞基基因(AMP-activated protein kinase(AMPK)，γ-subunit 3，PRKAG3)編碼第200位氨基酸的密碼子的錯義突變與漢普夏豬的酸肉表型直接相關(guān)，RN-豬的該位點均為不利的等位基因Q(即谷氨酰胺)。Ciobanu等(Ciobanu等，Evidence for new alleles in the protein kinase adenosine monophosphate-activated gamma(3)-subunit geneassociated with low glycogen content in pig skeletal muscle and improved meat quality.Genetics，2001，159(3)1151-62)在1800個商品豬群中對該基因進行分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了新的等位基因與肌糖原含量相關(guān)并進一步影響肉質(zhì)性狀。與Milan等發(fā)現(xiàn)的位點不同的是，這個位點的不同等位基因不僅僅在漢普夏豬中分離，它在典型的商品豬群中多態(tài)性也比較豐富，對育種具有更廣泛的適用價值；豬FOS原癌基因(proto-oncogene)被認(rèn)為是骨骼肌肌纖維特性的候選基因，位于豬7號染色體上影響肌纖維的QTL區(qū)域內(nèi)。Reiner等(Reiner等，Indications of associations of the porcine FOS proto-oncogene with skeletal muscle fibre traits.Anim Genet，2002，33(1)49-55)報道了FOS染色體區(qū)域與骨骼肌纖維特性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)代表歐洲豬種的BB基因型個體比AA基因型梅山豬的白肌纖維多10.9％。
本實驗室長期以來致力于豬重要功能基因的分離鑒定工作，曾經(jīng)利用代表性差異顯示技術(shù)、基因芯片技術(shù)、基因表達序列分析技術(shù)(SAGE)等分離了一些與經(jīng)濟性狀有關(guān)的基因，并對其中一些效應(yīng)顯著的基因進行了功能分析。BTG1基因正是從本室構(gòu)建的長白和通城豬胚胎發(fā)育不同時期的骨骼肌SAGE文庫中篩選出來的對骨骼肌發(fā)育具有顯著影響的基因。BTG1基因是抗增殖基因家族BTG/TOB家族成員之一，在脊椎動物中該家族至少包括6種不同的成員，即BTG1、BTG2/TIS21/PC3、BTG3/ANA、TOB及TOB2、PC3b。它們蛋白質(zhì)N端110個氨基酸具有高度同源性，這個同源區(qū)包括兩個短的、高度保守的同源區(qū)A-box和B-box，A-box具有抗增殖作用，B-box具有同許多靶分子結(jié)合的功能(Matsuda等，In search of a function forthe TIS21/PC3/BTG1/TOB family.FEBS Lett，2001，49767-72)。越來越多的研究表明，BTG1基因抑制成肌細胞的增殖并刺激它們的分化(Marchal等，Stimulation of avian myoblast diferentiation by triiodothyroninepossible involvement of the cAMP pathway.Exp Cell Res，1995，2201-10)。Rodier等(Rodier等，BTG1atriiodothyronine target involved in the myogenic influence of the hormone.Exp Cell Res，1999，249(2)337-48)認(rèn)為，BTG1除了抗增殖作用之外，對細胞的分化和器官形成也起著重要作用。Kenji等(Kenji等，Ananti-proliferative gene BTG1 regulates angiogenesis in vitro.Biochem Biophys Res Commun，2004，316(3)628-635.)認(rèn)為BTG1在上皮細胞向管狀的形成過程中上調(diào)，尤其在血管發(fā)生過程中起著重要作用。Busson等(Busson等，Coactivation of nuclear receptors and myogenic factors induces the major BTG1 influence onmuscle differentiation.Oncogene，2005，24(10)1698-710)發(fā)現(xiàn)，BTG1能夠刺激細胞核受體、c-JUN和一些成肌因子(CMD1，myf5，myogenin)的活性，這種作用通過轉(zhuǎn)錄因子相應(yīng)的激活域、BTG1的A盒和C末端介導(dǎo)。所有這些表明，BTG1基因可能在肌纖維的早期發(fā)育過程中起到重要作用。
豬瘦肉產(chǎn)量和質(zhì)量在遺傳因素上主要取決于胚胎發(fā)育期肌纖維數(shù)量的增生和生后期肌纖維體積的膨大(Nissen等，Within-litter variation in muscle fiber characteristics，pig performance，and meat quality traits.JAnim Sci，2004，82，414-21)。除了對生產(chǎn)性狀的常規(guī)選擇之外，肌纖維的數(shù)量和體積的遺傳變異與遺傳力是很高的(Rehfeld等，Myogenesis and postnatal skeletal muscle cell growth as influenced by selection.LivestockProduction Science，2000，66177-188)。豬日增重和肌肉生長速度與胚胎期形成的肌纖維數(shù)目呈正相關(guān)，同時也受肌纖維中蛋白質(zhì)的合成和降解速度差異的影響，但胚胎肌發(fā)生時期形成的肌纖維數(shù)量是動物產(chǎn)肉量的重要決定因素。肌肉的生長暨肌纖維的發(fā)育是一個涉及到大批基因表達與調(diào)控的復(fù)雜過程，雖然目前已經(jīng)對參與肌發(fā)生過程的相關(guān)基因有一定認(rèn)識，如MRFs(myogenic regulatory factors)家族，MEF2基因家族等等，但更多的影響肌纖維形成與發(fā)育的基因有待鑒定。
鑒于BTG1基因?qū)Τ杉〖毎淖饔?，我們認(rèn)為它很可能在豬的肌纖維發(fā)育過程中起到重要作用，進而影響豬的重要經(jīng)濟性狀-生產(chǎn)性狀。但是到目前為止，仍沒見到研究豬BTG1基因功能的報導(dǎo)。研究突變位點在群體中的多態(tài)性，并進行性狀關(guān)聯(lián)分析是研究基因功能的一個非常有力的手段。所以申請人對這個基因進行了多態(tài)研究和關(guān)聯(lián)分析，以期能夠發(fā)現(xiàn)它對生產(chǎn)性狀的影響。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克隆豬生產(chǎn)性狀相關(guān)基因BTG1，尋找BTG1基因的突變位點以及作為豬生產(chǎn)性狀相關(guān)基因的多態(tài)性檢測方法，為標(biāo)記輔助育種提供一種有用的分子標(biāo)記。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的 一種豬生產(chǎn)性狀相關(guān)基因BTG1，它的DNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。
PCR擴增的BTG1基因的目的片段全長為578bp，其序列如附圖5所述。
所獲得的BTG1基因目的片段的DNA序列中有如附圖3所述的A179-T179和C280-T280兩處堿基突變，分別導(dǎo)致Psu1-RFLP和Bsh1236I-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)多態(tài)性。
一種篩選適用于豬生產(chǎn)性狀分子標(biāo)記的方法，按照以下步驟制備 用人BTG1基因的mRNA序列為信息探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank豬EST數(shù)據(jù)庫中做同源序列篩選，獲得一系列同源性為90％以上的豬ESTs(片段長度大于100bp)序列，然后拼接豬EST-重疊群，獲得豬BTG1基因的cDNA序列全長。設(shè)計擴增引物，從豬血液基因組提取DNA，PCR擴增、PCR產(chǎn)物純化和克隆測序，應(yīng)用PCR產(chǎn)物直接測序的方法檢測豬BTG1基因擴增目的片段第179和280位的多態(tài)性，并進行其基因型與豬的部分生產(chǎn)性狀之間的關(guān)聯(lián)分析。本發(fā)明為豬的分子育種提供了一個新的遺傳標(biāo)記。
依照本發(fā)明，豬生產(chǎn)性狀相關(guān)基因BTG1可以用于豬分子標(biāo)記輔助選擇中 以下對本發(fā)明作進一步的描述 1、BTG1基因的cDNA 3’UTR部分序列的克隆 (1)引物設(shè)計 用人BTG1基因的mRNA序列(GenBank登錄號NM_001731)為信息探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank豬EST數(shù)據(jù)庫中做同源序列篩選，獲得一系列同源性為90％以上的豬ESTs(片段長度大于100bp)序列，然后用DNAstar中的SeqMan程序構(gòu)建豬EST-重疊群，并獲得由重疊群拼接構(gòu)成的一致序列(consensus)，將獲得的一致序列與人的mRNA作同源性比對以確認(rèn)序列的正確性。然后用Primer Premier5.0軟件設(shè)計引物擴增豬BTG1基因3’-UTR區(qū)578bp的片段。引物序列如下 B1POLF5’-TAAGTGACAGTGCCATAGTT-3’(正向)， B1POLR5’-CAAACCAGACCTCCACTT-3’ (反向) (2)PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測序 PCR產(chǎn)物的純化在紫外燈下從低熔點瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mL Ependorff管中，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(購自Promega公司)純化PCR產(chǎn)物，按照該試劑盒說明書操作，具體步驟是每100mg的凝膠中加300μL的S1液，于65℃溫育10min至凝膠完全融化，將S1/DNA混合物轉(zhuǎn)入回收柱，9200g離心30s，使?jié){液通過Minicolumn擠出。將下面管子中的廢液倒掉，再加入500μL的W1液至管中，9200g離心15s，倒掉管中的廢液。再加入500μL的W1液，靜置1min，9200g離心30s，取下Minicolumn裝入1.5mlEpendorff管中，加入25μL的滅菌水或者TE液，靜置1min之后，9200g離心1min，以洗脫DNA存于Ependorff管中。
連接反應(yīng)將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體(購自TAKARA公司)連接，連接反應(yīng)總體積是5μl，其中包括2.5μl2×ligation buffer，0.5μl載體，1μl純化PCR產(chǎn)物，最后加入1μl滅菌水置4℃水浴過夜。
感受態(tài)細胞的制備從37℃培養(yǎng)了16～20h的新鮮平板上挑取一個DH5α單菌落接種于2ml LB中，于37℃振蕩培養(yǎng)3h，轉(zhuǎn)接1ml菌液于含有30ml LB的鹽水瓶中，繼續(xù)在37℃振蕩培養(yǎng)約4h，待OD600達到0.3～0.4時將鹽水瓶從搖床取出置冰浴冷卻10～15min，然后將菌液轉(zhuǎn)入離心管中于4℃ 4,000g離心10min以收集細胞，將離心管倒置以棄凈培養(yǎng)液，用10ml冰預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，冰浴30min，重復(fù)4℃ 4,000g離心10min一次，用4ml冰預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2重懸沉淀，置4℃保存?zhèn)溆谩?br> 轉(zhuǎn)化無菌狀態(tài)下取100～20μl感受態(tài)細胞于1.5ml Ependorff管中，將5μl的連接產(chǎn)物加入混勻，在冰上放置30min后42℃熱激90s，其間不要搖動Ependorff管，取出后冰浴3～4min，加入400μl無抗生素的LB液體養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的含Amp的瓊脂平板上，37℃平放1h后倒置培養(yǎng)。
克隆子通過PCR鑒定為陽性的用于送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。將大白、杜洛克和梅山三個品種的各一個克隆子分別測序或混合測序，測序結(jié)果用SeqmanTM軟件比對尋找可能的SNP。
2.標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析 利用申請人與中國湖北省通城縣畜牧局種畜場合作組建的試驗群體(含純種通城豬、長白豬、大白豬、大白×長白×通城、長白×大白×通城)為實驗對象進行性狀關(guān)聯(lián)分析。所分析的性狀有部分生長性狀，部分胴體性狀和部分肉質(zhì)性狀。對基因型資料用如下模型進行性狀關(guān)聯(lián)分析 Yijkl＝μ+Gi+Bj+Sk+εijkl Yijkl表示觀測值，μ表示均值，Gi表示基因型效應(yīng)，Bj表示組合效應(yīng)，Sk表示性別效應(yīng)，εijkl表示殘差，假定服從N(0，Iσ2)分布。
本發(fā)明的效果是 1、豬BTG1基因部分DNA序列的克隆 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示均為特異的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物回收純化后克隆測序，測序結(jié)果顯示PCR產(chǎn)物的長度為578bp。測序結(jié)果表明在該片段的179bp處存在A、T兩個等位基因，測序峰圖見圖3A；在該片段的280bp處存在C、T兩個等位基因，測序峰圖見圖3B。
2、PCR-RFLP診斷方法建立 用B1POLF和B1POLR擴增豬基因組DNA得到578bp特異擴增片段(附圖2)。測序的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該578bp片段中存在PsuI酶切位點(R*GATCY)和Bsh1236I酶切位點(CG*CG)，其中第176-177bp間為PsuI酶的多態(tài)性切點，第279-280bp間為Bsh1236I酶的多態(tài)性切點。擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)PsuI酶切產(chǎn)生三種基因型，其中AA基因型只有578bp的一條帶，雜合子AT型有578bp，402bp和176bp三條帶，TT型有176bp和402bp兩條帶，用2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測能明顯的判別帶型(圖4A)；PCR產(chǎn)物經(jīng)Bsh1236I酶切產(chǎn)生三種基因型，CC基因型有279bp和299bp兩條帶，雜合子CT型有578bp，279bp和299bp三條帶，TT型只有578bp一條帶，用2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測電泳時間較短時279bp和299bp兩條帶不易分開，但不影響判型(圖4B)。
3、標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析 對豬BTG1基因3’UTR區(qū)擴增序列PsuI-RFLP多態(tài)性位點與部分生產(chǎn)性狀進行關(guān)聯(lián)分析，基因型檢測結(jié)果表明在179個個體中AA基因型有144個，AT基因型有33個，TT基因型有2個。不同基因型與性狀之間顯著差異的結(jié)果(最小二乘均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤分析)見表1，其它性狀在不同的基因型之間沒有顯著的差異。
分析結(jié)果表明，該位點的基因型與肩膘、6-7肋膘厚、屠宰率以及肉色存在顯著相關(guān)。AT型肩膘顯著高于純合基因型AA和TT型；AT型6-7膘厚顯著高于TT型；TT型屠宰率顯著高于AA型；AA型肉色顯著高于AT型。AT基因型是有利于提高膘厚的選擇標(biāo)記，TT基因型是有利于屠宰率的選擇標(biāo)記，AA基因型是有利于肉色的選擇標(biāo)記。T等位基因是胴體性狀的有利標(biāo)記，A等位基因是肉質(zhì)性狀的有利標(biāo)記。
表1 豬BTG1基因3’-UTR區(qū)PsuI酶切基因型與幾個生產(chǎn)性狀的相關(guān)分析 *表示差異顯著(p＜0.05)，**表示差異極顯著(p＜0.01)。
對豬BTG1基因3’UTR區(qū)擴增序列Bsh1236I-RFLP多態(tài)性位點與部分生產(chǎn)性狀進行關(guān)聯(lián)分析，基因型檢測結(jié)果表明在通城試驗豬群184頭豬中，CC基因型有68個，CT基因型有92個，TT基因型有24個。不同基因型與性狀之間顯著差異的結(jié)果(最小二乘均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤分析)見表2，其它性狀在不同的基因型之間沒有顯著的差異。
分析結(jié)果表明，該位點的基因型與肉色及肌內(nèi)脂肪含量存在顯著相關(guān)，CC基因型的肉色和肌內(nèi)脂肪含量顯著高于CT基因型。CC基因型是有利于肉質(zhì)的選擇標(biāo)記。
表2 豬BTG1基因3’-UTR區(qū)Bsh1236I酶切基因型與幾個肉質(zhì)性狀的相關(guān)分析 *表示差異顯著(p＜0.05)，**表示差異極顯著(p＜0.01)。



序列表SEQ ID NO1是本發(fā)明克隆的豬生長性狀相關(guān)基因BTG1的DNA序列。
圖1是本發(fā)明關(guān)于BTG1基因制備的流程圖。
圖2是本發(fā)明中豬BTG1基因3’UTR區(qū)擴增序列的電泳圖譜，片段大小為578bp(瓊脂糖膠濃度為2％)。MDNA分子量標(biāo)記(DL2000 ladder)。
圖3A是本發(fā)明中豬BTG1基因測序發(fā)現(xiàn)的179bp處存在A、T兩個等位基因；圖3B本發(fā)明中豬BTG1基因測序發(fā)現(xiàn)的280bp處存在C、T兩個等位基因。
圖4A是本發(fā)明中豬BTG1基因擴增序列的PsuI-RFLP三種基因型電泳圖譜；圖4B是本發(fā)明中豬BTG1基因擴增序列Bsh1236I-RFLP的三種基因型電泳圖譜。MDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000 ladder) 圖5是本發(fā)明的豬BTG1基因位于3’UTR區(qū)的擴增DNA序列，括號中所示的為堿基突變。

具體實施例方式 實施例1(1)PCR-RFLP-PsuI多態(tài)性在各豬品種中的分布與檢測的應(yīng)用 利用PCR-PsuI-RFLP檢測了七個豬種其中包括來自歐洲血緣的外來豬品種(下同)大白豬、長白豬和杜洛克豬，來自中國地方豬血緣的品種(下同)通城豬、二花臉豬、清平豬和江西玉山豬，這些豬種基本涵蓋各豬種的基因型。試驗使用的豬種的基因頻率如表3所示，檢測發(fā)現(xiàn)長白、大白、通城、二花臉和清平豬中等位基因A占優(yōu)勢，杜洛克和江西玉山豬中等位基因T占優(yōu)勢。
表3 BTG1基因PCR-RFLP-PsuI基因型頻率及基因頻率的檢測 幾個品種間基因型頻率的卡方檢驗結(jié)果如表4。χ2檢驗表明，杜洛克和玉山豬與長白、大白、通城、二花臉、清平豬之間存在顯著或極顯著差異，長白、大白之間差異不顯著。
表4 BTG1基因?qū)Σ煌i品種基因型分布χ2檢驗結(jié)果 注肩注*表述P＜0.05；肩注**表述P＜0.01；df＝2，χ20.05(2)＝5.99，χ20.01(2)＝9.21 (2)PCR-RFLP-Bsh1236I多態(tài)性在各豬品種中的分布與檢測 利用PCR-Bsh1236I-RFLP檢測了同樣的七個豬種。試驗使用的豬種的基因頻率如表5所示。結(jié)果顯示杜洛克、通城、二花臉、清平豬和江西玉山豬中C等位基因占優(yōu)勢，長自豬中T等位基因占優(yōu)勢，大白豬中兩種基因頻率相同。
表5 BTG1基因?qū)Σ煌i品種PCR產(chǎn)物基因型頻率及基因頻率的檢測 幾個品種間基因型頻率的卡方檢驗結(jié)果如表6。χ2檢驗結(jié)果表明杜洛克、通城、二花臉、清平和玉山豬與長白、大白豬之間存在極顯著差異。
表6 BTG1基因PCR-RFLP-Bsh1236I基因型分布χ2檢驗結(jié)果 注肩注*表述P＜0.05；肩注**表述P＜0.01；df＝2，χ20.05(2)＝5.99，χ20.01(2)＝9.21 實施例2豬標(biāo)記-性狀關(guān)聯(lián)分析的應(yīng)用舉例 用BTG1基因檢測了通城試驗豬群179頭豬，對該基因3’-UTR區(qū)擴增序列PsuI-RFLP多態(tài)檢測的三種基因型與通城試驗豬群部分生產(chǎn)性狀進行了初步相關(guān)分析?；蛐蜋z測結(jié)果表明在179個個體中AA基因型有144個，AT基因型有33個個體，TT基因型有2個。分析結(jié)果表明，該位點的基因型與肩膘、6-7肋膘厚、屠宰率以及肉色存在顯著相關(guān)。AT型肩膘顯著高于純合基因型AA和TT型；AT型6-7膘厚顯著高于TT型；TT型屠宰率顯著高于AA型；AA型肉色顯著高于AT型。
表7 豬BTG1基因3’-UTR區(qū)PsuI酶切基因型與幾個生產(chǎn)性狀的相關(guān)分析 *表示差異顯著(p＜0.05)，**表示差異極顯著(p＜0.01)。
對豬BTG1基因3’UTR區(qū)擴增序列Bsh1236I-RFLP多態(tài)的基因型與部分生產(chǎn)性狀進行關(guān)聯(lián)分析，基因型檢測結(jié)果表明在通城試驗豬群184頭豬中，CC基因型有68個，CT基因型有92個，TT基因型有24個。分析結(jié)果表明，該位點的基因型與肉色及肌內(nèi)脂肪含量存在顯著相關(guān)，CC基因型的肉色和肌內(nèi)脂肪含量顯著高于CT基因型。
表8 豬BTG1基因3’-UTR區(qū)Bsh1236I酶切基因型與幾個肉質(zhì)性狀的相關(guān)分析檢測 *表示差異顯著(p＜0.05)，**表示差異極顯著(p＜0.01)。
序列表
<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120>豬產(chǎn)肉性狀相關(guān)基因BTG1的克隆及其應(yīng)用
<130>
<141>2007-05-22
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>578
<212>DNA
<213>豬(Sus scrofa)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(578)
<223>
<220>
<221>mutation
<222>(280)..(280)
<223>
<220>
<221>mutation
<222>(179)..(179)
<223>
<400>1
taagtgacag tgccatagtt tggacagtac ctttcaatga cttaatagcc tgtgagtcca 60
agtaaattga tcaccttatt tgctagggag tgaagtcctg gggtggtttc agtttctccc 120
ggacatgata cctaaatttt tacatcagtc cctttaacac aaatccatat ttcaaagarc 180
ctttctctgc ggtagaactt ggcagaggaa atttgcacta ttacacttaa attgttatcc 240
tttttggcag ctcgatagga aagctcaaca ttttaaacgy ggtagtactg gaaattttat 300
aacaagactt ttacctagca cttaaatatg tataaatgta cataagacaa aactagtaag 360
catgacctgg ggaaatggtc agaccttgta ttgtgttttt ggccttgaaa gtagcaagtg 420
accagaatct gccatggcaa caggctttaa aaaagacctt aaaaagacac tgtctcaact 480
gtggtgttag caccagccag ctctctgtac atttgctagc ttgtagtttt ctaagactga 540
gtaaacttct tatttttaga aagtggaggt ctggtttg 578
權(quán)利要求
1.一種豬生產(chǎn)性狀相關(guān)基因BTG1，它的DNA序列如SEQ ID NO1所述。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征在于序列表SEQ ID NO1的第179bp處有一個A179-T179的堿基突變，導(dǎo)致Psu1-RFLP多態(tài)性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA序列，其特征在于序列表SEQ ID NO1的第280bp處有1個C280-T280的堿基突變，導(dǎo)致Bsh1236I-RFLP多態(tài)性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬生產(chǎn)性狀相關(guān)基因BTG1，其中克隆BTG1基因所用的引物序列如下所示
正向引物5’-TAAGTGACAGTGCCATAGTT～3’，
反向引物5’-CAAACCAGACCTCCACTT-3。
5.權(quán)利要求1、2或3所述的豬生產(chǎn)性狀相關(guān)基因BTG1在豬分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求4所述的引物在豬分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
7.一種篩選豬生產(chǎn)性狀分子標(biāo)記方法，按照以下步驟
用人BTG1基因的mRNA序列為信息探針，做同源序列篩選，獲得片段長度大于100bp，同源性為90％以上的豬ESTs序列，構(gòu)建豬EST-重疊群，并獲得由重疊群拼接構(gòu)成的一致序列，將獲得的一致序列與人的mRNA比對同源性以確證序列的正確性，用權(quán)利要求4的引物進行PCR擴增，對獲得的PCR產(chǎn)物純化、克隆和測序，進行序列分析，獲得如序列表SEQ ID NO1所述的DNA序列。
全文摘要
本發(fā)明屬于動物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及豬產(chǎn)肉性狀相關(guān)基因BTG1的克隆及其在豬分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。本發(fā)明克隆得到如序列表SEQIDNO1所示的豬產(chǎn)肉性狀相關(guān)BTG1基因序列，其中在SEQIDNO1的第179bp處有一個A179-T179的堿基突變，第280bp處有1個C280-T280的堿基突變，分別導(dǎo)致Psu1-RFLP多態(tài)性和Bsh1236I-RFLP多態(tài)性。本發(fā)明還公開了獲得上述基因和引物的制備方法，為豬的分子標(biāo)記輔助選擇提供了新的分子標(biāo)記。
文檔編號C12N15/12GK101148668SQ200710053198
公開日2008年3月26日 申請日期2007年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月12日
發(fā)明者趙書紅, 政 馮, 鶴 沈, 奎 李, 梅 余, 朱猛進, 李長春, 斌 樊, 榜 劉 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)