專利名稱：以無血培養(yǎng)基制備a群鏈球菌制劑的方法及無血培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，涉及一種利用無血培養(yǎng)基代替血培養(yǎng)基 制備A群鏈球菌制劑的方法，特別涉及一種以無血培養(yǎng)基制備A群鏈球菌制劑 的方法及無血培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
A群鏈球菌制劑又稱OK-432，屬于生物治療藥物，是A群鏈球菌弱毒株經(jīng)
培養(yǎng)、擴(kuò)增、青霉素處理后制成的凍干品，已應(yīng)用于臨床治療，如癌性胸腹水
及惡性腫瘤的免疫治療等，其性能穩(wěn)定且抗癌療效顯著。但由于傳統(tǒng)制備工藝
中常用含血及血漿培養(yǎng)基，使該制劑成本相對(duì)較高，并且容易帶入異源性物質(zhì)，
增加熱源物質(zhì)含量，注射給藥易引起患者的過敏反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以無血培養(yǎng)基制備A群鏈球菌制劑的方法。 本發(fā)明的另一 目的是提供一種無血培養(yǎng)基。
以無血培養(yǎng)基制備A群鏈球菌制劑的方法如下 該方法包括以下步驟
(1) 、無血培養(yǎng)基的準(zhǔn)備對(duì)無血培養(yǎng)基在4500r/min的條件下離心30min、 抽濾，以保證培養(yǎng)基澄清無雜質(zhì)，然后滅菌待用；
(2) 、傳代在無菌室內(nèi)開啟A群鏈球菌弱毒株工作種子批，在斜面培養(yǎng) 基上在37。C的條件下，培養(yǎng)20小時(shí)傳三代，然后分別接種在無血培養(yǎng)基，在 37°C、 120r/min的條件下振蕩培養(yǎng)20小時(shí)制備種子液，在傳代前要進(jìn)行革蘭氏
染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌則廢棄；
(3) 、制備A群鏈球菌制劑；將制好的生產(chǎn)用種子液接種在無血培養(yǎng)基中， 在37°C、 140r/min的條件下振蕩培養(yǎng)20小時(shí)，在接種前要進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢， 如發(fā)現(xiàn)污染雜菌則廢棄；
(4) 、菌體滅活將青霉素和過氧化氫加入培養(yǎng)物內(nèi)滅活，經(jīng)過振蕩、45 。C水浴30min， 4500r/min離心30min;
(5) 、產(chǎn)品收集經(jīng)過菌體滅活后的培養(yǎng)物用生理鹽水懸浮，二次離心后 將沉淀物在-37'C凍干72小時(shí)得到白色菌體干粉制劑即A群鏈球菌制劑，稱重 后密封保存于無菌瓶中。其中的青霉素由華北制藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)制造；所 使用的A群鏈球菌為A群鏈球菌ATCC19615 ，由吉林省疾病防止控制中心提供； A群鏈球菌弱毒株工作種子批由吉林大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)研究所提供。
上述步驟中
滅菌所用的設(shè)備為YXQ-SG41-280高壓滅菌鍋，由上海醫(yī)用核子儀器廠生 產(chǎn)制造；
離心所用的設(shè)備為RC-3BPLUS低速大容量冷凍離心機(jī)，由美國Du Pont公 司生產(chǎn)制造。
振蕩所用的設(shè)備為HZQ-Q全溫振蕩器，由哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公 司生產(chǎn)制造；
水浴所用的設(shè)備為DK-89-I電子恒溫水浴鍋，由天津市斯泰特一起有限公 司生產(chǎn)制造；
凍干所用的設(shè)備為Lyolab3000冷凍干燥機(jī)，由丹麥生產(chǎn)制造； 鏡檢所用的設(shè)備為HK光電顯微鏡，由臺(tái)灣OLYMPUS公司生產(chǎn)制造。
無血培養(yǎng)基
無血培養(yǎng)基的優(yōu)化
重點(diǎn)考察培養(yǎng)基氮源、碳源和能源對(duì)菌體生物產(chǎn)量的影響，選擇胰蛋白胨、 葡萄糖和酵母粉含量為考察因素，以生物產(chǎn)量為試驗(yàn)指標(biāo)，設(shè)計(jì)均勻?qū)嶒?yàn)，實(shí) 驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行偏最小二乘回歸建模確定最佳配比。
經(jīng)過回歸分析可得出最佳培養(yǎng)基重量配比為胰蛋白胨1.2%、葡萄糖0.9%、 酵母粉0.4%、氯化鈉0.5%、磷酸二氫鉀0.5%、其余為水；pH值為7.4 7.6。其 中的胰蛋白胨及酵母粉由英國OXID公司生產(chǎn)制造。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1所 示。
表l優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
x2x3實(shí)驗(yàn)指標(biāo) y(g/1)
實(shí)驗(yàn)號(hào)l胰蛋白胨 (%)2葡萄糖 (%)3酵母粉 (o/o)11(0.5)2(0.4)3(0.25)0.1745
22(0.75)4(0.6)6(0.4)0.1825
33(1.0)6(0.8)2(0.2)0.1785
44(1.25)1(0.3)5(0.35)0.2730
5(1.5)3(0.5)1(0.15)0.2750
66(1.75)5(0.7)4(0.3)0.3120
77(2.0)7(0.9)7(0.45)0.3095
實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行偏最小二乘回歸建模分析，得到最優(yōu)指標(biāo)因素組合為: xl，2。/。;x2,0.9。/。;x3,0.4。/。;最優(yōu)組合目標(biāo)函數(shù)y=0.3435g/l。
得到如下二次多項(xiàng)式回歸模型
y^.4594081國0.083747x廣0.540402x2-0.458285x3+0.010952x!2+0.221875x22+0.0030 65x32 +0.097986乂^2+0.130168乂^3+0麓083乂詢；
同時(shí)得到Press值和誤差分析圖，從圖1可知，在考察氮源、碳源和能源三 個(gè)組分(3個(gè)潛變量)時(shí)，Press值最小且誤差最小，說明回歸模型的擬合程度 較好。
A群鏈球菌在無血培養(yǎng)基和含血培養(yǎng)基中的生長情況及形態(tài)特征
對(duì)不同培養(yǎng)基的種子液和發(fā)酵液中的菌體分別進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，通過 觀察，菌體細(xì)胞呈圓形或卵圓形，直徑0.5 2.0um，在液體培養(yǎng)基中，以成對(duì) 或鏈狀出現(xiàn)，不運(yùn)動(dòng)，不生芽孢，革蘭氏陽性，視野內(nèi)無雜菌。從圖2中的對(duì) 比可知，A群鏈球菌在無血培養(yǎng)基與含血培養(yǎng)基上的形態(tài)均符合A群鏈球菌的 形態(tài)特征，這說明A群鏈球菌在無血培養(yǎng)基上生長良好。
本發(fā)明的有益效果是利用無血培養(yǎng)基代替含血培養(yǎng)基培養(yǎng)制備A群鏈球
菌制劑，降低了制劑中潛在的異源性物質(zhì)，避免使用血液成分還能有效降低培
養(yǎng)基成本；利用數(shù)學(xué)建模對(duì)無血培養(yǎng)基優(yōu)化進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)
計(jì)分析，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，得到培養(yǎng)基最佳重量配比，保證了制劑生物產(chǎn)量不
減少和產(chǎn)量的穩(wěn)定性。


圖1為本發(fā)明的潛變量個(gè)數(shù)與Press值(a)及誤差(b)關(guān)系圖。
圖2為A群鏈球菌在無血培養(yǎng)基(a)及含無血培養(yǎng)基(b)內(nèi)的生長形態(tài)。
具體實(shí)施例方式
方法實(shí)施例包括以下步驟 (1)、無血培養(yǎng)基的準(zhǔn)備將無血培養(yǎng)基在4500r/min的條件下離心30min， 抽濾，以保證培養(yǎng)基澄清無雜質(zhì)，然后滅菌待用；
(2)、傳代在無菌室內(nèi)開啟A群鏈球菌弱毒株工作種子批，在斜面培養(yǎng)基 上在37。C的條件下，培養(yǎng)20小時(shí)傳三代，然后分別接種在無血培養(yǎng)基，在37 。C、 120r/min的條件下振蕩培養(yǎng)20小時(shí)制備種子液，在傳代前要進(jìn)行革蘭氏染 色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌則廢棄；
(3) 、制備A群鏈球菌制劑；將制好的生產(chǎn)用種子液接種在無血培養(yǎng)基中， 在37°C、 140r/min的條件下振蕩培養(yǎng)20小時(shí)，在接種前要進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢， 如發(fā)現(xiàn)污染雜菌則廢棄；
(4) 、菌體滅活將青霉素和過氧化氫加入培養(yǎng)物內(nèi)滅活，經(jīng)過振蕩、45 。C水浴30min， 4500r/min離心30min;
(5) 、產(chǎn)品收集經(jīng)過菌體滅活后的培養(yǎng)物用生理鹽水懸浮，二次離心后 將沉淀物在-37"C凍干72小時(shí)得到白色菌體干粉制劑即A群鏈球菌制劑，稱重 后密封保存于無菌瓶中。
無血培養(yǎng)基實(shí)施例l:
按胰蛋白胨1.0%、葡萄糖0.8%、酵母粉0.2%、氯化鈉0.5°/。、磷酸二氫鉀 0.5%、其余為水;pH值為7.4比例配制培養(yǎng)基，按回歸方程計(jì)算生物產(chǎn)量為0.2055 g/1。實(shí)際試驗(yàn)中得到生物產(chǎn)量為0.1997 g/1同等配比的含血培養(yǎng)基生物產(chǎn)量為 0.2010 g/1 。
無血培養(yǎng)基實(shí)施例2:
按胰蛋白胨0.8%、葡萄糖0.7%、酵母粉0.3%、氯化鈉0.5%、磷酸二氫鉀 0.5%、其余為水；pH值為7.5比例配制培養(yǎng)基，按回歸方程計(jì)算生物產(chǎn)量為 0.3240g/l。實(shí)際試驗(yàn)中得到生物產(chǎn)量為0.3302 g/1同等配比的含血培養(yǎng)基生物產(chǎn)量為0.3260 g/1 。
無血培養(yǎng)基實(shí)施例3:
按胰蛋白胨1.2%、葡萄糖0.9%、酵母粉0.4%、氯化鈉0.5%、磷酸二氫鉀 0.5%、其余為水；pH值為7.6比例配制培養(yǎng)基，按回歸方程計(jì)算生物產(chǎn)量為 0.2389g/l。實(shí)際試驗(yàn)中得到生物產(chǎn)量為0.2410 g/1同等配比的含血培養(yǎng)基生物產(chǎn) 量為0.2410g/1 。
權(quán)利要求
1、一種以無血培養(yǎng)基制備A群鏈球菌制劑的方法，該方法包括以下步驟無血培養(yǎng)基的準(zhǔn)備將無血培養(yǎng)基在4500r/min的條件下離心30min、抽濾，以保證培養(yǎng)基澄清無雜質(zhì)，然后滅菌待用；傳代在無菌室內(nèi)開啟A群鏈球菌弱毒株工作種子批，在斜面培養(yǎng)基上在37℃的條件下，培養(yǎng)20小時(shí)傳三代，然后分別接種在無血培養(yǎng)基，在37℃、120r/min的條件下振蕩培養(yǎng)20小時(shí)制備種子液，在傳代前要進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌則廢棄；制備A群鏈球菌制劑；將制好的生產(chǎn)用種子液接種在無血培養(yǎng)基中，在37℃、140r/min的條件下振蕩培養(yǎng)20小時(shí)，在接種前要進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌則廢棄；菌體滅活將青霉素和過氧化氫加入培養(yǎng)物內(nèi)滅活，經(jīng)過振蕩、45℃水浴30min，4500r/min離心30min；產(chǎn)品收集經(jīng)過菌體滅活后的培養(yǎng)物用生理鹽水懸浮，二次離心后將沉淀物在-37℃凍干72小時(shí)得到白色菌體干粉制劑即A群鏈球菌制劑，稱重后密封保存于無菌瓶中。
2、 一種用于制備權(quán)利要求1所述的A群鏈球菌制劑的無血培養(yǎng)基，其重 量配比為胰蛋白胨1.2%、葡萄糖0.9%、酵母粉0.4%、氯化鈉0.5%、磷酸二 氫鉀0.5%、其余為水；pH值為7.4 7.6。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以無血培養(yǎng)基制備A群鏈球菌制劑的方法及無血培養(yǎng)基，該方法是將A群鏈球菌弱毒株工作種子批經(jīng)過傳代，在無血培養(yǎng)基中制備種子液及培養(yǎng)，所得培養(yǎng)物經(jīng)過菌體滅活、凍干工序得到白色菌體干粉制劑即A群鏈球菌制劑的過程；所用無血培養(yǎng)基重量配比為胰蛋白胨1.2％、葡萄糖0.9％、酵母粉0.4％、氯化鈉0.5％、磷酸二氫鉀0.5％、其余為水，pH值為7.4～7.6；本發(fā)明利用無血培養(yǎng)基代替含血培養(yǎng)基培養(yǎng)制備A群鏈球菌制劑，降低了制劑中潛在的異源性物質(zhì)，避免使用血液成分還能有效降低培養(yǎng)基成本；該重量配比的培養(yǎng)基保證了制劑生物產(chǎn)量不減少和產(chǎn)量的穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)C12R1/46GK101096647SQ20071005572
公開日2008年1月2日 申請(qǐng)日期2007年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月6日
發(fā)明者盧日峰, 吳戰(zhàn)宇, 邱芳萍, 維 郎 申請(qǐng)人:長春工業(yè)大學(xué)