專利名稱：一種外源基因在陰道毛滴蟲體內(nèi)表達的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種外源基因在陰道毛滴蟲體內(nèi)表達的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
-陰道毛滴蟲是寄生于泌尿生殖道的鞭毛蟲，它不僅引起人的陰道炎，還可使靈 長類動物松鼠猴表現(xiàn)臨床癥狀，使其它動物如小鼠成為帶蟲者，該病分布廣、感染率 高，危害嚴(yán)重，但迄今尚無理想的防治辦法，究其原因就是缺乏適宜的外源基因在陰 道毛滴蟲體內(nèi)表達的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
.本發(fā)明提供了一種外源基因在陰道毛滴蟲體內(nèi)表達的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，是以陰道毛滴蟲病毒為轉(zhuǎn)染載體和以DNA為轉(zhuǎn)染載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。該轉(zhuǎn)染系統(tǒng)含有多克隆酶切位點，抗性標(biāo)志，為通用型轉(zhuǎn)染載體，使用方便， 可將多種外源基因轉(zhuǎn)入陰道毛滴蟲體內(nèi)，進行陰道毛滴蟲分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)等 研究。本發(fā)明利用含陰道毛滴蟲的基因的啟動子的DNA和陰道毛滴蟲病毒RNA作轉(zhuǎn)染 載體，在陰道毛滴蟲體內(nèi)進行外源基因的表達。 包括采用DNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和以陰道毛滴蟲病毒RNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。1、 以DNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)首先利用多克隆酶切位點引入外源基因，將其插入到陰道毛滴蟲啟動子與多聚 poly(A)信號序列之間，克隆入載體，構(gòu)建外源基因表達盒，電穿孔法導(dǎo)入陰道毛滴 蟲滋養(yǎng)體以表達外源基因。2、 以陰道毛滴蟲病毒RNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)首先，構(gòu)建含多克隆酶切位點的NE0抗性盒，在陰道毛滴蟲病毒全長cDNA (4649BP，序列表)的5'外翻譯后加入T7啟動子，后用RNA聚合酶進行體外轉(zhuǎn)錄， 并將轉(zhuǎn)錄體電穿孔陰道毛滴蟲體內(nèi)，進行外源基因表達。本發(fā)明的積極效果在于陰道毛滴蟲病毒基因組小、穩(wěn)定、易純化。陰道毛滴 蟲為真核生物，外源基因在陰道毛滴蟲體內(nèi)表達出的蛋白具有活性。此外，陰道毛滴 蟲在體外易培養(yǎng)。隨著陰道毛滴蟲的傳代培養(yǎng)，外源基因可無限制地在體外大量制備。 該轉(zhuǎn)染系統(tǒng)含有多克隆位點，為通用型轉(zhuǎn)染載體，多種外源基因可在陰道毛滴蟲體內(nèi) 表達，為研究陰道毛滴蟲分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)提供了轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。


圖l、重組質(zhì)粒pNEO/GFP的構(gòu)建策略；圖2-A、轉(zhuǎn)染用TVVcDNA-GTP基因的嵌合RNAs的構(gòu)建；圖2-B、重組質(zhì)粒pTVVL289/NEO/EGFP/TVVS構(gòu)建策略；圖3、陰道毛滴蟲病毒體外轉(zhuǎn)錄體轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡檢測結(jié)果(X400)。具體實施方法為了便于理解本發(fā)明，特例舉以下實施例。其作用被理解為是對本發(fā)明的闡釋而 非對本發(fā)明的任何形式的限制。實施例1以DNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)如圖1所示，首先克隆陰道毛滴蟲a-SCSB ( a-琥珀酰輔酶A合成酶啟動子)基 因并進行全序列分析；在應(yīng)用PCR技術(shù)擴增并克隆陰道毛滴蟲a -SCSB基因啟動子序 列5SCSB和多聚poly(A)信號SCSB3與GFP，引入多克隆酶切位點(MCS)，并利用MCS 分別將綠色熒光蛋白(EGFP)插入基因啟動子SCSB5與SCSB3之間，克隆入載體，構(gòu) 建GFP表達盒p a -SCSB5/ EGFP / a -SCSB3，電穿孔法導(dǎo)入陰道毛滴蟲滋養(yǎng)體，6h后 熒光顯微鏡檢測到了 GFP的表達，確定其轉(zhuǎn)錄活性；同樣方法構(gòu)建NEO抗性盒pa -SCSB5/NE0/ a -SCSB3并轉(zhuǎn)染陰道毛滴蟲，通過G418篩選獲得G418抗性蟲株；將GFP 表達盒與NEO抗性盒串聯(lián)，線性化后轉(zhuǎn)染陰道毛滴蟲，通過G418抗性篩選及核酸鑒 定，在陰道毛滴蟲體內(nèi)穩(wěn)定表達了綠色熒光蛋白，構(gòu)建陰道毛滴蟲穩(wěn)定DNA轉(zhuǎn)染載體， 建立了陰道毛滴蟲DNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法。實施例2以陰道毛滴蟲病毒RNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng) 如圖2所示，在PCR引物設(shè)計時直接加入T7啟動子序列，運用PCR反應(yīng)將T7啟動子引 入到陰道毛滴蟲病毒(Trichomonas vaginalis virus)全長cDNA的5'端前，運用PCR 方法擴增出TVV的5'端289bp (只包括5'端UTRs)及3'端174bp和EGFP編碼區(qū)720bp三個片段，與pMD18-T克隆載體的連接，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTVVL289、用EcoR I / Kpn I雙酶切，回收TVV5'端大小為289bp的目的片段；將重組質(zhì)粒pEGFP用Kpn 1/ Xba I 雙酶切，回收720bp大小的EGFP部分；將重組質(zhì)粒pTVVS用Xba I / Pst I雙酶切，回 收TVV3'端174bp的片段；載體pPoylI/sfinot用EcoR I / Pst I雙酶切。將所得的目 的片段與載體按5' L: EGFP: 3， S: pPoylI/sfinot的摩爾數(shù)比為3 :3:3: l的比例 混合連接。16。C連接16小時，得重組質(zhì)粒pTVVL289/EGFP/TVVS、將重組質(zhì)粒 pTWL289/EGFP/TVVS經(jīng)EcoR I 、 Pst I酶切線性化后，用凝膠回收試劑盒回收、定量。 取約1.5ug線性化質(zhì)粒作為模板，應(yīng)用T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System進行體外轉(zhuǎn)錄，將轉(zhuǎn)錄體腦A (50yg)，以電壓(400V/cm)、脈 沖時間(5ms)、電擊兩次，每次間隔100ms進行電擊反應(yīng)，轉(zhuǎn)染生長至對數(shù)期含病毒的 陰道毛滴蟲滋養(yǎng)體內(nèi)，電擊后將電轉(zhuǎn)杯放在冰浴中10min，后進行37'C培養(yǎng)，用熒光 顯微鏡觀察到綠色熒光蛋白在陰道毛滴蟲體內(nèi)得到瞬時表達。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計引物 運用PCR方法擴增出NE0編碼區(qū)795bp和多克隆酶切位點(Xba I 、 Nde I 、 Cla I 、 Hind III、 Sac I 、 Sac II 、 Sam I 、 Sal I 、 Nhe I )片段，與pMD18-T克隆載體的連接，將構(gòu) 建的重組質(zhì)粒PNEO+MCS、用Kpn/1/Xbal雙酶切，回收大小為849bp的NE0+MCS目的片 段；在T4DNA連接酶的作用下將NE0+MCS目的片段和陰道毛滴蟲病毒基因進行連接，再 利用MCS加入內(nèi)源性啟動子a -SCSB和報告基因EGFP，構(gòu)建重組質(zhì)粒pTVVL289/NE0/ a -SCSB+EGFP/TVVS，即陰道毛滴蟲通用型病毒載體，線性化體外轉(zhuǎn)錄后電轉(zhuǎn)入陰道毛 滴蟲，經(jīng)RT-PCR和熒光顯微鏡等方法鑒定其在陰道毛滴蟲體內(nèi)得到瞬時表達。再經(jīng) G418篩選建立陰道毛滴蟲G418抗性蟲株。陰道毛滴蟲病毒基因全長cDNA序列 1 GACACTCAACATTGCTACTTCATCATGACGGACTCATAACGCGGGCACGTTACAAGCGTA 61 GTGCCCTCGACGATTGCCATCCTCGTGTGAACTCCGGGCTCCGCTTGCACTGATGATACC 121 TCTTACAAAACTTGGATAGACTGCTAAGTCTTGAAGAGCCGTAATGTATCCTCTGCGCCT 181 GGGACCTAATGGTTTTTCTGCTGTAGGTACTTTATAGGGAAGGATAGGGATGTCAACATA 241 301 361 421481 AGGCGTCTCTTTCATCGGAAAAGACGGCACACCTTACAGCTCAGCTACGATCCCATCAGC 541 CGTAGGCCGTCTTACTCATGAAGTTATAGCATCAGCCGTCCAGCTCAACATCTCAACAAG 601 661 721 781 841 901 9611021 GACTAATGTTTCTGTCGAGAGCCTTGCTGCTCCAAACATGGTAGTTCCAAATCCAAACGA1141 TCTCAATGCTTTCCTTCAAAGCTTCATCGCTCCCACACACATCCACATCTTCATCACACC1261 CTTGCTCGCTATGTCGAAAACGTCACGCCCAATACCAGAGAGCGTCGAAAGCATGCTCTA 1321 TGCTTACGGTACACAAATGATTATCCAGCCACATTCACTTTACACAGAAGGCGGCTTAAT 1381 1441 15011561 CTGCGCCGGACCTATTGCACTTCACTGGCATGGTAACGACATCACCTCTGAAGGCATGGA 1621 CAGAATTGCAGATACCTATCTCGAAGGAAGATACTTCACCATTCCAATGGCAGCCAACGT1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361CGCCACCAACGTCGCCCAATACACAACAAGGGTTCGCGCCGATCCCGAATATCGGCATACCGAATCAGCGATCACATCATCCTGGGTATCAATCGATGCCCGCAAGCGCAATGGCCGTGC AAGGAAGTTCAGAACGGCATTCATCAATCGTTTCCACGATCCAGAATTCGCATACATGTT CGGTATCACAGGTAACGGTATCGAAAGAATGGAAGGCAAAGTTACTTCGAATATCGCCCAGCAAGGAATGACCATCTGCAACACAGCCTACACATCCACAGACATCGACATTGTCACAACCAGAATTCAGATACACAAATCCAAAAATACTAACACAAGAAACAGAATTACAACTTTTTCGTATCTCAGATTGGTTGAAACAACTCGGGTTAGCCTACTCCCCTATATTTCGCCTCTTCA TCGAGCTCCCTACATTATTAGGACGAGGAGCAATCCCAGGCGATAGCACACTAGATATAA AGCACAGACTCAGATATAATCCATCAATAACCGTCGATGTCCCAAAGGATCAATTACATG ATTTGATCTACAGACTCTTATCACGCAATCTCAATGGTATGAAAGCTGACAGTTTCGAACACGGCAAGGAACGGTTCATCTACAATTGTGACACGATCTCATATGTCTATTTTGATTTTG TCCTGAAGCTCTTCGAGTCAGGATGGCAAGATAGCGAAGCAATACTGTCGCCAGGAGATT3421 3481 3541 3601 3661 3721 3781 3841 3901 3961 4021 4081 4141 4201 4261 4321 4381 4441 4501 4561 4621ACACAAGTGAACAACTCCACGCCAAGATCTCCCGTTATAAGTACAAAGCTATGTTGGACT ACACAGATTTCAACTCGCAACATACAATCCAGAGTATGCGATTGATTTTTGAAACCATGAACATGCAAACGTCTGATGGCCACAAATGGGTTGCAACCCTCCCAAGCGGACACCGTGCTAACACTTTCATGTGCGCTGGTGACGACGTCATCCTTTTATCTCAGGAACCAATATCACTAG CCCCTATCCTTACATCACAGTTCAAGTTCAATCCTAGCAAACAAAGTACAGGTACAAGAGATAAATTAGGACAGCAAATTAAGAAAATGAGCCACAGGCATTGTAGCCAGGCGAAGATAACCAGCCAGTCAGCGTTGTCGCTGGTGTGGTGGCAAGCAATGCTTAAGGAAGCAATGCAGGGAGCCAGTTTGGTCTCACTATACCTTCAC
權(quán)利要求
1、一種外源基因在陰道毛滴蟲體內(nèi)表達的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，其特征在于是以陰道毛滴蟲病毒為轉(zhuǎn)染載體和以DNA為轉(zhuǎn)染載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，該轉(zhuǎn)染系統(tǒng)含有多克隆酶切位點，抗性標(biāo)志，為通用型轉(zhuǎn)染載體，可將多種外源基因轉(zhuǎn)入陰道毛滴蟲體內(nèi)。
2、 利用含陰道毛滴蟲的基因的啟動子的DNA作轉(zhuǎn)染載體，在陰 道毛滴蟲體內(nèi)進行外源基因的表達，其特征在于利用多克隆酶切位點引入外源基因，將其插入到陰道毛滴蟲啟動 子與多聚poly(A)信號序列之間，克隆入載體，構(gòu)建外源基因表達盒， 電穿孔法導(dǎo)入陰道毛滴蟲滋養(yǎng)體以表達外源基因。
3、 利用含陰道毛滴蟲病毒RNA作轉(zhuǎn)染載體，在陰道毛滴蟲體內(nèi) 進行外源基因的表達，其特征在于構(gòu)建含多克隆酶切位點的NEO抗 性盒，在陰道毛滴蟲病毒全長cDNA 4649BP的5'外翻譯后加入T7 啟動子，后用RNA聚合酶進行體外轉(zhuǎn)錄，并將轉(zhuǎn)錄體電穿孔陰道毛滴 蟲體內(nèi)，進行外源基因表達。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種外源基因在陰道毛滴蟲體內(nèi)表達的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，是以陰道毛滴蟲病毒為轉(zhuǎn)染載體和以DNA為轉(zhuǎn)染載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。包括采用DNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和以陰道毛滴蟲病毒RNA為載體的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。陰道毛滴蟲病毒基因組小、穩(wěn)定、易純化。陰道毛滴蟲為真核生物，外源基因在陰道毛滴蟲體內(nèi)表達出的蛋白具有活性。陰道毛滴蟲在體外易培養(yǎng)，隨著傳代培養(yǎng)，外源基因可無限制地在體外大量制備。該轉(zhuǎn)染系統(tǒng)含有多克隆位點，為通用型轉(zhuǎn)染載體，多種外源基因可在陰道毛滴蟲體內(nèi)表達，為研究陰道毛滴蟲分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)提供了轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。
文檔編號C12N15/79GK101235370SQ20071005637
公開日2008年8月6日 申請日期2007年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日
發(fā)明者宮鵬濤, 張昕鑫, 張西臣, 李建華, 舉 楊 申請人:吉林大學(xué)