專利名稱：融合阿維菌素及紅霉素合成基因簇的組合生物合成應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及組合生物合成，特別是一種融合阿維菌素及紅霉素合成基因簇的組合生 物合成應用。對不同種聚酮類化合物的合成基因簇上游或下游進行抗生素標記，通過細 胞融合技術，可以得到阿維菌素的結(jié)構(gòu)類似物。本發(fā)明提供了產(chǎn)生新的抗生素結(jié)構(gòu)類似 物的微生物的方法，可以用來尋找和發(fā)現(xiàn)可用于醫(yī)藥、工業(yè)或農(nóng)業(yè)的化合物、抗生素、 基因或蛋白。
背景技術：
組合生物合成(combinatorial biosynthesis)是一種有針對性的對某些基因進行操作從 而獲取大量"非天然"天然性化合物的方法，其研究是建立在各種化合物在生物體內(nèi)的 生物合成途徑的基礎之上，是微生物新藥研發(fā)的新技術之一。聚酮類化合物的組合生物 合成是該技術應用較為深入的領域。組合生物合成方法的可行性最早在Hopwood等人的 工作中得到論證。根據(jù)放線紫紅素(actinorhodin)的生物合成基因簇，Hopwood等人分 別克隆了部分和全部的這些基因到曼德爾霉素(medermycin)和二氫榴菌素(dihydrogranaticin)的產(chǎn)生菌中。在曼德爾霉素產(chǎn)生菌的轉(zhuǎn)化株5^epto/^cey sp.AM-7161 中，除產(chǎn)生曼德爾霉素外，還產(chǎn)生了大量的新化合物曼德爾紫紅素A (mederrhodinA)， 它在放線紫紅素的特征基礎上額外攜帶了一個羥基。在二氫榴菌素產(chǎn)生菌的轉(zhuǎn)化株 泣豐o平"v油c，"6er TU22中，也產(chǎn)生了一種新的化合物，二氫榴紅菌素(dihydrogranatirhodin)，它在異色滿醌體系的不同立構(gòu)中心上分別擁有放線紫紅素和二 氫榴菌素的構(gòu)象。這次嘗試使將天然產(chǎn)物的組合生物合成設想首次變成S^實。在此之后， 文獻中不斷有大量的涉及面較寬泛的此類例子出現(xiàn)，同時這種方法在實現(xiàn)天然產(chǎn)物的化 學多樣性方面也被公認為是一種有用的工具。組合生物合成特別適合實現(xiàn)化學方法難以 達到的分子構(gòu)建，尤其對于較復雜的結(jié)構(gòu)。特別是在聚酮化合物的研究上， 一方面可以 進行骨架結(jié)構(gòu)改變，例如，更改環(huán)體系、鏈長度或者不同構(gòu)建模塊的合并； 一方面可以 引進外圍的改變，如糖基化、氧化和還原、甲基化、異戊二烯化、鹵化以及?；?。近 幾年，組合生物合成技術更是不斷發(fā)展、應用范圍不斷擴大。兩種抗生素阿維菌素(avermectin)，因其獨特的作用機制以及高效、低毒、安全 性高和對環(huán)境影響小等優(yōu)點，使得這一大環(huán)內(nèi)酯類抗生素成為目前世界上使用最廣泛的 驅(qū)線蟲和除殺外寄生蟲抗生素，特別是該類抗生素在防治節(jié)肢動物類寄生蟲病方面具有 其它抗生素不可替代的功效。但是，阿維菌素對細菌和真菌無抗菌活性。而紅霉素(erythromycin)對革蘭氏陽性菌有較強的抗菌活性，對革蘭氏陰性菌也有抗菌作用。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種融合阿維菌素及紅霉素合成基因簇的組合生物合成應用。 對不同種聚酮類化合物的合成基因簇上游或下游進行抗生素標記，通過細胞融合技術， 可以得到抗生素阿維菌素的結(jié)構(gòu)類似物。本發(fā)明可以用來尋找和發(fā)現(xiàn)可用于醫(yī)藥、工業(yè) 或農(nóng)業(yè)的化合物、抗生素、基因或蛋白。本發(fā)明的進一步目的在于提供一種產(chǎn)生新的抗生素結(jié)構(gòu)類似物的方法，運用該法可 將不同種抗生素的合成基因簇分別在上游或下游進行抗生素標記，通過細胞融合技術， 篩選同時具備兩種抗性的融合細胞，獲得可以產(chǎn)生新的抗生素結(jié)構(gòu)類似物的微生物?？?用于醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)的化合物的創(chuàng)新與發(fā)展。本發(fā)明提供了一種新的抗生素阿維菌素結(jié)構(gòu)類似物的生物合成基因簇，編碼其生物 合成涉及的基因包括阿維菌素合成基因簇上游處的任一段基因，滿足此基因的失活不會影響菌株的生長 發(fā)育以及抗生素的生產(chǎn)主要功能；阿維菌素合成基因簇下游處的任一段基因；紅霉素合成基因簇下游處的任一段基因，滿足此基因的失活不會影響菌株的生長發(fā) 育以及抗生素的生產(chǎn)主要功能；卡那霉素抗性基因與氨芐霉素抗性基因。本發(fā)明提供了一種新的抗生素阿維菌素結(jié)構(gòu)類似物的生物合成基因簇，編碼其生物 合成涉及的基因具體如下-1) aver-l: 504bp和aver-2: 507bp，位于阿維菌素產(chǎn)生菌除蟲鏈霉菌OSVre; tofly;ces ove/7w力'fo ATCC 31271)中阿維菌素生物合成基因簇上游SAV934和aveR基因之間的相 鄰的兩段基因；aver-C: 651bp，位于阿維菌素產(chǎn)生菌除蟲鏈霉菌(及^ptowjcejavw w幼7/j ATCC 31271) 中阿維菌素生物合成基因簇下游aveG和yerDl基因之間的一段基因；2) KanS 1278bp，位于pEGFP載體中的卡那霉素抗性基因；插入于aver-l和aver-2 基因之間，作為抗生素標記；3) ery-ORF6: 501bp和ery-ORF7: 438bp，位于紅霉素產(chǎn)生菌糖多孢紅霉菌 (& cc/ arap7^/ ora e^^raea A-50)中紅霉素生物合成基因f夷下游ORF6和ORF7之間的相鄰的兩段基因；4) Amp、 861bp， 位于pMD18-T載體中的氨芐霉素抗性基因；插入于ery-ORF6 和ery-ORF7基因之間，作為抗生素標記；上述各段基因均通過聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)擴增獲得。構(gòu) 造所得的兩大重組基因分別為"aver-l+ Kanf +aver-2+阿維菌素合成基因簇+ aver-C"(記 作R-1)禾B "紅霉素合成基因簇+ery-ORF7+An^ + aver-C+ery-ORF6"(記作R-2)。兩大重組基因R-l和R-2的第一次組合交換發(fā)生在細胞融合過程中，阿維菌素合成 基因簇和紅霉素合成基因簇部分(隨機)交換、阿維菌素合成基因簇下游的aver-C和紅霉素合成基因簇下游插入的aver-C交換，即進行同源雙交換。第一次組合交換后所得重 組基因為"aver-l+ Katf +^"-2+部分阿維菌素合成基因簇+部分紅霉素合成基因簇 +ery-0RF7+ Ampr + aver-C (記作R-3 )。由于在阿維菌素合成基因簇和紅霉素合成基因簇中含有相似的功能域，重組基因 R-3有再次發(fā)生交換的可能性，具體分析如下阿維菌素合成基因簇中，所含功能域有?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域AT 13個，酰基載體蛋 白ACP13個，酮基合成酶結(jié)構(gòu)域KS 12個，酮基還原酶結(jié)構(gòu)域KR IO個，脫氫酶結(jié)構(gòu) 域DH6個，烯酰還原酶結(jié)構(gòu)域ERO個；紅霉素合成基因簇中，所含功能域有?；D(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域AT 7個，?；d體蛋白 ACP7個，酮基合成酶結(jié)構(gòu)域KS6個，酮基還原酶結(jié)構(gòu)域KR5個，脫氫酶結(jié)構(gòu)域DH1 個，烯酰還原酶結(jié)構(gòu)域ER1個。以每個功能域發(fā)生一次交換計算AT13X7 = 91; ACP 13X7=91; KS 12X6 = 72; KR10X5 = 50; DH6X1=6， ER0X1=0，總計91+91+72 + 50 + 6+0 = 310。從而會 有很多阿維菌素的結(jié)構(gòu)類似物產(chǎn)生。所述的新的抗生素阿維菌素生物合成基因簇的用途，其特征在于，兼具卡那、氨芐 兩種抗生素抗性標記，其所在的微生物可產(chǎn)生新的抗生素結(jié)構(gòu)類似物。本發(fā)明提供了所述的基因序列與質(zhì)粒、病毒或表達載體所構(gòu)建的重組載體。本發(fā)明提供了所述的基因序列與質(zhì)粒表達載體所構(gòu)建的重組載體pKC1139。本發(fā)明提供了基因工程化的宿主細胞是選自所述的基因序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的融合細 胞或是用所述的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的融合細胞。本發(fā)明提供了所述的新的抗生素阿維菌素生物合成基因簇的用途，其特征在于，兼 具卡那、氨芐兩種抗生素抗性標記，其所在的微生物可產(chǎn)生新的抗生素結(jié)構(gòu)類1以物。本發(fā)明制備方法主要是以合成大環(huán)內(nèi)酯類抗生素I型PKS中的典型代表阿維菌素 和紅霉素為例。首先，在阿維菌素的合成基因簇上游SAV934和aveR基因之間插入卡那 霉素抗性基因(Kanf: 1278bp);其次，在紅霉素的合成基因簇下游0RF7和0RF6基因 之間插入氨芐霉素抗性基因(Amp、 86bp)和阿維菌素合成基因簇下游aveG和yerD
之間一段約651bp的基因，即aver-C;第三，通過細胞融合技術(放線菌的原生質(zhì)體融 合操作詳見"具體實施方式
"中相關步驟)，使上述兩段重組基因進行同源雙交換，雙抗 生素抗性篩選，選擇兼具卡那、氨芐兩種抗性的融合細胞，獲得可以產(chǎn)生新的抗生素結(jié) 構(gòu)類似物的微生物。本發(fā)明與以往的組合生物合成操作相比有所不同，是將重點從抗生素合成基因簇主 體轉(zhuǎn)向其上游或下游基因，通過抗生素標記、細胞融合等操作手段，篩選兼具標記性質(zhì) 的組合成功的細胞，得到可以產(chǎn)生新的抗生素結(jié)構(gòu)類似物的微生物。由此可見，本發(fā)明 應用范圍更加廣泛，是對組合生物合成方法的一種創(chuàng)新，因而具有較強的創(chuàng)造性和新穎 性，同時具有較好的應用性。本發(fā)明所提供核苷酸序列或至少部分序列的克隆基因或DNA片段可以通過改變阿維菌素生物合成的一個或幾個步驟而得到新的阿維菌素衍生物。
包含本發(fā)明DNA片段或基因可以用來提高阿維菌素或其衍生物的產(chǎn)量。包含本發(fā) 明所提供核苷酸序列或至少部分序列的克隆DNA可用來從阿維菌素鏈霉菌基因組文 庫中定位更多的文庫質(zhì)粒。這些文庫質(zhì)粒至少包含有本發(fā)明中的部分序列，也包含有阿 維菌素鏈霉菌基因組中以前鄰近區(qū)域未克隆的DNA 。本發(fā)明所提供的核苷酸序列可以 被修飾或突變，途徑包括插入或置換，聚合酶鏈式反應，錯誤介導聚合酶鏈式反應，位 點特異性突變，不同序列的重新連接，或通過紫外線或化學試劑。
本發(fā)明所提供的核苷酸序列可以通過序列的不同部分或其它來源的同源序列進行直 接進化(DNAshuming)。通過缺失或失活來自于相同或不同聚酮合酶系統(tǒng)的一個或多個 聚酮合酶模塊、功能域或基因，或者增加一個或多個聚酮合酶模塊、功能域或基因而產(chǎn) 生新的聚酮化合物。本發(fā)明的序列或至少部分序列的克隆基因可以通過合適的表達系統(tǒng)在外源宿主中表 達以得到修飾的聚酮合酶或更高的生物活性或更高的產(chǎn)量。外源宿主包括鏈霉菌，大腸 桿菌，芽孢桿菌，酵母，植物和動物等。
本發(fā)明經(jīng)過細胞融合后，篩選兼具卡那、氨芐兩種抗生素抗性標記的融合細胞，所 得菌株的主體應該是阿維菌素的基因。此外，在兩種不同抗生素的合成基因簇中有可能發(fā)生兩次交換，其產(chǎn)生新的抗生素 的可能性非常復雜，理論上應該產(chǎn)生至少千余種的新抗生素。如果再發(fā)生多次的交換， 情況會更加的復雜。
類似地，當增加兩個類似的參與融合的細胞系，可能產(chǎn)生的抗生素的種類會更多， 有望獲得的新的抗生素結(jié)構(gòu)類似物在量上將達到二個飛躍。本發(fā)明的核苷酸序列或至少部分序列的片段或模塊或功能域或基因可以用來構(gòu)建聚 酮合酶文庫或聚酮合酶衍生物文庫或組合文庫。阿維菌素生物合成修飾基因的核苷酸序 列提供了通過缺失或改造這些修飾基因而得到阿維菌素衍生物的合成途徑。含有本發(fā)明 的核苷酸序列或至少部分序列的基因或基因簇可以在異源宿主中表達并通過DNA芯 片技術了解它們在宿主代謝鏈中的功能。本發(fā)明的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可 能在去除或替代某個或某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物學活性，或者提高 了產(chǎn)量或優(yōu)化蛋白動力學特征或其它致力于得到的性質(zhì)。通過合適的技術缺失，連接本 發(fā)明中的氨基酸序列可以得到新的蛋白或酶，進而產(chǎn)生新的聚酮或相關聯(lián)的產(chǎn)物。本發(fā) 明所提供的氨基酸序列可以用來分離需要的蛋白質(zhì)并可以用于抗體制備。本發(fā)明所提供 的氨基酸序列提供了預測聚酮合酶三維結(jié)構(gòu)的可能。本發(fā)明提供一種新的融合阿維菌素及紅霉素合成基因簇的組合生物合成應用。對不 同種聚酮類化合物的合成基因簇上游或下游進行抗生素標記，通過細胞融合技術，可以 得到抗生素阿維菌素的結(jié)構(gòu)類似物。本發(fā)明可以用來尋找和發(fā)現(xiàn)可用于醫(yī)藥、工業(yè)或農(nóng) 業(yè)的化合物、抗生素、基因或蛋白。


圖1是本發(fā)明產(chǎn)生新的抗生素結(jié)構(gòu)類似物的程序示意圖。圖2是本發(fā)明構(gòu)建的一種重組質(zhì)粒pMD18-T一aver/kanR的程序示意圖。圖3是本發(fā)明構(gòu)建的另一種重組質(zhì)粒pMD18-T—ery/aver的程序示意圖。
具體實施方式
實施例參照附1是本發(fā)明產(chǎn)生新的抗生素結(jié)構(gòu)類似物的程序示意圖。A、 B:分別為阿維菌素合成基因簇上游的兩段基因片段。此基因的失活不會影響菌 株的生長發(fā)育以及抗生素的產(chǎn)生等主要功能。用于在基因組中卡那抗性基因的裝入。C:為阿維菌素合成基因簇下游的一段基因。用于細胞融合過程中基因組間發(fā)生同 源交換。D、 E:分別為紅霉素合成基因簇下游的兩段基因片段。此基因的失活不會影響菌株 的生長發(fā)育以及抗生素的產(chǎn)生等主要功能。用于在基因組中氨芐抗性基因以及"C"基 因的裝入。Kan1":卡那抗性基因?？剐詷擞?，用于重組菌株的篩選。 Am力氨芐抗性基因?？剐詷擞洠糜谥亟M菌株的篩選。步驟1:除蟲鏈霉菌中阿維菌素合成基因簇上游SAV934和aveR基因之間插入卡那 抗性基因，得到改造后的重組基因組；步驟2:糖多孢紅霉菌紅霉素合成基因簇下游ORF7和ORF6基因之間插入氨芐抗 性基因和"C"基因，得到改造后的重組基因組；步驟3:分別含有上述兩步所得兩大重組基因組的兩個細胞進行融合，基因組之間 發(fā)生同M雙交換，得到一種新的重組基因組。篩選兼具卡那、氨芐兩種抗性的融合細胞， 獲得可以產(chǎn)生新的抗生素結(jié)構(gòu)類似物的微生物。圖2是本發(fā)明構(gòu)建的一種重組質(zhì)粒pMD18-T—aver/kanR的程序示意圖。 '步驟1:將兩端含有限制性酶切位點《戶I和及卵H I的Kanr基因連于pMD18-T載 體的相應位置；步驟2:將連于pMD18-T載體上的aver-l基因應用限制性內(nèi)切酶(￡coR I和《戸 I )進行雙酶切，與被同樣雙酶切的連有Kanr基因的pMD18-T載體發(fā)生粘性末端連接；步驟3:將連于pMD18-T載體上的aver-2基因應用限制性內(nèi)切酶(尸W I和歷"dIII) 進行雙酶切，與被同樣雙酶切的連有KaniP aver-l基因的pMD18-T載體發(fā)生粘性末端 連接。圖3是本發(fā)明構(gòu)建的另一種重組質(zhì)粒pMD18-T一ery/aver的程序示意圖。 步驟1:將兩端含有限制性酶切位點I和Prf I的aver-C基因連于pMD18-T載體的相應位置；步驟2:將連于pMD18-T載體上的ery-0RF6基因應用限制性內(nèi)切酶(五coR I和A^w I )進行雙酶切，與被同樣雙酶切的連有aver-C基因的pMD18-T載體發(fā)生粘性末端連 接；步驟3:將連于pMDI8-T載體上的ery-ORF7基因應用限制性內(nèi)切酶(尸W I和歷"d III)進行雙酶切，與被同樣雙酶切的連有aver-C和ery-ORF6基因的pMD18-T載體發(fā)生 粘性末端連接。一、有關阿維菌素合成基因簇的操作(參照附圖2)1 、從阿維菌素產(chǎn)生菌除蟲鏈霉菌0S^'e/7tow少cM aw,w〃,fe ATCC 31271)中PCR擴增 阿維菌素生物合成基因簇上游SAV934和aveR基因之間相鄰的兩段基因，記作aver-l: 504bp和aver-2: 507bp以及下游aveG和yerDl之間一段約651bp的基因，記作aver-C① 按照《分子克隆實驗指南》，從阿維菌素產(chǎn)生菌幼^to"^c" ATCC 31271中提取總DNA;② 根據(jù)已知的阿維菌生物合成基因簇序列(GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號AB032524)， 在阿維菌素生物合成基因簇上游附近基因內(nèi)設計兩對引物aver-l: 504bp引物-averl-l: 5'_~^3': CAG/AATTC GTG CGT AGC TCT GCC ATC TCEcoRl位點用下劃線表示引物-averl-2: 5'—~^3': GCGGTAC/C TGC CCC GGATGG CGG TCC AC 《p7I位點用下劃線表示 'aver-2: 507bp引物-aver2-l: 5'—~^3': GCCTGCA/G CGG ATG TCT CCAGGA AGG AA/^I位點用下劃線表示引物-aver2-2: 5'—~^3': CCA/AGCTT CTG CAG TAC GCC GAG GGG TT歷力din位點用下劃線表示aver-C: 651 bp引物-averC陽l: 5'_~^3': GCG/TCGAC AAG GCC ACG GTC GAC GAG GC&/1位點用下劃線表示引物-averC-2: 5'—~^3': GCCTGCA/G CCG GCG TTACAA AAG GTC CC/^I位點用下劃線表示③ 按照以下體系與條件進行PCR反應反應體系如下MgCl23^iL， 10Xbuffer (Mg2+free) 5pL， DMSO 5pL， dNTP 8pL， Taq酶0單， 上、下游引物各1(JL，模板DNA1.5^L，加去離子水至總體積為50^L 反應程序如下階段 步驟1 步驟2 步驟3 步驟4溫度與時間循環(huán)個數(shù)95 °C 5min94°C lmin; 60°C lmin; 72°C lmin 94°C 30sec; 62°C lmin; 72°C lmin3個 27個72 。C lOmin2、 從pEGFP載體中PCR擴增卡那霉素抗性基因(Kanf: 1278bp)① 根據(jù)已知的pEGFP-Nl載體序列(GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號U55762),對目的基因 設計兩對引物Kanr: 1278bp引物-KanM: 5'—~^3': CGGGTAC/C TTC AAA TAT GTA TCC GCT CA《/w I位點用下劃線表示引物-Kanr-2: 5'—~^3': CCG/GATCC TTAGAA CCC CAG AGT CCC GC 萬awHl位點用下劃線表示② 按照以下體系與條件進行PCR反應 反應體系如下.-MgCl23|iL， 10Xbuffer (Mg2+free) 5pL， DMSO 5pL， dNTP 8|i， Taq酶0.5^L， 上、下游引物各1^L，模板DNA1.5^L，加去離子水至總體積為50pL 反應程序如下階段 溫度與時間 循環(huán)個數(shù)步驟1 95 °C 5min步驟2 94°C lmin; 51°C lmin; 72°C lmin 3個步驟3 94°C 30sec; 53°C lmin; 72°C lmin 27個步驟4 72°C lOmin3、 PCR產(chǎn)物的測序驗證使用由寶生物工程(大連)有限公司購置的瓊脂糖凝膠DNA片段回收試劑盒將上 述PCR擴增產(chǎn)物回收純化后送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行核苷酸序列 測定，與PCR產(chǎn)物進行比較，驗證一致。4、 目的基因的連接與轉(zhuǎn)化① 分別將目的基因(Kan aver-1和aver-2)連于pMD18-T載體上； 將目的基因aver-C也連于pMD18-T載體上，以供后續(xù)實驗使用；② 將連于pMD18-T載體上的aver-l基因應用限制性內(nèi)切酶(￡coR I禾B I/w I )進 行雙酶切，與被同樣雙酶切的連有Kanf基因的pMD18-T載體發(fā)生粘性末端連接；③ 將連于pMD18-T載體上的aver-2基因應用限制性內(nèi)切酶(尸W I和H/wdlll)進行雙酶切，與被同樣雙酶切的連有Kalian aver-l基因的pMD18-T載體發(fā)生粘性末端連 接；④ 將連于pMD18-T載體上的Kan'以及aver-l/2基因應用限制性內(nèi)切酶(五coR I和 H/"din)進行雙酶切，將含有Kan1以及aver-l/2的這段基因連于與被同樣雙酶切的 pKC1139質(zhì)粒上；⑤ 將含有目的基因的pKC1139重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ET12567中進行表達， 得到陽性克隆子；⑥ 挑取單菌落(陽性克隆子)搖瓶培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，之后將所提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至除蟲鏈 霉菌中進行表達，得到陽性克隆子，記作Y-1。上述雙酶切反應具有相似的反應體系以及反應程序，具體如下 反應體系質(zhì)粒DNA16^L，兩種限制性內(nèi)切酶各l&，反應緩沖液2pL 反應程序37'C恒溫反應2h之后進行瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，使用由寶生物工程(大連)有限公司購置的瓊 脂糖凝膠DNA片段回收試劑盒將所需片段產(chǎn)物回收純化。上述連接反應具有相似的反應體系以及反應程序，具體如下反應體系外源DNA片段1(^iL，質(zhì)粒載體DNA2pL， T4 DNA連接酶1^L， 10 X反應緩沖液2.5jjL，加去離子水至總體積為25^L 反應程序16C過夜反應之后加入2.5mL (1A0量)的3MCH3COONa (pH5.2)，再加入62.5^l (2.5倍量) 的冷無水乙醇，-2(TC放置30 60分鐘，離心回收沉淀，用70%的冷乙醇清洗沉淀，真 空千燥，25 50^LTE Buffer溶解。上述轉(zhuǎn)化反應如下取TE Buffer溶解的溶液10 20pL轉(zhuǎn)化至100pL的感受態(tài)細胞 中，涂平板培養(yǎng)，卡那抗生素篩選得到陽性克隆子，挑取單菌落(陽性克隆子)搖瓶培 養(yǎng)，提取質(zhì)粒后，將所提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至除蟲鏈霉菌中進行表達，得到陽性克隆子Y-1。 所述反應使用試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司。二、有關紅霉素合成基因簇的操作(參照附圖3)1、從紅霉素產(chǎn)生菌&cc/2arapz7;^ora e^^raea A-50中PCR擴增紅霉素生物合成基 ,簇下游ORF7和ORF6之間相鄰的兩段基因，記作ery-ORF6:501bp和ery-ORF7:438bp① 按照《分子克隆實驗指南》，從紅霉素產(chǎn)生菌&cc/ aro/ 7;^ora eo^raea A-50 中提取總DNA;② 根據(jù)已知的紅霉素生物合成基因簇序列(GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號U82823)，在紅 霉素生物合成基因簇上游附近基因內(nèi)設計兩對引物ery-ORF6: 501bp引物ery隱l隱l: 5'—~^3': CA2/M11C CCC CGC CAAGCAAGC CGAGTEcoRl位點用下劃線表示引物ery-l-2: 5'—~^3': GCGGTAC/C CGG AGG GCG AGT TGAGGT TC A>w I位點用下戈!j線表示 ery-0RF7: 438bp引物ery-2-l: 5'—~^3， GCCTGCA/GGTG AGT TGGAAT CCC CCG CC/^I位點用下劃線表示引物ery-2陽2: 5'—~^3': CCA/AGCTT TTAGTC GCG CGC CGG ACG GG^/wdin位點用下劃線表示③按照以下體系與條件進行PCR反應反應體系如下MgCl23nL， 10Xbuffer (Mg2+free) 5pL， DMSO 5^L， dNTP 8^， Taq酶0.5pL， 上、下游引物各1^L，模板DNA1.5pL，加去離子水至總體積為50pL 反應程序如下階段 溫度與時間 循環(huán)個數(shù)步驟1 95 °C 5min步驟2 94°C lmin; 60°C lmin; 72°C lmin 3個步驟3 94°C 30sec; 62°C lmin; 72°C lmin 27個步驟4 72°C lOmin2、從pUC18載體中PCR擴增氨芐霉素抗性基因(Amp、 861bp)① 根據(jù)已知的pUC18載體序列(GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號L08752)，對目的基因設 計兩對引物Ampr: 861bp引物-ampl陽l: 5'—~^3': GGGGTAC/C ATG AGT ATT CAA CAG TTC CG《p"I位點用下劃線表示引物-ampl-2: 5'—~>3': GGG/GATCC TTG CCA ATG CTT AAC CAG TG 萬"mH I位點用下劃線表示② 按照以下體系與條件進行PCR反應 對于Ampr序列的擴增反應體系如下MgCl23piL， 10Xbuffer (Mg2+free) 5pL， DMSO 5^L， dNTP 8&， Taq酶0.5&， 上、下游引物各lnL，模板DNA1.5^L，加去離子水至總體積為50jiL 反應程序如下階段 溫度與時間 循環(huán)個數(shù)步驟1 95 °C 5min步驟2 94°C lmin; 51°C lmin; 72°C lmin 3個步驟3 94°C 30sec; 53°C lmin; 72°C lmin 27個步驟4 72°C 10min3、 PCR產(chǎn)物的測序驗證'使用由寶生物工程(大連)有限公司購置的瓊脂糖凝膠DNA片段回收試劑盒將上 述PCR擴增產(chǎn)物回收純化后送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行核苷酸序列 測定，與PCR產(chǎn)物進行比較，驗證一致。(圖？)4、 目的基因的連接與轉(zhuǎn)化① 分別將目的基因(ery-ORF6和ery-ORF7)連于pMD18-T載體上； Ampf連于pKC 113 9質(zhì)粒上；aver-C己連于pMD18-T載體上，如前文所述；② 將連于pMD18-T載體上的aver-C基因應用限制性內(nèi)切酶"a/I和戶rf I )進行 雙酶切，與被同樣雙酶切的pMD18-T載體發(fā)生粘性末端連接；③ 將連于pMD18-T載體上的ery-ORF6基因應用限制性內(nèi)切酶(￡coR I和r戸I ) 進行雙酶切，與被同樣雙酶切的連有aver-C基因的pMD18-T載體發(fā)生粘性末端連接；④ 將連于pMD18-T載體上的ery-ORF7基因應用限制性內(nèi)切酶(尸W I和ffi"dIII) 進行雙酶切，與被同樣雙酶切的連有aver-C和ery-ORF6基因的pMD18-T載體發(fā)生粘性 末端連接；⑤ 將連于pMD18-T載體上的aver-C和ery-ORF6/7基因應用限制性內(nèi)切酶(￡coR I和歷"dIII)進行雙酶切，將含有aver-C和ery-ORF6/7的這段基因連于與被同樣雙酶 切的pKC1139質(zhì)粒上；⑥ 將連于pKC1139質(zhì)粒上的Ampr基因應用限制性內(nèi)切酶(X戶I和B，H I )進 行雙酶切，與被同樣雙酶切的連有aver-C以及ery-ORF6/7基因的pKC1139質(zhì)粒發(fā)生粘 性末端連接；⑦ 將含有目的基因(Ampr、 aver-C以及ery-ORF6/7)的pKC1139重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化 至大腸桿菌ET12567中進行表達，得到陽性克隆子；⑧ 挑取單菌落(陽性克隆子)搖瓶培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，之后將所提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至糖多孢 紅霉菌中進行表達，得到陽性克隆子，記作Y-2。上述雙酶切反應具有相似的反應體系以及反應程序，具體如下 反應體系質(zhì)粒DNA16nL，兩種限制性內(nèi)切酶各ltxL，反應緩沖液2& 反應程序37"C恒溫反應2h之后進行瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，使用由寶生物工程(大連)有限公司購置的瓊 脂糖凝膠DNA片段回收試劑盒將所需片段產(chǎn)物回收純化。上述連接反應具有相似的反應體系以及反應程序，具體如下反應體系外源DNA片段10pL，質(zhì)粒載體DNA2pL， T4DNA連接酶lnL, 10 X反應緩沖液2.5nL,加去離子水至總體積為25nL反應程序16E過夜反應之后加入2.5nL (1A0量)的3MCH3COONa (pH5.2)，再加入62.5^L (2.5倍量) 的冷無水乙醇，-20<€放置30 60分鐘，離心回收沉淀，用70%的冷乙醇清洗沉淀，真 空干燥，25 50nL TE Buffer溶解。上述轉(zhuǎn)化反應如下取TE Buffer溶解的溶液10 20^L轉(zhuǎn)化至100pL的感受態(tài)細胞 中，涂平板培養(yǎng)，氨芐抗生素篩選得到陽性克隆子，挑取單菌落(陽性克隆子)搖瓶培 養(yǎng)，提取質(zhì)粒后，將所提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至糖多孢紅霉菌中進行表達，得到陽性克隆子Y-2。所述反應使用試劑均購自寶生物工程(大連)有限公司。三、 Y-l、 Y-2細胞的融合操作(放線菌的原生質(zhì)體融合)將上述兩種鏈霉菌突變株的新鮮斜面孢子接入培養(yǎng)基中，28'C振蕩培養(yǎng)48h，再轉(zhuǎn) 接到同一培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)24h，離心收集菌體。先用0.3mol/L蔗糖溶液洗滌2次， 再用培養(yǎng)基洗滌l次，菌體重懸于培養(yǎng)基中，每亳升菌體懸浮液加2 4mg溶菌酶，混 合均勻，置于32'C保溫1.5h左右，取樣鏡檢。至菌絲大部分裂解即停止溶菌，用滴管用 力吹吸幾次，促使原生質(zhì)體與殘存的細胞壁分離，并使串球狀的原生質(zhì)體分散。然后用 2000r/min離心10min，傾去上清液，以除去多余的溶菌酶。將沉下的原生質(zhì)體懸浮于5mL 培養(yǎng)基中，用低速離心法(500r/min，離心5min)使殘留的菌絲片斷沉于管底，將上部 懸液移至另一消毒的離心管，反復幾次，即可得到純凈的原生質(zhì)體。分別吸取0.5mL兩親株的原生質(zhì)體于同一離心管內(nèi)混合，加入5mL聚乙二醇(PEG 1000)溶液(42gPEG溶于100mL培養(yǎng)基中，pH=7.2)，小心混勻，置于32'C水浴保溫 5min。然后以2000r/niin離心10min，傾去上清液，再用培養(yǎng)基洗滌混合的原生質(zhì)體1 次，以除去殘存的PEG;用培養(yǎng)基作適當?shù)南♂?，每只平板?.1mL重組子(記作Y-3) 可以通過雙抗生素篩選直接檢出。四、 含重組子(Y-3)的除蟲鏈霉菌突變株的生長繁殖及新的抗生素結(jié)構(gòu)類t(物的產(chǎn)生 搖瓶培養(yǎng)含重組子(Y-3)的除蟲鏈霉菌突變株。28°C， 220r/min培養(yǎng)。在下列時間 點12小時，16小時，20小時，24小時，36小時，48小時，60小時，72小時，84小 時收集菌體，4000rpm離心IO分鐘。蔣菌體放在已稱重的恒重濾紙上，置于8(TC，烘 干至恒重。稱量菌體質(zhì)量?？捎镁w千重量對生長時間作圖，即為菌體的生長曲線。每 一時間點均做三次對照。同時，可運用液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀器等設備對發(fā)酵液產(chǎn)物進行相關 檢測。序列表SEQUENCE LISTING<110>天津大學<120>融合阿維菌素及紅霉素合成基因簇的組合生物合成應用 <130> 20060310 <160> 23< 170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 753 <212〉 DNA<213> Streptomyces avermitilis (除蟲f連霉菌) <400> 1atgaccagtg ttcagacgag cgacaactgg ctccggcgtt tccatccggc cgcggaggct 60ccgacgcgac tggtctgctt tccgcacgcg ggcggctcgg ccgcctactt ccacggtgtt 120tcccgtgcgc tctcgccggc cgtcgacgtc ttggcggtgc agtatccggg ccgtcaggac 180cggcggcacg agccgctcat cgacagcatc gacggcctgg ccgcccgggt acgggaggag 240ttggcgccgt ggacggaccg gccgttggcc ctgttcgggc acagtatggg cgccatggtg 300gcgttcgagg tggcgctgcg gctgacggcc gacggcgccg cgccgagcgt gctgttcgcc 360tcgggcaggc gggcgccgtc tcggtaccgc gaggaatccg tacacctcca tgacgatgcg 420ggcatcatgg cggagctgag ccgtctggac ggcaccgata cgcaggtact gaccgatccg 480.gagctgcggg agatggttct tccggcgttg cgcagcgact accgggcggt cgagacgtac 540cgctaccaac cggggccgcc gctgccctgc cccgtggtcg ccctggtggg cgacagcgat 600ccca鄉(xiāng)cca cggtcgscgs ggcccgcgcc tggggcgatc acacggccgg accgttcgaa 660ctctcggtct ttccgggtgg ccacttctat ctcaatgcgc acgcggaagc cgtcacggaa 720ttggtgcgga cgcgactggc gaccatcagg tga 753<210> 2<211> 351<212> DNA<213> Streptomyces avermitilis (除蟲鏈霉菌)<400〉 2tcaaggtgac gtaggtgttc accatggcgg agttcagggt cgtgctccag ccgaagtcac 60ccggacccgg cgaggtctct tgctgcgcgc cgcaggccac agcggcagcc ctctcgggtc 120cggcgcggca ccgcactggc ggcgctgtgt gcgctcaccc tcgccgcctg cggcaccgaa 180cgagcgggcg tcagggggcc gaaggccggc cccgcgctcg agacggtgga cacattgcgg 240ctggccttcc tggactcgct gaccaacacg tcccgcgtct tcgcaggtcc ttgacggtct 300 cttgacgaat ccggcggaca tggagggcgg ctgccgggta aggcgcgggg c 351<210> 3<211> 2850<212> DNA<213> Streptomyces avermitilis (除蟲f連霉菌)<400> 3atgcagggag tttcctgtct gcacccccct cggaaaccag aagaactcac gctcgtcgac 60cgggaaacac agttccgcgc gctgcggctg gcccttaccg aatgcgcggc cggcacggtg 120aaactgctcg tcgccgaggg cggaatgggc t跑gaaaga gtacgttcct gggcgaggca 180ctgcacaccg ccgccgcctc cggcttcgcc gtcctgcgtg ccgccgggct tcccgcggac 240caccggcaac ccctcggcgt actgcagcaa ctgctgaacg accccgcccc cgaggacacc 300gcccgcaccg ccgtccgccc catgccggtg caacacgtcc gcggcgccct cgaacgcctc 360gccgccggcg ccccgctggc gatcggcatc gacgacgtac aggacgcgga cccggagtcg 420ctgcactgtc tgatgcgcct cacccgccac tcccccacct cgcggatcct gctgctgtgc 480accgccctgg cgtgcagtcc ggccgccgac ccggtactcg犯gccgagct gatgcgtcag 540accgccttcg aacgcatcac gctggactgc ctgtccctgg acggagtgac cgggctggtc 600tcggaccgct gcgcgcggcc cacggcgccc ccgccggcgg actactgcct gaccgtcacc 660gggggcaacc cgctgctgct g鄉(xiāng)gccctg ctcgaagagc acagcgaggc cgacgccccc 720tcggcacccc gcccggcgga gccctccgcg ctgcactccc cgccgcaggc cgccccgccg 780 cgcccggtcg tcggcggccg cttctaccag tccgtactgg cctgcctgtc ccgcacggag 840acggcgatca ggcagacggc cggcgccctc gccgtcctcg gcgggcgtgc gcgcgccgac 900ctgctccccc aactgctcgg cgcgagtccc gcgtcggtca cccgggggct gcgtgcgctg 960gaggcgacgg ggctgaccac ctccggccgt ttccggcacc cggtggccga ggccgccgcg 1020ctcgacgcac tggacccgag ccgccgtgcc cacctgcacc gccgagcggc ggcgctgcag 1080caccacgacg gcgcggcgcc gcgggacgtc gcccgccacc ttctcgcggc ccgccatgcg 1140gcgggcccct gggcggtgtc cgtgctgcgt gacgccgccg agcagtcgct ggcgcaggac 1200gacgtggcgt cggcggtctc ctgcctggaa ctcgcctacg gggcctgtgt ccgggaacgg 1260gaacgtccgg agatcaggat caggctcgcc gccgctttcg ggcgcaccaa catcgcggtg 1320gcggaagagc acctcgccga cctggtcgcc accttgcggg aaggagaatt gaccggccat 1380cagacggctt tactcgtccc tctgctcgtc aaccacggcc gcctcggcga agcgcgggag 1440gcgatggacc ggctcaacgc cgccgacgac gcgcgcggcc tgtgcgcgga cggcggcttc 1500ccgatggccg ctccgtggcc gtcgaccgca cacctcgccg cacgccgcga tcccgccgcg 1560cgccgcgatc ccggcacccg ccgcgatccc gccgacaagc cgttcctgcc ccggcagtcc 1620ggtgccccgc agccccggcc ggaggacggc cgtggccagc agccgacagc ggccttgtgg 1680gccctgcccg ga犯cggcac cagcgaggcg gccgcacacg ccgcggMca ggtactgcgg H40tcctccccgc tcaccgacag caccctcgtg ctcctggtga acgccgtgcg gatcctcgcc 1800cgcacgggcc ggtacgacac cgcggacatc tggtgccacc gcctgctcgg cgaggccacc 1860cgtcgccgtt gtcccggctg gcaggcgcac ctcctggcgg tgc^ggccga actctcgctg 1920tgccgtggcc tgctcgccga cgccaaggag tgcgcccagc gcgcactgac acacgtaccg 1980gggcacagcc gcagcgtctt cgcgggcggt ccgctggcct gccaggtcct cgcctgcacc 2040gcgatgggac gctacgacga agccacgcaa ctgctcagcc atccggttcc cgaggcgctg 2100ttccacagtg tgtacggcct ggggtacctg cgggcccggg gccatttcca cctggccatg 2160aaccgcctgc ccgccgccgt ccgcgacttc ctcaccgccg gccgggtggc gcgggagtgg 2220ggactggacc atccggtgct gctgccctgg cgtacggacg ccgcggaggc gttcctccgg 2280ctcggggaaa cgaagagggc cgaccaactc ctcaccgaac agctcgtctc cccgcacagc 2340ggcaacccgt acgtccgcgg caccgcgctg cgcctgcggg cccagaccgc ggcgccggcg 2400gaacggctcc ggctgctgag cgaggcggtc agtgacctcc agagctccgg cgaccgcctg 2460gcgctggccc gcgcactggc cgatctcggc gccgcgtatc acagccggaa cgagcccgta 2520cgggcgagcg ccacggtccg ccgcgcctgg cagctggcca aggagtgcgg agcccaggcc 2580ctgtgcgaca gcatcctgcc cagtcgcggc accaaggacc gggggcccga cggaagggcg 2640gccgcgaccg aggccctgct gagcgagtcc gagatgcgag tcgcgacact ggcggcgggc 2700ggcaacacca accgtgagat cgccggccgg ctctgcgtca ccgtcagcac ggtcgaacag 2760catctgacgc gggtctaccg caaactgaac atcacccgcc gcagggagct gccgacccgt 2820ctgcgacacc tcgcggacca ggccaactga 2850<210〉 4<2I1〉 1278<212〉 DNA<213〉 Kanamycin (卡那霉素)<400〉 4ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa 60aaggaagagt cctgaggcgg aaagaaccag ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga 120aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca 180accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc 240aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc 300agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag 360gccgcctcgg cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc 420ttttgcaaag atcgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg 480attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca 540acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt 600tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaagacg aggcagcgcg 660gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga 720agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca 780ccttgctcct gccgagaaag taiccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct 840tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac 900tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc 960gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gagcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt 1020gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catg跑gaa aatggccgct tttctggatt 1080catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacategcgt tggctacccg 1140tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat 1200cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgagc 1260gggactctgg ggttcgaa 1278<2I0> 5<211〉 1194<212〉 DNA<213〉 Saccharopolyspora erythraea (糖多孢紅霉菌)<400> 5atgctgttgc actgcgcgca cgcgaggtac gtatggaacc tcgccgtgga gcagcattcg 60cactggcaga agggccgcag gtccgctccc gggtttgccg agcaatgcaa gcagctcact 120gaagcccgcg ctgccagcga gtggttgcgc gctgggaacg tggatgtgca gcagcaagcg 180ctc貼ggact tcgcctecgc caagcaagct cggttcaccc ctggtttcgg tgagccg過ct 240tggcga犯ga agcac汪agca cga鄉(xiāng)cttc cgggtgatcg gaaccgaccg ggtaccagcc 300tgccgagacg acggaacacc gctgctcaac ggcaagggca agcaggtgat gtcccgctcg 360gtggtggtgc ggaaactcaa caaaaactgg gcacaagtca cagtcccagg ctgcggatgg 420gtacggttcc ggctctcccg ccgccaaccg ccggacgcga aaacgttccg ggtgacctgc 480cacaacggtc agtggcacgt tgcgttcgcc gtgatccccg agccgatcga ggcacctggc 540aacggtgaga ccgtgggtat cgaccggggc gtgacgatca ctgcgcacct ctccgacggt 600cgagtgctga actgcccgca gctcaccgcc aaggaacgcg ctcgggttcg taaacaccag 660cgccgtgccg cccgcgcagc caag咖agc cccgccaagc 3agccgagt3 cgccaaggtc 了20gcccagctca gagcgcggga agcgaaccgg cgcaaagact gggcggagaa gaccagcacc 780atgctggcca gcgaattcga tgtcatccgg ttcgaaaaac tcaacatccg caacatgacc 840cgcaccgcgc gcggaaccgt ggctgagccc ggccgcaacg tccgcgtcaa ggccggtctg 900aaccgcagca tccttgcgca gggctggggc atgctgcgat cccgcgccga acac咖gca 960ccaggccggg tcgaagacgt cccggcgccc tacaccagtc tgcgttgcag cgactgcgga 1020tggatcgaga agaactcacg caagagccaa gctgagttcg tctgcgtgtc ctgcggtttc 1080acctgcaacg ctgacctgaa cgcctcgatc aacgtcgcgg caggacatgc cggagggaca 1140 acaacgaccc ctggtcgttc acgtgtccgt gaacctcaac tcgccctccg gtga 1194<210〉 6 <211〉 438 <212〉 DNA<213〉 Saccharopolyspora erythraea (糖多？包紅霉菌) <400〉 6gtgagttgga atcccccgcc tccaggcgag ggaggatgtc aaatccagaa gacaccggtg 60gtcttcgacg gggagctgac gctgctgccc atggggcagt acctgcaccg cgccctcggc 120ggcgactacg tcgccctcgc cgccacgcac accggcacca gcgcccccga gatagagctc 180gacgacagca gcgacagcgg cttcgccgtt cgggaggtgg atctgcccgc accggaggac 240ggaagcatcg aggccgcggc cgtcgcggcg cgcatcggaa cgggcctcgt cgacctgcgc 300gcgcaagctc ccggcctgga ccggatccgc tcccagagca cgtggatgcg gacgccgctg 360cgcgacgcgt tcgacgccgt gctcactgtt cccaccgcca ccgcggaagt ctcgacaccc 420cgtccggcgc gcgactaa 43 8<210> 7 <211> 774 <212〉 DNA '<213〉 Streptomyces avermitilis (除蟲鏈霉菌) <400〉 7atgaccagca actegccccg agcggttctc gccgccgagt ggatcaaggt gtggaccgta 60cgctcgacca gcttcaccct gctgctggcc ttcgtgctca gcaccggcct cggcaccgtt 120gtcgcgttca gctggcgtgg ccacatcgag cgcgtcgtca acttcagtcc gctcttcgcc 180ggcctgtacg gcgtgaccct cgggcagctc gccctcgttg tgttcggcgt cctgctcgtc 240ggctccgagt actcttccgg atcgatccgg acgtcactgt ccgcggtgcc ccggcgtggg 300ctgctctacg gcggcaaggt actggccggc acactggccg ccctcgccgg ctcgacggtc 360accgtgatcg tcacgttcgc gggggcgcag gcggccctcg gcccgtacgg catcacgctc 420actgcgcacg gggtcccggc tgcggtggtc ggcgccattg tctacctgac gctgatctgc 480accttgtcca tggggatcgc ggccatcgtg cgcagctcgg ccatctcgct cggcgtcctt 540ctcccgctgc tgttcctcgg ctcccaggga ctcggcaacg tccccgccct gaagcccgtc 600ctgcagtacc tgcccgacca ggccggcctg gaactgatgc gtattgccgg acctcccggc 660gacggacgct tcggccccga ctacgggccc agcacggctc tcgtcatcct gctggcctgg 720actgccgccg ccctgaccgg cggctacctg gtcctgcgcc gacgggacgc ctga 774<210〉 8 〈211〉 477 <212〉 DNA<213> Streptomyces avermitilis (除蟲鏈霉菌) <400〉 8cgcctggtcc tccgaactcc ccataggcca ggccgccttc gcgccgccgt ccctctggac 60 ccttgctcgc gggtgcggcg atggccttct cctccggctc gggcggtcaa tccgcccgag 120 ccgtttccgc ggtcaccgca ccgccataca taccggtcac ccggtattcc attcggtgtt 180 gcagcacgcg acccactgcg catcccactc gtgaattgtg gaccgccatc鄉(xiāng)ggcacgg 240 atgtctccag gaaggaactc cttcaccctc gcgaacacca cctcagaatc ccacgatcat 300 cagttaatca tcaaagtcag cgaccttgac actaccccgc ccaccagggc aaattcataa 360 cactgaccat cacctctgat gctgatcaac ccagcccgca cggccgcgac cgcttttgct 420 caagcaatcg aaatccccga gacacgcttt cttggaaaaa ggagaaataa gaacatc 477<210> 9<211〉 1584<212〉 DNA<213> Streptomyces avermitilis (除蟲鏈霉菌)<400〉 9gtgacacgta ttggattggt cgtcctcgcc ctggccgcgg ccctcgcggc gggcgccgcc 60gcggggtcga tatcgccgtg gtggtggttc gccgccgtcc cactcaccct gct鵬cctg 120ctgggcacgt gggacctttt.gcaacgccgg cattcggtgc tgcgcaacta ccccgtcctc 180gggcacgccc gcttcctcct ggagcggata cgtcccgaac tccagcagta cttcgtcgag 240 cggaacttcg acggccgccc cttcgaccgg gatgtgcgca gcatcgtcta cgagcgggcg 300 aagggtaccg acgccgagca gccgtacggc accgagcagg acgtctacca gcccggctac WOgagttcctga tcccgtcgat ggcgccccgc ccggtgccgc agacgccacc gcgggtgcgg 420atcggcgggc ccgactgcag ccgcccgtac gacatggcgc tgctgaatgt gtcggcgatg 480agcttcggct ccctgtcgtc gaacgcgatt ctcgccctca acgggggcgc cgcggccggg 540ggtttcgccc acgacaccgg cgagggcggc ctgtcggagt accacctgcg tcctggcggt 600gacctcgtct gggagatcgg caccggctac ttcggctgcc ggacccagga cggcgagttc 660gacccgaagg agttcgccga caaggcggcg cacgagcacg tgaagtgcgt gtcgctc汪aa 720ctctcgcagg gcgccaagcc cggcatcggc ggggtgctgc ccgggccgaa ggtcaactcc 780gagatcgcgc gggtgcggga tgtgcccgag gggcggacgg tgatctcgcc tccgtaccac 840cgggagttct ccaccccgcg cgaactcgtc ctcttcatcg ccaggatgcg ggagctgtcc 900ggcggcaagc cgaccggctt caaactctgc ccgggctcgc gccggcagtt cctcgccgtg 960tgcaaggcga tgctggagga gggtacggcc ccggacttca tcatcgtcga cggggccgag 1020ggcggcaccg gcgcggcgcc gctggagttc gccgatcacg tcggcacgcc gctcaccgag 1080gggctgctga ccgtgcacaa cgcccttgtc ggcgcgggcc tgcgcgaccg gatcaggatc 1140ggggcgagcg gcaagatcgc caccggcacc gatctggtca aacgcctgct ccagggtgcc 1200gactacggca acgccgcgcg ggcgatgatg ttcgccgtgg gctgcatcca ggcgcagcgg 1260tgcc3C3cg3 3C3cctgccc C3ccggtgtc 3ccaccc3gg 3cccccggcg tgcccgcgct 1320ctcgacgtcg gtgacaagac gctgcgcgtc cagcgcctcc aggaggcgac cgtggccagc 1380gcgctgcaga tcatggcgtc catgggggtc accgatccct cgcagctgcg tccgcacatg 1440ctccaccggc gtatcgaccc ctacaccgaa cgctcctacg acgagctcta tgagtggctg 1500cggcccgggc agttgctcgc cgagccgccc gctgcctggg cggccgactg gcacgccgcc 1560gaccccgacc gtttcaccgt gtga 1584<210> 10 <211> 28 <212> DNA<213> Streptomyces avermitilis (除蟲鏈霉菌) <400> 10cagaattcgt gcgtagctct gccatctc 28<210〉 11 <211> 28 <212> DNA<213> Streptomyces avermitilis(除蟲鏈霉菌) <400> 11gcggtacctg ccccggatgg cggtccac 28<210> 12 <211> 28 <212> DNA<213> Streptomyces avermitilis (除蟲鏈霉菌) <400> 12gcctgcagcg gatgtctcca ggaaggaa 28<210> l孑<211> 28<212> DNA<213〉 Streptomyces avermitilis (除蟲鏈霉菌)<formula>formula see original document page 25</formula>cagaattccc ccgcc犯gca agccgagt 28<210> 19 <211> 28 <212> DNA<213〉 Saccharopilyspora erythraea (糖多孢紅霉菌) <400> 19gcggtacccg g鄉(xiāng)gcgagt tgaggttc28<210> 20 <211> 28 <212〉 DNA<213〉 Saccharopilyspora erythraea (糖多孢紅霉菌) <400〉 20gcctgc鄉(xiāng)t gagttggaat cccccgcc28<210> 21 <211> 28 <212〉 DNA<213> Saccharopilyspora erythraea (糖多孢紅霉菌) <400> 21ccaagctttt agtcgcgcgc cggacggg 28<210> 22 <211〉 28 <212> DNA<213> Ampicillin (氨節(jié)青霉素) <400〉 22cgggtaccat gagtattcaa catttccg 28<210> 23 <211> 28 <212> DNA<213〉 Ampicillin (氨節(jié)青霉素) <400〉 23ccggatcctt accaatgctt aatcagtg 28
權利要求
1. 一種抗生素阿維菌素結(jié)構(gòu)類似物的生物合成基因簇，其特征在于編碼其生物合成涉及的基因包括阿維菌素合成基因簇上游處的任一段基因，滿足此基因的失活不會影響菌株的生長發(fā)育以及抗生素的生產(chǎn)主要功能；阿維菌素合成基因簇下游處的任一段基因；紅霉素合成基因簇下游處的任一段基因，滿足此基因的失活不會影響菌株的生長發(fā)育以及抗生素的生產(chǎn)主要功能；卡那霉素抗性基因與氨芐霉素抗性基因。
2 、 一種抗生素阿維菌素結(jié)構(gòu)類似物的生物合成基因簇，其特征在于編碼其生物合 成涉及的基因具體如下-1) aver-l: 504bp禾B aver-2: 507bp，位于阿維菌素產(chǎn)生菌除蟲鏈霉菌(5^印to/^c^ mw7wY/fc ATCC 31271)中阿維菌素生物合成基因簇上游SAV934和aveR基因之間的相 鄰的兩段基因；aver-C: 651bp，位于阿維菌素產(chǎn)生菌除蟲鏈霉菌(5^eptowyce;y mw7mY/fc ATCC 31271) 中阿維菌素生物合成基因簇下游aveG和yerDl基因之間的一段基因；2) Kan': 1278bp，位于pEGFP載體中的卡那霉素抗性基因；插入于aver-l和aver-2 基因之間，作為抗生素標記；3) ery-ORF6: 501bp和ery-ORF7: 438bp,位于紅霉素產(chǎn)生菌糖多孢紅霉菌 (&cc/zara/ 辦印ora e^^raefl A-50)中紅霉素生物合成基因簇下游ORF6和ORF7之間的相鄰的兩段基因；4) Ampf: 861bp， 位于pMD18-T載體中的氨節(jié)霉素抗性基因；插入于ery-ORF6 和ery-ORF7基因之間，作為抗生素標記。
3、 一種權利要求1所述的抗生素阿維菌素結(jié)構(gòu)類似物的生物合成基因簇構(gòu)造的重 組基因，其特征在于至少包括R-l : aver-l+Kanr+aver-2+阿維菌素合成基因簇+aver陽C;R-2:紅霉素合成基因簇+61^-011 7+ Ampr + aver-C +ery-ORF6;R-3 : aver-l+ KaW +aver-2+部分阿維菌素合成基因簇+部分紅霉素合成基因簇 +ery-ORF7+ Ampr + aver-C;所述的阿維菌素合成基因簇和紅霉素合成基因簇中的相似功能域如下 阿維菌素合成基因簇中，所含功能域有酰基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域AT13個，?；d體蛋白ACP 13個，酮基合成酶結(jié)構(gòu)域KS 12個，酮基還原酶結(jié)構(gòu)域KR 10個，脫氫酶結(jié)構(gòu) i或DH6個，烯酰還原酶結(jié)構(gòu)域ERO個；紅霉素合成基因簇中，相似的功能域有AT7個，ACP7個，KS6個，KR 5個， DH 1個，ER 1個。
4、 根據(jù)權利要求3所述的抗生素阿維菌素結(jié)構(gòu)類似物的生物合成基因簇構(gòu)造的重 組基因，其特征在于所述的重組基因R-3再次發(fā)生交換，以每個功能域發(fā)生一次交換計 算，可產(chǎn)生的抗生素的種類AT 13X7 = 91; ACP 13X7=91; KS 12X6 = 72; KR10X5 =50; DH6X1=6， ER0X1=0，總計91+91+72+50+6+0=310。
5、 一種重組表達載體，其特征在于它是由權利要求1所述的基因序列與質(zhì)粒、病毒 或表達載體所構(gòu)建的重組載體。
6、 按照權利要求5所述的重組表達載體，其特征在于它是由權利要求1所述的基因 序列與質(zhì)粒表達載體所構(gòu)建的重組載體pKC1139。
7、 一種基因工程化的宿主細胞，其特征在于它是選自(a) 它是用權利要求1所述的基因序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的融合細胞；(b) 它是用權利要求6所述的重組表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導的融合細胞。
8、 一種根據(jù)權利要求2所述的新的抗生素阿維菌素結(jié)構(gòu)類似物的生物合成基因簇制備阿維菌素結(jié)構(gòu)類似物的方法，其特征在于包括下迷步驟1)將除蟲鏈霉菌中阿維菌素合成基因簇上游SAV934和aveR基因之間插入卡那霉 素抗性基因，得到改造后的重組基因組(1)從阿維菌素產(chǎn)生菌5^eptowyc^ flvmm'"fo ATCC 31271中提取總DNA;根據(jù) 已知的阿維菌生物合成基因簇序列(GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號AB032524)，在阿維菌素生 物合成基因簇上游附近基因內(nèi)設計兩對引物aver-l: 504bp弓1物-averl-1: 5'—~^3': CAG/AATTC GTG CGT AGC TCT GCC ATC TC五coRl位點用下劃線表示引物-averl-2: 5'—~^3': GCGGTAC/C TGC CCC GGA TGG CGG TCC AC 《iw I位點用下劃線表示 aver-2: 507bp引物陽aver2-l: 5'—~^3': GCCTGCA/G CGG ATG TCT CCA GGAAGG AAPrfl位點用下劃線表示引物-aver2-2: 5'—~^3': CCA/AGCTT CTG CAG TAC GCC GAG GGG TT歷"dIII位點用下劃線表示aver陽C: 651 bp引物-averC-l: 5'_~^3': GCG/TCGAC AAG GCC ACG GTC GAC GAG GC&/1位點用下劃線表示引物-averC-2: 5'—~^3': GCCTGCA/G CCG GCG TTACAAAAG GTC CCPrfl位點用下劃線表示進行PCR反應，反應體系MgCl23pL， 10 Xbuffer (Mg2+free) 5)aL， DMSO 5pL， dNTP 8pL， Taq酶0.5pL，上、下游引物各lpL，模板DNA 1.5pL，加去離子水至總體 積為50nL反應程序95。C預變性5min; 94。C變性lmin, 60。C退火lmin， 72。C鏈延伸lmin， 如此進行3個循環(huán)；之后94。C變性30sec， 62。C退火lmin， 72。C鏈延伸lmin，如此進行 27個循環(huán)；最后72'C鏈延伸10min(2) 從pEGFP載體中PCR擴增卡那霉素抗性基因Kanf， 1278bp; 根據(jù)已知的pEGFP-Nl載體序列(GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號U55762)，對目的基因設計兩對引物 *Kanr: 1278bp引物-Kanr-l: 5'—~^3': CGGGTAC/C TTC AAA TAT GTA TCC GCT CAi^p"I位點用下劃線表示引物-Kanf-2: 5'—~^3': CCG/GATCC TTA GAA CCC CAG AGT CCC GC BamH I位點用下劃線表示進行PCR反應，反應體系MgCl23pL， 10Xbuffer (Mg2+free) 5pL， DMSO 5pL， dNTP 8pL， Taq酶0.5pL，上、下游引物各lpL，模板DNA 1.5^iL，加去離子水至總體 積為50pL反應程序95。C預變性5min; 94。C變性lmin， 51。C退火lmin， 72。C鏈延伸lmin， 如此進行3個循環(huán)；之后94。C變性30sec， 53。C退火lmin， 72。C鏈延伸lmin，如此進行 27個循環(huán)；最后72'C鏈延伸10min(3) 將純化測序驗證后的目的基因Kanf、 aver_i和aver_2基因以及aver-C基因連 于pMD18-T載體上；將連于pMD18-T載體上的aver-l基因應用限制性內(nèi)切酶￡coR I和《;w I進行雙酶 切，與被同樣雙酶切的連有Kanr基因的pMD18-T載體發(fā)生粘性末端連接；將連于pMD18-T載體上的aver-2基因應用限制性內(nèi)切酶尸W I和///"dlll進行雙酶 切，與被同樣雙酶切的連有Kanf和aver-l基因的pMD18-T載體發(fā)生粘性末端連接；將連于pMD18-T載體上的Kanf以及aver-1/2基因應用限制性內(nèi)切酶￡coR I和///wd III進行雙酶切，將含有Kanf以及aver-1/2的這段基因連于與被同樣雙酶切的pKC1139 質(zhì)粒上；將含有目的基因的pKC1139重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ET12567中進行表達，得 到陽性克隆子；挑取單菌落(陽性克隆子)搖瓶培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，之后將所提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至除蟲鏈霉 菌中進行表達，得到陽性克隆子，記作Y-l;2)將糖多孢紅霉菌紅霉素合成基因簇下游ORF7和ORF6基因之間插入氨芐霉素 抗性基因和"C"基因，得到改造后的重組基因組(1)從紅霉素產(chǎn)生菌Sacc/wrap/fywora eo^raea A-50中提取總DNA;根據(jù)己知的 紅霉素生物合成基因簇序列(GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號U82823)，在紅霉素生物合成基因 簇上游附近基因內(nèi)設計兩對引物ery國ORF6: 501 bp引物ery-l-l: 5'—~^3': CAG/AATTC CCC CGC CAAGCAAGC CGAGTEcoRl位點用下劃線表示引物ery-l陽2: 5'—~^3': GCGGTAC/C CGG AGG GCG AGT TGA GGT TC/Q^I位點用下劃線表示ery-ORF7: 438bp引物ery-2-l: 5'_~^3': GCCTGCA/G GTG AGTTGG AAT CCC CCG CCPWI位點用下劃線表示引物ery-2-2: 5'—~^3': CCA/AGCTT TTA GTC GCG CGC CGG ACG GG //z'mini位點用下劃線表示進行PCR反應，反應體系MgCl23pL， 10Xbuffer (Mg2+free) 5pL， DMSO 5pL， dNTP 8pL， Taq酶0.5nL，上、下游引物各lpL，模板DNA1.5pL，加去離子水至總體 積為50pL反應程序95。C預變性5min; 94。C變性lmin， 6(TC退火lmin， 72。C鏈延伸lmin， 如此進行3個循環(huán)；之后94。C變性30sec， 62。C退火lmin， 72。C鏈延伸lmin，如此進行 27個循環(huán)；最后72'C鏈延伸10min;(2) 從pUC18載體中PCR擴增氨芐霉素抗性基因Ampf， 861bp;根據(jù)pUC18載體序列(GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號L08752)，對目的基因設計兩對引物 Ampr: 861bp引物-ampl-l: 5'—~^3': CGGGTAC/C ATG AGT ATT CAA CAT TTC CG^Wl位點用下劃線表示；引物-ampl陽2: 5'—~^3': CCG/GATCC TTA CCA ATG CTT A AT CAG TG 萬amH I位點用下劃線表示；進行PCR反應，反應體系MgCl23^L， 10Xbuffer (Mg2+free) 5pL， DMSO 5pL， dNTP 8pL， Taq酶0.5pL，上、下游引物各lpL，模板DNA 1.5pL，加去離子水至總體 積為50pL反應程序95。C預變性5min; 94"變性lmin， 51t:退火lmin， 72。C鏈延伸lmin， 如此進行3個循環(huán)；之后94。C變性30sec， 53。C退火lmin， 72。C鏈延伸lmin，如此進行 27個循環(huán)；最后72"C鏈延伸10min;(3) 將純化測序驗證后的目的基因Ampr連于pKC1139載體上，將純化測序驗證后 的目的基因ery-ORF6和ery-ORF7基因連于pMD18-T載體上；將連于pMD18-T載體上的aver-C基因應用限制性內(nèi)切酶1和iV I進行雙酶切， 與被同樣雙酶切的pMD18-T載體發(fā)生粘性末端連接；將連于pMD18-T載體上的ery-ORF6基因應用限制性內(nèi)切酶&oR I和《/ " I進行雙 酶切，與被同樣雙酶切的連有aver-C基因的pMD18-T載體發(fā)生粘性末端連接；將連于pMD18-T載體上的ery-ORF7基因應用限制性內(nèi)切酶iV I和歷wdIII進行雙 酶切，與被同樣雙酶切的連有aver-C和ery-ORF6基因的pMD18-T載體發(fā)生粘性末端連接；將連于pMD18-T載體上的aver-C和ery-ORF6/7基因應用限制性內(nèi)切酶五coR I和 歷"dIII進行雙酶切，將含有aver-C和ery-ORF6/7的這段基因連于與被同樣雙酶切的 pKC1139質(zhì)粒上；將連于pKC1139質(zhì)粒上的Am^基因應用限制性內(nèi)切酶〖;w I和5amH I進行雙酶 切，與被同樣雙酶切的連有aver-C以及ery-ORF6/7基因的pKC1139質(zhì)粒發(fā)生粘性末端 連接；將含有目的基因Ampr、 aver-C以及ery-ORF6/7的pKC1139重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸 桿菌ET12567中進行表達，得到陽性克隆子；挑取單菌落(陽性克隆子)搖瓶培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，之后將所提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至糖多孢紅 霉菌中進行表達，得到陽性克隆子，記作Y-2;3)將分別含有上述兩步所得兩大重組基因組的兩個細胞進行融合，基因組之間發(fā)生 同源雙交換，得到一種新的重組基因組，篩選兼具卡那、氨芐兩種抗性的融合細胞，獲 得可以產(chǎn)生新的抗生素結(jié)構(gòu)類似物的微生物(1) 將上述兩種鏈霉菌突變株的新鮮斜面孢子接入培養(yǎng)基中，28'C振蕩培養(yǎng)48h， 再轉(zhuǎn)接到同一培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)24h,離心收集菌體，先用0.3mol/L蔗糖溶液洗滌2 次，再用培養(yǎng)基洗滌l次，菌體重懸于培養(yǎng)基中，每毫升菌體懸浮液加2 4mg溶菌酶， 混合均勻，置于32。C保溫1.5h左右，取樣鏡檢；至菌絲大部分裂解即停止溶菌，用滴管 用力吹吸幾次，促使原生質(zhì)體與殘存的細胞壁分離，并使串球狀的原生質(zhì)體分散；然后 用2000r/min離心10min，傾去上清液，以除去多余的溶菌酶，將沉下的原生質(zhì)體懸浮于 5mL培養(yǎng)基中，用低速離心法(500r/min,離心5min)使殘留的菌絲片斷沉于管底，將 上部懸液移至另一消毒的離心管，反復幾次，即可得到純凈的原生質(zhì)體；(2) 分別吸取0.5mL兩親株的原生質(zhì)體于同一離心管內(nèi)混合，加入5mL聚乙二醇 (PEG 1000)溶液，42g PEG溶于100mL培養(yǎng)基中，pH=7.2，小心混勻，置于32。C水浴保溫5min，然后以2000r/min離心10min，傾去上清液，再用培養(yǎng)基洗滌混合的原生 質(zhì)體1次，以除去殘存的PEG，用培養(yǎng)基作適當?shù)南♂?，每只平板涂O.lmL重組子，記 作Y-3，可以通過雙抗生素篩選直接檢出；(3) 含重組子Y-3的除蟲鏈霉菌突變株的生長繁殖及新的抗生素結(jié)構(gòu)類似物的產(chǎn) 生搖瓶培養(yǎng)含重組子Y-3的除蟲鏈霉菌突變株，28°C， 220r/min培養(yǎng)，在下列時間點 12小時，16小時，20小時，24小時，36小時，48小時，60小時，72小時，84小時收 集菌體，4000rpm離心10分鐘，將菌體放在已稱重的衡重濾紙上，置于8(TC，烘干至 衡重，稱量菌體質(zhì)量，用菌體干重量對生長時間作圖，即為菌體的生長曲線，每一時間 點均做三次對照；運用液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀器等設備對發(fā)酵液產(chǎn)物進行相關檢測。
9、權利要求1-7任一項所述的抗生素阿維菌素結(jié)構(gòu)類似物的生物合成基因簇的用 途，其特征在于，兼具卡那、氨芐兩種抗生素抗性標記，其所在的微生物產(chǎn)生的抗生素 結(jié)構(gòu)類似物。
全文摘要
本發(fā)明涉及融合阿維菌素及紅霉素合成基因簇的組合生物合成應用。編碼一種新的抗生素阿維菌素結(jié)構(gòu)類似物的生物合成涉及的基因包括1)aver-1504bp和aver-2507bp，aver-C651bp，Kan^r1278bp，ery-ORF6501bp和ery-ORF7438bp；Amp^r861bp。對不同種聚酮類化合物的合成基因簇上游或下游進行抗生素標記，通過細胞融合技術，可以得到抗生素阿維菌素的結(jié)構(gòu)類似物。本發(fā)明提供了產(chǎn)生新的抗生素結(jié)構(gòu)類似物的微生物的方法，可以用來尋找和發(fā)現(xiàn)可用于醫(yī)藥、工業(yè)或農(nóng)業(yè)的化合物、抗生素、基因或蛋白，亦為已知生物活性分子的高產(chǎn)和新微生物農(nóng)藥的創(chuàng)新提供新的技術和手段。
文檔編號C12P19/62GK101265473SQ20071005691
公開日2008年9月17日 申請日期2007年3月14日 優(yōu)先權日2007年3月14日
發(fā)明者喬建軍, 玉 蘭, 孫艷華, 凡 范, 黃惠娟 申請人:天津大學