專利名稱：：一種誘變菌株白色鏈霉菌TUST2及利用該誘變菌株生產(chǎn)ε-聚賴氨酸及其鹽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于發(fā)酵工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種大量產(chǎn)生e-聚賴氨酸的誘變菌株白色鏈霉菌TUST2及利用該誘變菌株TUST2采用發(fā)酵法生產(chǎn)e-聚賴氨酸及其鹽的方法。
背景技術(shù)：
：e-聚賴氨酸(e-poly-L-lysine，簡稱e-PL)是由微生物合成的L-賴氨酸同聚物，由e-氨基與a-羧基通過肽鍵連接而成。聚賴氨酸具有抗革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌和病毒的活性，是一種性能優(yōu)良的生物防腐劑，廣泛應(yīng)用于化妝品、基因載體、藥物包被、電子材料和環(huán)保材料等方面?，F(xiàn)有技術(shù)中發(fā)酵生產(chǎn)e-PL的方法，已知有一種方法(審結(jié)日本專利公開59-20359)，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)小白鏈霉菌lysinopolymerus亞種346-D(FERMP-3834)，該菌株為從自然界分離的產(chǎn)e-PL菌株，屬于鏈霉菌屬，然后從培養(yǎng)基中分離和純化e-PL。還有另-一種己知方法(審結(jié)日本專利公開3-42070或?qū)徑Y(jié)日本專利公開3-78998)，包括對小白鏈霉菌lysinopolymerus亞種346-D進行誘變處理，使其轉(zhuǎn)化為對L-賴氨酸類似物S—(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸具有抗性的突變體，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得突變體，即小白鏈霉菌lysinopolymerus亞種11011A-1(FERMBP-1109)，然后從培養(yǎng)基中分離和純化e-PL。1989年日本Chisso公司利用白色鏈霉菌實現(xiàn)丫產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。然而，就e-PL產(chǎn)量和葡萄糖轉(zhuǎn)化效率而言，仍不能令人滿意。W此，篩選具有更高產(chǎn)量的e-PL生產(chǎn)菌株具有重要的意義。發(fā)明人經(jīng)過大量研究分析，通過篩選新的具有更高產(chǎn)酸能力的生產(chǎn)菌株，發(fā)現(xiàn)了對濃度為10mg/ml或更高的e-聚賴氨酸具有耐受性的菌株可能高產(chǎn)e-聚賴氨酸；同時發(fā)現(xiàn)了對濃度為10mg/ml或更高的S—(2-氨基乙基)一L一半胱氨酸(AEC)具有抗性的突變體可能是具有大量生成e-PL能力的菌株，該菌株在培養(yǎng)基中進行好氣培養(yǎng)可大量產(chǎn)生e-PL。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一是提供一種與常規(guī)e-PL生產(chǎn)菌株相比其e-PL生成能力更高并由此能夠有效提高e-PL產(chǎn)率的誘變菌株白色鏈霉菌TUST2;本發(fā)明另一個目的是提供一種利用該誘變菌株白色鏈霉菌TUST2采用發(fā)酵法大量廉價生產(chǎn)e-PL及其鹽的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種大量產(chǎn)生e-聚賴氨酸的誘變菌株白色鏈霉菌TUST2，其特征在于該誘變菌株白色鏈霉菌TUST2已由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCNo.1986，保藏日期為2007年03月23日。而且，所述的誘變菌株TUST2是將添加e-聚賴氨酸的富集培養(yǎng)基從海南島土壤中篩選出高產(chǎn)e-聚賴氨酸的生產(chǎn)菌株白色鏈霉菌TUST1為出發(fā)菌株經(jīng)誘變處理后獲得的，其對10mg/ml或更高濃度的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸具有抗性。而且，所述的誘變處理的方法是(1).在e-聚賴氨酸的生產(chǎn)菌株TUST1孢子懸液內(nèi)加入硫酸二乙酯，使該菌株孢子與其接觸10分鐘2小時；(2).然后使該菌株接受1001000J/cm2紫外線輻射處理；(3).再用5-溴尿嘧啶等化學(xué)品處理該菌株；(4).進行N離子注入或其它常規(guī)化學(xué)或物理誘變處理；(5).將誘變處理后的菌株接種于固體培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基含10mg/ml或更高濃度的S—(2—氨基乙基)一L一半胱氨酸(AEC)、2mg/ml甘氨酸，篩選培養(yǎng)基中生長的菌株，即得到高產(chǎn)誘變菌株TUST2。一種大量產(chǎn)生e-聚賴氨酸的誘變菌株白色鏈霉菌TUST2采用發(fā)酵法生產(chǎn)e-聚賴氨酸及其鹽的方法，其生產(chǎn)方法是將TUST2菌株在含有碳源、氮源及無機鹽的培養(yǎng)基中，在2537'C下通氣培養(yǎng)，在優(yōu)化條件下其e-聚賴氨酸的產(chǎn)量為1030g/L。其發(fā)酵液離心除去菌體后，經(jīng)硅藻土過濾得到澄清濾液，再通過離子交換樹脂得到e-聚賴氨酸粗產(chǎn)品，后經(jīng)超濾膜純化得到e-聚賴氨酸及其鹽，其分子量分布為40006500Da。而且，所述的誘變菌株TUST2在培養(yǎng)基中的碳源為葡萄糖、甘油、甘露醇、山梨醇和檸檬酸鈉的其中之一。而且，所述的誘變菌株TUST2在培養(yǎng)基中可利用的氮源為有機氮源牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、玉米漿，也可采用無機氮源(NH4)2S04、NH4C1、NH4N03，上述氮源可以單獨使用也可以復(fù)合使用。而且，所述的離子交換樹脂為弱酸性陽離子交換樹脂，所用的超濾膜為聚砜超濾膜。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果1.本發(fā)明的誘變菌株TUST2與常規(guī)e-PL生產(chǎn)菌株相比，其e-PL生成能力更高，并由此能夠有效提高e-PL產(chǎn)率。2.利用該誘變菌株TUST2可大量廉價生產(chǎn)e-PL及其鹽。圖1為本發(fā)明的誘變菌株TUST1的菌絲照片。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。首先需要說明的是1.大量產(chǎn)生e-聚賴氨酸的誘變菌株白色鏈霉菌TUST2已由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCNo.1986，保藏日期為2007年03月23日。2.本發(fā)明的誘變菌株TUST2是將添加e-聚賴氨酸的富集培養(yǎng)基從海南島土壤中篩選出高產(chǎn)e-聚賴氨酸的生產(chǎn)菌株TUST1為出發(fā)菌株經(jīng)誘變處理后獲得的，其對濃度為10mg/ml或更高的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸具有抗性。3.用于本發(fā)明的AEC是L-賴氨酸的結(jié)構(gòu)類似物(類似物)，其與L-賴氨酸在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別僅在于4位上硫原子取代了碳原子。向培養(yǎng)基中加入AEC導(dǎo)致微生物生長的抑制，與甘氨酸一起使用時，生長抑制更為明顯和強烈。4."誘變處理"在本文中是指引起屬于鏈霉菌屬、能產(chǎn)生e-PL的微生物(菌株)突變的處理，從而獲得對濃度為10mg/ml或更高的AEC具有抗性的誘變菌株。誘變處理方法的實例包括加入硫酸二乙酯(DES)，使菌株孢子懸液與DES接觸10分鐘2小時的方法；使菌株接受1001000J/cn^紫外線輻射處理的方法；用5-溴尿嘧啶等化學(xué)品處理菌株的方法；N離子注入和其它常規(guī)化學(xué)或物理誘變處理方法。經(jīng)誘變處理菌株的篩選方法為將誘變處理后的菌株接種于固體培養(yǎng)基上，每毫升培養(yǎng)基中含10mg或更高濃度的AEC、含2mg/ml甘氨酸，收集在培養(yǎng)基中生長的菌株并進行篩選。下面具體敘述本實施例-一、從土壤中篩選出的產(chǎn)生e-PL的菌株TUST1。以下描述菌株TUST1的菌學(xué)特性。1.形態(tài)特征TUST1菌絲發(fā)育良好，無特殊結(jié)構(gòu)分化，氣生菌絲形成長孢子鏈，孢子絲波曲，孢子橢圓形，大小較均勻，呈鏈狀生成氣生菌絲的孢子梗(參見圖l照片)。2.培養(yǎng)特征3(TC培養(yǎng)710天，觀察菌株在下列各種培養(yǎng)基上的特征。表1麗l菌株的培養(yǎng)特征__藩"_氣生菌絲可溶性色素白色，絨狀，致密，褶皺，無生長良好白色，絨狀，致密，生長無良好白色，棉絮狀，生長良好無灰白色，生長良好，疏松，無絨粉狀白色，薄，生長較差無白色，絨粉狀，生長良好無雪白色，棉絮狀，疏松，無生長良好灰白色，絨狀，致密，褶無皺，生長良好3.生理生化性質(zhì)(1)培養(yǎng)溫度在2537"C。最適溫度為3(TC。(2)明膠液化、淀粉水解、牛奶胨化陽性。(3)牛奶凝固陽性。(4)纖維素利用陰性。(5)仏S生成陰性。(6)幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生陰性。(7)色素產(chǎn)生無。4.可以利用的碳源葡萄糖、蔗糖、甘油、麥芽糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、棉籽糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇、檸檬酸鈉、肌醇和乳糖其中之一。潛養(yǎng)基基內(nèi)菌絲高氏一號無色葡萄糖天門冬素瓊脂無色甘油天門冬素瓊脂無色察氏瓊脂灰白色淀粉瓊脂略黃燕麥粉瓊脂無色馬鈴薯塊無色營養(yǎng)瓊脂無色75.可利用的氮源有機氮源牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、玉米漿等，也可采用無機氮源(NH4)2S04、NH4C1、腳03等。上述氮源可以單獨使用也可以復(fù)合使用。二、以高產(chǎn)菌株TUST1為出發(fā)菌株通過誘變處理篩選出的誘變菌株TUST2。獲得本發(fā)明對高濃度AEC具有抗性的菌株的說明性實例如下1.誘變菌株的獲得(1).紫外誘變。(2).化學(xué)誘變。(3).化學(xué)誘變和紫外誘變相結(jié)合。(4).N離子注入誘變。產(chǎn)e-PL菌株白色鏈霉菌TUST1菌株誘變后，其孢子懸浮在tris-馬來酸緩沖液(P朋.0)中，所得孢子通過離心分離收集，用磷酸緩沖液(O.05M，pH7.0)洗滌，在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基(葡萄糖1.0%，牛肉膏O.1%，蛋白胨0.2%，酵母粉0.2%，KH2P040.136%，K2HP040.08%，MgS04'7H200.05%，F(xiàn)eS04'7H200.003%,ZnS04'7&00.004%)中溫育過夜。然后離心收集細(xì)胞，用磷酸緩沖液(O.05M，pH7.O)洗滌，在含有10mg/mlAEC和2mg/ml甘氨酸的固體培養(yǎng)基(葡萄糖5%，硫酸銨1%，K2HP040.08%，KH2P040.136%，MgS04*7H200.05%，ZnS047H200.004%，F(xiàn)eS04'7H200.003%，pH6.8，瓊脂1.5%;其中^表示g/dl%)中鋪平板，3(TC溫育34天。收集形成的菌落，評價所得的對高濃度AEC具有抗性的菌株的e-PL產(chǎn)率。結(jié)果，篩選出高產(chǎn)菌株TUST2。對高濃度AEC具有抗性的誘變菌株對AEC的抗性如下評價。將誘變菌株和親本菌株接種至基本瓊脂培養(yǎng)基(如上述)中，培養(yǎng)基中加入AEC的濃度如下表2所示，甘氨酸的濃度為2mg/ml，3(TC溫育27天，肉眼觀察生長情況，結(jié)果示于表2。表2TUST1和TUST2對AEC的抗性試驗菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>TUST210++++++20++++++40-±++++注釋+有生長±少生長-無生長本發(fā)明的誘變菌株對高濃度AEC具有抗性，在這方面，其可與親本菌株明確地區(qū)分。2.以下描述誘變菌株TUST2的特性。(1)形態(tài)特征TUST2菌絲發(fā)育良好，氣生菌絲形成長孢子鏈，孢子絲波曲，孢子橢圓形，大小較均勻，呈鏈狀生成氣生菌絲的孢子梗。(2)培養(yǎng)特征3(TC培養(yǎng)710天，觀察菌株在下列各種培養(yǎng)基上的特征。表3TUST2菌株的培養(yǎng)特征基內(nèi)菌絲氣生菌絲可溶性色素高氏一號略黃白色，繞菌落成環(huán)無葡萄糖天門冬素瓊脂無色白色，繞菌落成環(huán)無甘油天門冬素瓊脂無色白色無察氏瓊脂無色灰白色，貧乏，繞菌落成環(huán)無淀粉瓊脂無色白色，少，生長差無燕麥粉瓊脂無色白色，較貧乏，繞菌落成環(huán)無馬鈴薯塊白色灰白色無營養(yǎng)瓊脂無色白色，粉狀無(3)生理生化性質(zhì).培養(yǎng)溫度在2537。C。最適溫度為3(TC。.明膠液化、淀粉水解、牛奶胨化陽性。.牛奶凝固陽性。.纖維素利用陰性。.仏S生成陽性。.幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生陰性。.色素產(chǎn)生無。(4)可利用的碳源葡萄糖、甘油、甘露醇、山梨醇和檸檬酸鈉的其中之一。①②③④⑤⑥⑦(5)可利用的氮源有機氮源牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、玉米漿等；也可采用無機氮源(NH4)2S04、NH4C1、N,3等。上述氮源可以單獨使用也可以復(fù)合使用。(6)16SrDNA序列分析以GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的鏈霉菌16SrDNA保守區(qū)為模板，設(shè)計PCR引異性擴增16SrDNA的Y可變區(qū)。菌株TUST2的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)測序后，長度為411bp，序列如下>TUST2gamma—variable—region—16S一rRNA—seq411bpTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGC將所測序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的鏈霉菌16SrDNA序列進行比較，構(gòu)建基于16SrDNAY可變區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明菌株TUST2與白色鏈霉菌屬菌株同源性很高。此外，在核糖體數(shù)據(jù)庫RibosomalDatabaseProjectII進行16SrDNA序列比對分析，結(jié)果相同。最后，結(jié)合形態(tài)、細(xì)胞化學(xué)成分及16SrDNA序列分析的系統(tǒng)發(fā)育研究結(jié)果，可以將菌株TUST2的分類地位確定為白色鏈霉菌。三、誘變菌株TUST2培養(yǎng)生產(chǎn)e-聚賴氨酸及其鹽利用誘變菌株TUST2制備e-聚賴氨酸及其鹽的方法，是將誘變菌株TUST2接種至斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)47天，之后在含有碳源、氮源的培養(yǎng)基上2537'C培養(yǎng)，最后由培養(yǎng)基中分離和純化形成和積累的e-PL。只要其中含有適量碳源、氮源、無機物和其它營養(yǎng)素，任何培養(yǎng)基均可使用。至于碳源，優(yōu)先選擇葡糖糖。加入的量優(yōu)選為15%(%表示g/dl%)。氮源中優(yōu)選硫酸銨。優(yōu)選加入的氮源的量為0.22%(%表示g/dl%)。培養(yǎng)時，可連續(xù)加入碳源和氮源。無機物的實例包括磷酸根離子、鉀離子、鈉離子、鎂離子，鋅離子、鐵離子和硫酸根等離子。在好氣條件下振蕩培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)或其它方法培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為2537°C。培養(yǎng)基的pH接近中性(pH6.8)，但開始培養(yǎng)后PH會降低。當(dāng)pH降低到4時，加入堿維持pH為4。加入的堿優(yōu)選為氨水，但氫氧化鈉、氫氧化鉀或其它堿也可使用，通常17天后e-PL在培養(yǎng)基中積累。發(fā)酵液離心分離菌體，硅藻土過濾得到澄清濾液，通過弱酸型離子交換樹脂得到e-聚賴氨酸粗產(chǎn)品，后經(jīng)超濾膜純化得到e-聚賴氨酸及其鹽，分子量分布為40006500Da。本發(fā)明制備的e-聚賴氨酸及其鹽具有如下理化性質(zhì)(1)本產(chǎn)品溶于水、鹽酸，微溶于乙醇，不溶于乙醚、乙酸乙酯等有機溶劑；(2)對茚三酮反應(yīng)呈陽性，用6NHC1水解后對茚三酮呈陽性。(3)6NHC1水解后，用紙層析和薄層層析檢測，發(fā)現(xiàn)其水解液呈單一的氨基酸一一賴氨酸，表明本產(chǎn)品為賴氨酸的高分子聚合物。(4)采用液態(tài)核磁共振和固態(tài)核磁共振分析，鑒定了產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)為e-型結(jié)構(gòu)，由一個L-賴氨酸的e-朋2與另一個L-賴氨酸的a-COOH形成的肽鍵連接而聚合成的高分子e-聚賴氨酸。(5)通過SDS-PAGE電泳測出e-PL分子量為40006500Da。權(quán)利要求1.一種大量產(chǎn)生ε-聚賴氨酸的誘變菌株白色鏈霉菌TUST2，其特征在于該誘變菌株白色鏈霉菌TUST2已由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCCNo.1986，保藏日期為2007年03月23日。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大量產(chǎn)生e-聚賴氨酸的誘變菌株白色鏈霉菌TUST2，其特征在于所述的誘變菌株TUST2是將添加e-聚賴氨酸的富集培養(yǎng)基從海南島土壤中篩選出高產(chǎn)e-聚賴氨酸的生產(chǎn)菌株白色鏈霉菌TUST1為出發(fā)菌株經(jīng)誘變處理后獲得的，其對10mg/ml或更高濃度的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸具有抗性。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種大量產(chǎn)生e-聚賴氨酸的誘變菌株白色鏈霉菌TUST2，其特征在于所述的誘變處理的方法是(1).在e-聚賴氨酸的生產(chǎn)菌株TUST1孢子懸液內(nèi)加入硫酸二乙酯，使該菌株孢子與其接觸10分鐘2小時；(2).然后使該菌株接受1001000J/cm2紫外線輻射處理；(3).再用5-溴尿嘧啶等化學(xué)品處理該菌株；(4).進行N離子注入或其它常規(guī)化學(xué)或物理誘變處理；(5).將誘變處理后的菌株接種于固體培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基含10mg/ml或更高濃度的S—(2—氨基乙基)一L一半胱氨酸、2mg/ml甘氨酸，篩選培養(yǎng)基中生長的菌株，即得到高產(chǎn)誘變菌株TUST2。4.一種如權(quán)利要求1所述的一種大量產(chǎn)生e-聚賴氨酸的誘變菌株白色鏈霉菌TUST2采用發(fā)酵法生產(chǎn)e-聚賴氨酸及其鹽的方法，其特征在于其生產(chǎn)方法是將TUST2菌株在含有碳源、氮源及無機鹽的培養(yǎng)基中，在2537'C下通氣培養(yǎng)，在優(yōu)化條件下其e-聚賴氨酸的產(chǎn)量為1030g/L。其發(fā)酵液離心除去菌體后，經(jīng)硅藻土過濾得到澄清濾液，再通過離子交換樹脂得到e-聚賴氨酸粗產(chǎn)品，后經(jīng)超濾膜純化得到e-聚賴氨酸及其鹽，其分子量分布為40006500Da。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種大量產(chǎn)生e-聚賴氨酸的誘變菌株白色鏈霉菌TUST2采用發(fā)酵法生產(chǎn)e-聚賴氨酸及其鹽的方法，其特征在于所述的誘變菌株TUST2在培養(yǎng)基中的碳源為葡萄糖、甘油、甘露醇、山梨醇和檸檬酸鈉的其中之一。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種大量產(chǎn)生e-聚賴氨酸的誘變菌株白色鏈霉菌TUST2采用發(fā)酵法生產(chǎn)e-聚賴氨酸及其鹽的方法，其特征在于:所述的誘變菌株TUST2在培養(yǎng)基中可利用的氮源為有機氮源牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、玉米漿，也可采用無機氮源(NH4)2S04、NH4C1、NH4N03，上述氮源可以單獨使用也可以復(fù)合使用。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種大量產(chǎn)生e-聚賴氨酸的誘變菌株白色鏈霉菌TUST2采用發(fā)酵法生產(chǎn)e-聚賴氨酸及其鹽的方法，其特征在于所述的離子交換樹脂為弱酸性陽離子交換樹脂，所用的超濾膜為聚砜超濾膜。全文摘要本發(fā)明涉及一種誘變菌株白色鏈霉菌TUST2及利用該誘變菌株生產(chǎn)ε-聚賴氨酸及其鹽的方法，該菌株是從我國海南省土壤中篩選出的ε-聚賴氨酸的生產(chǎn)菌株白色鏈霉菌TUST1的基礎(chǔ)上利用紫外誘變、紫外和化學(xué)誘變相結(jié)合，以及N離子注入誘變等手段選育出高產(chǎn)ε-聚賴氨酸的誘變菌株；該菌株對10mg/ml或更高濃度的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸具有抗性，并在優(yōu)化條件下產(chǎn)酸量在10～30g/L；發(fā)酵液經(jīng)離心除去菌體后，經(jīng)硅藻土過濾得到澄清濾液，通過弱酸型離子交換樹脂得到ε-聚賴氨酸粗產(chǎn)品，后經(jīng)超濾純化得到ε-聚賴氨酸及其鹽，其分子量分布為4000～6500Da。文檔編號C12N1/38GK101285046SQ200710057098公開日2008年10月15日申請日期2007年4月9日優(yōu)先權(quán)日2007年4月9日發(fā)明者曹偉鋒,力李,歐竑宇,袁國棟,譚之磊,賀新義,賈士儒,穎趙,鄧子新申請人:天津科技大學(xué)