專利名稱：一種分離和固定化酶的免疫磁性微球的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用免疫磁性微球進行酶的分離純化和固定化的方法，特別是可用于分離純化L-半胱氨酸脫巰基酶的免疫磁性微球的制備及其在合成L-半胱氨酸中的應(yīng)用，以提高L-半胱氨酸的轉(zhuǎn)化率。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)方法上，酶的分離純化過程較為繁瑣復(fù)雜，需經(jīng)過細胞破碎、離心分離、鹽析、疏水層析、陰陽離子交換層析和凝膠過濾層析等過程，導致酶的收率較低。
酶的固定化技術(shù)已成為生物技術(shù)中非?；钴S的研究領(lǐng)域之一，傳統(tǒng)上主要是采用吸附、包埋、交聯(lián)以及共價結(jié)合等方法，均具有各自的局限性，開發(fā)新型、高效的固定化酶技術(shù)已成為這一領(lǐng)域的發(fā)展趨勢。
磁性微球(Magnetic Microspheres，MMS)，或叫磁性微珠(Magnetic Beads，MB)是近年發(fā)展起來并廣泛應(yīng)用于磁性材料、生物工程以及生物醫(yī)藥等領(lǐng)域的一種新型多功能試劑。磁性微球是指含有磁性金屬或金屬氧化物(如Fe、Co、Ni及其氧化物)超細粉末而具有磁響應(yīng)性的高分子微球。由于其超順磁性，給目標生物產(chǎn)品的分離帶來了革命性的發(fā)展；而且由于其在磁性環(huán)境可以快速富集，因此為實現(xiàn)免疫學分析分離以及靶向給藥提供了可能。由于磁性微球具備成本低廉，材質(zhì)優(yōu)良以及生物相容性高等諸多優(yōu)點，其應(yīng)用范圍已日漸廣泛。
免疫磁性分離(Immunomagnetic separation，IMS)，是基于磁性微球發(fā)展起來的一項新技術(shù)，通過將抗體固定于磁性微球載體上，實現(xiàn)對目標抗原的一步分離純化，在具有高效的磁響應(yīng)性能的同時，又具有親和層析的高度特異性。早期用于抗體固定化的方法主要采用物理吸附法和化學耦聯(lián)法，前者結(jié)合效率低且存在抗體泄漏的問題，后者借助于化學官能團耦聯(lián)抗體，存在隨機性，并因空間位阻的存在而降低其抗原的結(jié)合活性，這無疑影響了免疫磁性分離技術(shù)的應(yīng)用研究。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，為酶的分離純化和固定化技術(shù)開辟一條新的途徑，涉及利用免疫磁性微球?qū)δ康拿高M行一步分離純化和固定化的技術(shù)。
本發(fā)明采用金黃色葡萄球菌蛋白A(ProteinA)作為橋聯(lián)劑將IgG抗體固定于磁性微球載體上，以生物特異性耦聯(lián)法代替了傳統(tǒng)的物理吸附法和化學鍵合法，所制備的免疫磁性微球可應(yīng)用于一步分離純化目的酶，以及進一步固定化目的酶，進而對其底物進行連續(xù)的催化反應(yīng)。
本發(fā)明具體內(nèi)容包括一.免疫磁性微球的制備制備用于分離純化和固定化酶的免疫磁性微球，是將按照中國專利ZL03144274.9所述方法活化后的磁性微球與ProteinA溶液于4℃反應(yīng)過夜，采用PBS緩沖液充分洗滌6～8次；再將耦聯(lián)有Protein A的磁性微球置于NaHCO3-NaCO3緩沖液中與多抗血清或者單抗腹水進行吸附連接；經(jīng)PBS充分洗凈后，采用二甲基庚二酸酯(DMP)進行ProteinA和IgG與磁性微球表面的交聯(lián)固定，最后加入TBS緩沖液終止反應(yīng)，充分洗凈后即得到可用于目的酶的分離純化的免疫磁性微球，其抗體耦聯(lián)量為4～10mg/mL。
二.目的酶的分離純化將耦聯(lián)有抗目的酶抗體的免疫磁性微球與含有目的酶的細胞裂解液混合，于2～8℃振蕩反應(yīng)2～12小時；然后將其置于磁珠收集器上用于吸附固定磁性微球，棄去反應(yīng)液，經(jīng)PBS充分洗凈后，采用甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH 1.5～3.5)于2～8℃振蕩解離吸附的目的酶；磁性分離微球，并采用PB緩沖液中和解離液，即得到純化的目的酶。所收集的免疫磁性微球經(jīng)PBS洗凈后，可重復(fù)使用。
三.目的酶的固定化將耦聯(lián)有抗目的酶抗體的免疫磁性微球，與細胞裂解液混合，并于2～8℃振蕩反應(yīng)2～12小時；然后將其置于磁珠收集器上用于吸附固定磁性微球，除去反應(yīng)液，經(jīng)PBS充分洗凈后，結(jié)合有目的酶的免疫磁性微球可用于催化特定的底物進行連續(xù)的酶促反應(yīng)。
與傳統(tǒng)上分離純化酶的方法相比較，采用生物特異性耦聯(lián)法制備的免疫磁性微球用于目的酶的分離純化和固定化，具有方便、新穎、高效等優(yōu)點。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用生物特異性耦聯(lián)的方法，將單克隆或多克隆抗體固定于磁性微球載體上，得到可用于分離純化和固定化酶的免疫磁性微球；通過免疫磁性微球，無須對樣品進行復(fù)雜的前處理，可以直接從細胞裂解液中，一步分離純化和固定化目的酶，大大簡化操作步驟。該免疫磁性微球可多次重復(fù)使用，提高了效率降低了成本。本發(fā)明不同與傳統(tǒng)方法，為一種簡便、快速、高效的酶分離純化和固定化的新技術(shù)。

圖1.SDS-PAGE、Westem blot和L-半胱氨酸脫巰基酶活性染色分析ASDS-PAGE；BWestern blot；CL-半胱氨酸脫巰基酶活性染色。圖中各泳道為泳道1包含pETcd的大腸桿菌BL21(DE3)重組菌株菌體裂解液；泳道2純化的L-半胱氨酸脫巰基酶重組蛋白；泳道3惡臭假單胞菌TS1138菌體裂解液；泳道4經(jīng)過免疫磁性微球處理的惡臭假單胞菌TS1138菌體裂解液；泳道5從磁性微球上洗脫下來的L-半胱氨酸脫巰基酶。
圖2.免疫磁性微球處理TS1138菌體裂解液轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-半胱氨酸A溶液中L-半胱氨酸濃度/時間曲線；B溶液中丙酮酸濃度/時間曲線。圖中符號“■”和“□”代表原始的TS1138菌體裂解液；“▲”和“△”代表經(jīng)過免疫磁性微球處理后的TS1138菌體裂解液。
具體實施方式實施例一發(fā)明人自行分離獲得一株惡臭假單胞菌TS1138菌株(Pseudomona sputida TS1138)，其細胞裂解液能夠催化底物DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸(DL-2-amino-△2-thiazoline-4-carboxylic acid，DL-ATC)合成L-半胱氨酸。
所述的惡臭假單胞菌TS1138(Pseudomonas putida TS1138)，已于2007年1月17日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”(北京市海淀區(qū)中關(guān)村北-條13號中國科學院微生物研究所內(nèi))，保藏號為CGMCC No.1920。
然而由于裂解液中同時存在L-半胱氨酸脫巰基酶，可將生成的L-半胱氨酸分解為丙酮酸、H2S和NH3，極大影響了目的產(chǎn)物L-半胱氨酸的積累。本專利利用L-半胱氨酸脫巰基酶抗體制備的免疫磁性微球，可以一步除去裂解液中的L-半胱氨酸脫巰基酶，采用處理后的裂解液再催化底物合成L-半胱氨酸，可大大提高其轉(zhuǎn)化率。
1.L-半胱氨酸脫巰基酶基因的克隆根據(jù)Pseudomonas putida KT2440的脫巰基酶基因(cd)序列，自行設(shè)計L-半胱氨酸脫巰基酶基因上游引物5’CCGGGA TCCATG AAG TTG CCG ATC TAC CTT G-3’和下游引物5’CCCAAG CTTTTA GTG GGC GGC CCA CTC-3’，以Pseudomonas putida TS1138基因組DNA為模板，PCR擴增獲得約1.2kb大小的脫巰基酶基因片段，測序后確定其開放閱讀框架長為1215bp，編碼404個氨基酸，申請并獲得Genbank序列號AY675347。
2.L-半胱氨酸脫巰基酶的重組表達和純化將L-半胱氨酸脫巰基酶基因亞克隆至表達載體pET-21a(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pETcd，經(jīng)過測序驗證后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，獲得包含重組質(zhì)粒pETcd的大腸桿菌BL21(DE3)重組菌株。將重組菌株接種于4mL含有氨芐青霉素100μg/mL的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12～16h后，以1％接種量轉(zhuǎn)接至50mL新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600達0.6-0.8時，采用終濃度為1mmol/L的IPTG于20℃誘導表達24小時，收集的菌體采用PBS緩沖液重懸，超聲波破碎處理5分鐘，使菌體充分裂解，利用Ni-NTA親和層析柱分離純化裂解液中包含的L-半胱氨酸脫巰基酶。經(jīng)SDS-PAGE、Western blot以及L-半胱氨酸脫巰基酶活性染色實驗均證明所純化的L-半胱氨酸脫巰基酶具有高純度和良好的酶學活性。(圖1A，B，C.泳道1，2)3.抗L-半胱氨酸脫巰基酶抗體的制備取0.4mg/mL的重組L-半胱氨酸脫巰基酶蛋白0.5mL，與等體積的弗氏完全佐劑充分混合乳化后得L-半胱氨酸脫巰基酶乳化抗原。取0.1mL乳化抗原分別對4只BALB/c小鼠(雌性，8周)進行腹腔注射。追加注射采用弗氏不完全佐劑乳化制備抗原，每隔兩周加強注射一次，共三次。最后一次免疫6天后，眼球采血，將全血靜置2小時，3000rpm離心20分鐘，收集血清于55℃水浴中滅活30分鐘，分裝后于-20℃冷凍保存。
4.纖維素免疫磁性微球的制備將按照中國專利ZL03144274.9所述方法活化后的纖維素磁性微球與ProteinA溶液于4℃反應(yīng)過夜，采用PBS緩沖液充分洗滌6～8次；將耦聯(lián)有Protein A的纖維素磁性微球置于NaHCO3-NaCO3緩沖液中，與上述抗血清進行吸附連接；經(jīng)PBS充分洗凈后，采用二甲基庚二酸酯(DMP)進行Protein A和IgG與纖維素磁性微球表面的交聯(lián)固定，最后加入TBS緩沖液終止反應(yīng)，充分洗凈后即得到可用于分離純化L-半胱氨酸脫巰基酶的免疫磁性微球，采用夾心法ELISA確定其抗體耦聯(lián)量為10mg/mL。
5.惡臭假單胞菌TS1138菌體裂解液的制備從平板上挑取一環(huán)惡臭假單胞菌TS1138接入4mL種子培養(yǎng)基中(葡萄糖20g，ATC3g，玉米漿5g，尿素3g，NaCl 1.5g，MnSO4·H2O 0.1g，K2HPO43g，MgSO4·7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，定容至1L，pH 7.5)，28℃ 120r/min培養(yǎng)16小時后，以1％接種量轉(zhuǎn)接到100mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基中(葡萄糖30g，ATC 4g，玉米漿1g，尿素3g，NaCl 1.5g，MnSO4·H2O 0.1g，K2HPO43g，MgSO4·7H2O 0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，定容至1L，pH 7.5)，28℃120r/min培養(yǎng)16小時后，離心，收集菌體，用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH8.0)洗滌菌體1至2次，再以緩沖液重懸菌體，超聲波破碎細胞后，離心，收集上清，即為菌體裂解液。
6.L-半胱氨酸脫巰基酶的免疫磁性分離純化取制備的纖維素免疫磁性微球1mL，置于磁性分離裝置的玻璃容器中；取20mL惡臭假單胞菌TS1138菌體裂解液(總蛋白含量為40mg)，加入到玻璃容器中，于4℃緩慢振蕩反應(yīng)3h。磁性分離微球，收集反應(yīng)液用于后續(xù)的合成L-半胱氨酸反應(yīng)。用PBS清洗微球6次，再加入4mL 0.1M甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH2.5)，于4℃振蕩反應(yīng)2小時，解離被微球上所吸附的L-半胱氨酸脫巰基酶。磁性分離微球，收集解離液，立即用少量1MPB緩沖液(pH7.0)中和，獲得純化的L-半胱氨酸脫巰基酶。免疫磁性微球經(jīng)PBS清洗后，于4℃保存，以備再次使用。SDS-PAGE、Western blot以及L-半胱氨酸脫巰基酶活性染色實驗均證明，所分離的L-半胱氨酸脫巰基酶具有很高的純度和良好的酶學活性，而經(jīng)過免疫磁性微球處理后的菌體裂解液不再含有L-半胱氨酸脫巰基酶活性。(圖1A，B，C.泳道3，4，5)7.L-半胱氨酸的轉(zhuǎn)化合成分別以原始菌體裂解液和經(jīng)過免疫磁性微球分離L-半胱氨酸脫巰基酶后的菌體裂解液20mL與40mL底物溶液(0.2％DL-ATC，1.5％K2HPO4，pH8.0)混合，并在37℃進行反應(yīng)，測定不同反應(yīng)時間內(nèi)其催化底物DL-ATC合成L-半胱氨酸的轉(zhuǎn)化率。
測得在反應(yīng)進行到10h時，經(jīng)過免疫磁性微球處理后的菌體裂解液可達到最高轉(zhuǎn)化率96.4％，并且在之后的14h均保持穩(wěn)定；而未經(jīng)處理的原始裂解液在反應(yīng)4h后達到其最高轉(zhuǎn)化率62.7％，由于存在L-半胱氨酸脫巰基酶的分解作用，轉(zhuǎn)化率在之后的反應(yīng)時間內(nèi)迅速下降。
8.免疫磁性微球的重復(fù)利用效果利用該免疫磁性微球，重復(fù)上述的分離純化L-半胱氨酸脫巰基酶以及轉(zhuǎn)化合成L-半胱氨酸過程5次。表1的數(shù)據(jù)表明每次反應(yīng)均可完全分離純化菌體裂解液中所含有的L-半胱氨酸脫巰基酶，經(jīng)過處理后的菌體裂解液催化底物DL-ATC合成L-半胱氨酸的平均轉(zhuǎn)化率達到96.2％，較之原始菌體裂解液有顯著的提高，顯示了該免疫磁性微球具有良好的重復(fù)利用性。
表1免疫磁性微球的重復(fù)利用效果
實施例二、1.L-半胱氨酸脫巰基酶基因的克隆、重組蛋白的表達純化，以及抗L-半胱氨酸脫巰基酶抗體的制備方法同實例一。
2.瓊脂糖免疫磁性微球的制備將按照中國專利ZL03144274.9所述方法活化后的瓊脂糖磁性微球與Protein A溶液于4℃反應(yīng)過夜，采用PBS緩沖液充分洗滌6～8次；將耦聯(lián)有Protein A的瓊脂糖磁性微球置于NaHCO3-NaCO3緩沖液中與L-半胱氨酸脫巰基酶多抗血清進行吸附連接；經(jīng)PBS充分洗凈后，采用戊二醛將Protein A和IgG交聯(lián)固定于瓊脂糖磁性微球表面，最后加入甘氨酸終止反應(yīng)，充分洗凈后即得到可用于固定化L-半胱氨酸脫巰基酶的免疫磁性微球，采用夾心法ELISA確定其抗體耦聯(lián)量為4mg/mL。
3.L-半胱氨酸脫巰基酶的固定化取所制備的免疫磁性微球1mL，與20mL惡臭假單胞菌TS1138菌體裂解液(總蛋白含量為40mg)，于4℃緩慢振蕩反應(yīng)3h；磁性分離，棄去反應(yīng)液，經(jīng)PBS充分洗凈后，即得到固定有L-半胱氨酸脫巰基酶的免疫磁性微球，于4℃保存。
4.微球固定化的L-半胱氨酸脫巰基酶的活性考察配置5份4mL的0.05％L-半胱氨酸溶液，取1mL固定化有L-半胱氨酸脫巰基酶的免疫磁性微球，于37℃條件下依次與各份L-半胱氨酸溶液反應(yīng)各2h，檢測反應(yīng)后溶液中包含分解產(chǎn)物丙酮酸的含量，以每分鐘生成1μmol產(chǎn)物丙酮酸所需的酶量作為一個L-半胱氨酸脫巰基酶活力單位(U)。
表2結(jié)果顯示固定化有L-半胱氨酸脫巰基酶的微球在5次反應(yīng)中均能保持較為穩(wěn)定的活性，顯示了該免疫磁性微球?qū)-半胱氨酸脫巰基酶具有較好的固定化效果。
表2.微球固定化的L-半胱氨酸脫巰基酶的活性考察
權(quán)利要求
1.一種分離純化和固定化目的酶的免疫磁性微球的制備方法，其特征在于將活化后的磁性微球與金黃色葡萄球菌蛋白A溶液反應(yīng)，采用PBS緩沖液充分洗滌；再將耦聯(lián)有金黃色葡萄球菌蛋白A的磁性微球與抗目的酶的IgG抗體的多抗血清或者單抗腹水進行吸附連接；經(jīng)PBS充分洗凈后，采用戊二醛或二甲基庚二酸酯將金黃色葡萄球菌蛋白A和IgG交聯(lián)固定在磁性微球表面，最后加入TBS緩沖液終止反應(yīng)，充分洗凈后即得到可用于目的酶的分離純化和固定化的磁性微球，其酶的耦聯(lián)量為1～10mg/mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所采用的磁性微球是含有羥基活性基團的磁性微球，即瓊脂糖磁性微球、纖維素磁性微球或聚乙烯醇磁性微球。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的目的酶為L-半胱氨酸脫巰基酶，抗目的酶的IgG抗體是抗L-半胱氨酸脫巰基酶抗體。
4.一種權(quán)利要求1所述的方法制備的免疫磁性微球的應(yīng)用，其特征在于將免疫磁性微球用于從復(fù)雜的細胞裂解液中一步分離純化目的酶；其分離純化過程是將耦聯(lián)有抗目的酶抗體的免疫磁性微球，與細胞裂解液于2～8℃振蕩反應(yīng)2～12小時；然后將其置于磁珠收集器上用于吸附固定磁性微球，除去反應(yīng)液，經(jīng)PBS充分洗凈后，采用pH1.5～3.5的甘氨酸-鹽酸緩沖液于2～8℃振蕩解離吸附的目的酶；磁性分離微球，收集解離液，立即用pH6.5～10.0的PB緩沖液中和，可得到純化的目的酶；該微球用PBS洗凈后，于2～8℃保存可重復(fù)使用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的免疫磁性微球是固定有權(quán)利要求3所述的抗L-半胱氨酸脫巰基酶抗體的免疫磁性微球，并用于L-半胱氨酸的合成，具體過程如下將上述免疫磁性微球加入到惡臭假單胞菌TS1138菌體裂解液中，分離吸附L-半胱氨酸脫巰基酶，然后收集免疫磁性微球，除去脫巰基酶的反應(yīng)液可用于后續(xù)的微生物酶法轉(zhuǎn)化L-半胱氨酸，提高合成L-半胱氨酸的轉(zhuǎn)化率。
6.一種權(quán)利要求1所述的方法制備的免疫磁性微球的應(yīng)用，其特征在于將免疫磁性微球用于目的酶的固定化，其過程是將耦聯(lián)有抗目的酶抗體的免疫磁性微球，與細胞裂解液混合，于2～8℃振蕩反應(yīng)2～12小時；然后將其置于磁珠收集器上用于吸附固定磁性微球，除去反應(yīng)液，經(jīng)PBS充分洗凈后，固定有目的酶的免疫磁性微球即可用于對特定底物進行連續(xù)催化反應(yīng)。
全文摘要
一種分離和固定化酶的免疫磁性微球的制備方法及其應(yīng)用。涉及利用免疫磁性微球進行酶的分離純化和固定化的方法。本發(fā)明采用生物特異性耦聯(lián)的方法，將單克隆或多克隆抗體固定于磁性微球載體上，得到可用于分離純化和固定化酶的免疫磁性微球；該免疫磁性微球可應(yīng)用于發(fā)酵液、細胞裂解液中目的酶的一步分離純化，以及采用固定化的酶對其底物進行連續(xù)的催化反應(yīng)。與傳統(tǒng)的酶的分離純化和固定化方法相比較，本方法具有新穎、簡便、快捷等優(yōu)點。
文檔編號C12N9/00GK101092614SQ20071005743
公開日2007年12月26日 申請日期2007年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月23日
發(fā)明者白鋼, 余養(yǎng)盛, 劉春琴, 曹宇, 楊文博 申請人:南開大學