專(zhuān)利名稱(chēng)：離體培養(yǎng)條件下麻風(fēng)樹(shù)多倍體誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種離體培養(yǎng)條件下麻風(fēng)樹(shù)多倍 體誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
自然界的植物多數(shù)是二倍體(2n=2x)，即其體細(xì)胞(2n)核中包含2個(gè)相同 的染色體組(x)。但有些物種經(jīng)過(guò)染色體的自然或人工加倍，可形成含有多個(gè) 染色體組的新物種，我們稱(chēng)之為多倍體。常見(jiàn)的多倍體有三、四、五、六和 八倍體等，2n分別等于3x、 4x、 5x、 6x和8x。多倍體現(xiàn)象表現(xiàn)為遺傳學(xué)上近 緣的生物染色體數(shù)目彼此成倍數(shù)變化關(guān)系，這是高等生物中最普遍的特點(diǎn)之 一。多倍體在自然界中分布比較廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，在植物界里約有l(wèi)/2的物種 是多倍體，而禾本科中多倍體幾乎占3/4，花卉中多倍體占2/3以上，它們 在植物進(jìn)化中起了重要的作用。由于許多重要花卉植物均是多倍體，因而， 育種學(xué)家自20世紀(jì)30年代開(kāi)始就熱衷于花卉多倍體誘導(dǎo)育種的研究。自然界 的多倍體在無(wú)性和有性階段均可產(chǎn)生，無(wú)性階段是體細(xì)胞分裂過(guò)程中偶然發(fā) 生染色體加倍而造成，有性階段則是由于小孢子母細(xì)胞或大孢子母細(xì)在減數(shù) 分裂過(guò)程中不減數(shù)產(chǎn)生了2n配子。因此，人為地誘導(dǎo)體細(xì)胞不分裂和性細(xì)胞 不減數(shù)是產(chǎn)生多倍體的有效途徑。隨著對(duì)多倍體產(chǎn)生途徑、特征、特性及鑒 定方法等方面更為深入的研究，使多倍體誘導(dǎo)育種在育種領(lǐng)域顯示出日益廣 闊的應(yīng)用和發(fā)展前景。
秋水仙素誘導(dǎo)花卉多倍體是應(yīng)用最多的方法之一。用秋水仙素誘導(dǎo)花卉 多倍體的方法有如下幾種①浸種法將種子處理數(shù)小時(shí)至3 d，處理濃度O. 2 % 1. 6%。②浸芽法此法簡(jiǎn)便，根系不受藥液傷害，能正常出土成苗生 長(zhǎng)，誘導(dǎo)效果好。如曼陀羅(Datura stramonium L.)、波斯菊(Cosmos bipinnatus Cav.)等均獲得較好的結(jié)果。百合(Lilium L.)因用鱗片繁殖， 可將鱗片浸于O. 05% 0. 1%的秋水仙素水溶液中，經(jīng)1 3 h后扦插，可 得四倍體球芽。③滴苗法用滴管將秋水仙素溶液滴在幼苗頂芽處，也可用 脫脂棉球包裹幼芽，或放在子葉之間再滴秋水仙素溶液，使棉花浸濕。此法 比較煩瑣，但誘導(dǎo)效果顯著，容易出現(xiàn)嵌合體。④涂抹法將一定濃度的秋 水仙素和一定濃度的羊毛脂膏或者瓊脂混合，涂抹到植株的生長(zhǎng)點(diǎn)，連續(xù)處 理3 d，然后用蒸餾水將莖尖沖洗干凈。但是此法誘變率較低，容易出現(xiàn)嵌合 體，經(jīng)過(guò)處理的植株死亡率高。選用哪種方法要依品種、處理季節(jié)和當(dāng)時(shí)的 氣候條件而定。牛維和等對(duì)君子蘭(Clivia Lindl.)種子進(jìn)行誘變處理，用 濃度O. 25X的秋水仙素處理36h，所得到的多倍體誘變率為40%。 1934年， 美國(guó)Blakeslee與Avery用秋水仙素處理曼陀羅的種子， 一舉獲得了85%的多 倍體植物。Chen等采用剝?nèi)ドL(zhǎng)點(diǎn)外幼葉后用秋水仙素溶液滴苗或涂抹取得 了明顯的效果，剝滴處理誘導(dǎo)變異頻率提高到52. 6%，處理效果提高到30. 4 %;剝涂處理變異率提高到60%，處理效果提高到29. 4%。由于植株整體水 平誘導(dǎo)方法簡(jiǎn)便易于掌握，目前花卉的多倍體誘導(dǎo)主要采用此法，但其誘導(dǎo) 頻率低，有時(shí)部分植株為嵌合體。
隨著生物科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，通過(guò)離體培養(yǎng)誘導(dǎo)多倍體的方法也得到 較多應(yīng)用，如①胚乳培養(yǎng)通過(guò)胚乳培養(yǎng)通?？梢缘玫饺扼w植株。我國(guó)已 通過(guò)培養(yǎng)北橘柚胚乳獲得三倍體植株。美國(guó)佛州大學(xué)也通過(guò)培養(yǎng)菠蘿橙的胚 乳獲得了三倍體植株。②組織培養(yǎng)結(jié)合化學(xué)誘變把秋水仙素加進(jìn)組織培養(yǎng) 基中，可以提高誘變多倍體的效率。③細(xì)胞雜交在培養(yǎng)單倍體的花粉細(xì)胞和 二倍體的葉肉細(xì)胞或胚軸體細(xì)胞的原生質(zhì)基礎(chǔ)上，再誘導(dǎo)這兩類(lèi)原生質(zhì)體融 合，然后培養(yǎng)雜種細(xì)胞，就可以獲得三倍體。這種試驗(yàn)已在柑橘上獲得成功。 ④利用誘導(dǎo)愈傷組織獲得多倍體植物組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)工作的廣泛開(kāi)展， 導(dǎo)致了各種愈傷組織的產(chǎn)生。研究證明，這些愈傷組織中常常包含了不同倍 數(shù)的多倍體及異倍體的細(xì)胞，若將其加以鑒定和分離培養(yǎng)，也是獲得多倍體 的有效途徑。愈傷組織產(chǎn)生多倍體是因?yàn)樵谟鷤?xì)胞分裂過(guò)程中，由于核內(nèi) 有絲分裂或分裂期間超數(shù)染色體增殖所致。王鴻鶴等(1998)以重瓣大巖桐 (Sinningia speciosa)葉片為外植體，經(jīng)秋水仙素處理得到大量的多倍體植 株。雷家軍(1999)采用組織培養(yǎng)并結(jié)合秋水仙素誘導(dǎo)多倍體的方法，成功地 獲得珍貴野生資源五葉草莓(Fragariapentaphyua A. Los.)的加倍植株。王 利等(2001)在組織培養(yǎng)條件下，對(duì)庫(kù)拉索蘆薈(A/oe m L.)用秋水仙素進(jìn)行 染色體加倍的誘導(dǎo)處理，誘變率達(dá)50%。得到了葉片變厚、葉色變深、葉片 變大的四倍體植株。張興翠等(2000)報(bào)道了互葉白干層(Melaleuca leucadendra L.)快速繁殖方法及運(yùn)用秋水仙素誘導(dǎo)處理培養(yǎng)多倍體的幾種 途徑。研究結(jié)果表明，以白干層幼嫩莖和葉作外植體，利用秋水仙素作誘導(dǎo) 劑，可成功地誘導(dǎo)多倍體植株。但目前還沒(méi)有關(guān)于可再生能源——麻風(fēng)樹(shù)的 多倍體育種方式的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供在培養(yǎng)基中加秋水仙素誘導(dǎo)法在離體組織上誘導(dǎo)細(xì) 胞內(nèi)染色體加倍的一種離體培養(yǎng)條件下麻風(fēng)樹(shù)多倍體誘導(dǎo)方法。 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的
一種離體培養(yǎng)條件下麻風(fēng)樹(shù)多倍體誘導(dǎo)方法，其特征在于其誘導(dǎo)方法
(1) .將麻風(fēng)樹(shù)種子經(jīng)消毒、漂洗、剝皮后接種在l/2MS+10g/L蔗糖的培
養(yǎng)基上，培養(yǎng)麻風(fēng)樹(shù)無(wú)菌苗5-7d;
(2) .取上述麻風(fēng)樹(shù)無(wú)菌苗的葉片及葉柄剪成l-2cm的小段作為外植體，分 別置于秋水仙素含量為O. 05-0. 2%的分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為24 ±2°C，光強(qiáng)為1600 20001x，光照15-17h/d，培養(yǎng)2-7d以誘導(dǎo)多倍體的發(fā)生；
(S).將上述麻風(fēng)樹(shù)外植體從含有秋水仙素的分化培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到單純的 分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)多倍體的再生芽；
(4) .將培養(yǎng)出的麻風(fēng)樹(shù)外植體再生芽切下，轉(zhuǎn)移到伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行繼續(xù) 培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為24士2-C，光強(qiáng)為1600 20001x，光照15-17h/d，保留穩(wěn)定 的變異株；
(5) .將穩(wěn)定的變異株接種至1/2 MS+0. 3 mg/L NAA+0. 05%活性炭上 誘導(dǎo)生根，植于基質(zhì)上煉苗，成活后即可移栽到大田。
而且，所述的麻風(fēng)樹(shù)種子的消毒、漂洗的條件為75X酒精消毒30s，再 經(jīng)O. 1^HgCl2消毒6Min，無(wú)菌水漂洗4次。
而且，所述的分化培養(yǎng)基的構(gòu)成為MS+2. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA， 培養(yǎng)基中附加蔗糖30g/kg,瓊脂粉6g/kg。
而且，所述的煉苗基質(zhì)為葉土與菜園土，其中重量配比葉土菜園土=1 :1。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果是
采用秋水仙素在離體條件下誘導(dǎo)染色體加倍有三個(gè)優(yōu)點(diǎn) 一是容易控制 實(shí)驗(yàn)條件和重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果；二是能提高工作效率，即在離體狀態(tài)下可同時(shí)處 理大批組織細(xì)胞，從而得到大批染色體加倍的植株；三是可以減少或避免異 倍性細(xì)胞嵌合體，即組織培養(yǎng)技術(shù)可通過(guò)懸浮培養(yǎng)等手段使培養(yǎng)的細(xì)胞高度 分散，直至變成單個(gè)細(xì)胞群，并可克服嵌合體現(xiàn)象。
本發(fā)明對(duì)于提高麻風(fēng)樹(shù)抗逆性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，對(duì)麻風(fēng)樹(shù)的可再生 能源開(kāi)發(fā)具有促進(jìn)作用。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步詳述。需要說(shuō)明的是下述實(shí)施例是說(shuō)明 性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
秋水仙素誘導(dǎo)法在離體培養(yǎng)條件下麻風(fēng)樹(shù)多倍體誘導(dǎo)方法步驟如下
1. 麻風(fēng)樹(shù)種子經(jīng)75X酒精消毒30s，再經(jīng)O. 1XHgCl2消毒6Min，無(wú)菌水 漂洗4次，在超凈臺(tái)中用鑷子將外種皮剝離掉，將種子接種在l/2MS+10g/L蔗 糖的培養(yǎng)基上，待發(fā)芽后備用。
2. 取培養(yǎng)5-7d的麻風(fēng)樹(shù)無(wú)菌苗的葉片及葉柄，在超凈臺(tái)中用剪刀剪成2cm
的小段作為外植體，分別置于不同秋水仙素配比(0. 05-0. 2%)的分化培養(yǎng) 基(MS+2. 0 mg/L6-BA+0. lmg/LNAA，培養(yǎng)基中附加蔗糖30g/kg,瓊脂粉 6g/kg)中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為24士2。C，光強(qiáng)為1600 20001x，光照為 16h/d，以誘導(dǎo)多倍體的發(fā)生。
3. 將培養(yǎng)2-7d的麻風(fēng)樹(shù)外植體從含有秋水仙素的分化培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到?jīng)] 有秋水仙素的同樣的分化培養(yǎng)基上(MS+2. 0mg/L6-BA+0. lmg/LNAA，培 養(yǎng)基中附加蔗糖30g/kg，瓊脂粉6g/kg)，培養(yǎng)多倍體的再生芽。
4. 將從秋水仙素處理的麻風(fēng)樹(shù)外植體再生芽切下，轉(zhuǎn)移到伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上 (MS+1. 0 mg / L6-BA+0. 5 mg / L IAA，培養(yǎng)基中附加蔗糖30g/kg，瓊脂粉6g/kg) 進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為24士2-C，光強(qiáng)為1600 20001x，光照為16h/d;期 間將沒(méi)有變異的再生苗遺棄，保留穩(wěn)定的變異株。
5. 將穩(wěn)定的變異株接種至1/2 MS+0. 3 mg/L NAA+0. 05%活性炭上 誘導(dǎo)生根。植于葉土菜園土=1 : l的基質(zhì)上煉苗，成活后即可移栽到大田。
權(quán)利要求
1.一種離體培養(yǎng)條件下麻風(fēng)樹(shù)多倍體誘導(dǎo)方法，其特征在于其誘導(dǎo)方法的步驟是(1).將麻風(fēng)樹(shù)種子經(jīng)消毒、漂洗、剝皮后接種在1/2MS+10g/L蔗糖的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)麻風(fēng)樹(shù)無(wú)菌苗5-7d；(2).取上述麻風(fēng)樹(shù)無(wú)菌苗的葉片及葉柄剪成1-2cm的小段作為外植體，分別置于秋水仙素含量為0.05-0.2％的分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為24±2℃，光強(qiáng)為1600～2000lx，光照15-17h/d，培養(yǎng)2-7d以誘導(dǎo)多倍體的發(fā)生；(3).將上述麻風(fēng)樹(shù)外植體從含有秋水仙素的分化培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到單純的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)多倍體的再生芽；(4).將培養(yǎng)出的麻風(fēng)樹(shù)外植體再生芽切下，轉(zhuǎn)移到伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為24±2℃，光強(qiáng)為1600～2000lx，光照15-17h/d，保留穩(wěn)定的變異株；(5).將穩(wěn)定的變異株接種至1/2MS+0.3mg/L NAA+0.05％活性炭上誘導(dǎo)生根，植于基質(zhì)上煉苗，成活后即可移栽到大田。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的離體培養(yǎng)條件下麻風(fēng)樹(shù)多倍體誘導(dǎo)方法，其特 征在于所述的麻風(fēng)樹(shù)種子的消毒、漂洗的條件為75%酒精消毒303，再經(jīng) 0. 1XHgCl2消毒6Min，無(wú)菌水漂洗4次。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的離體培養(yǎng)條件下麻風(fēng)樹(shù)多倍體誘導(dǎo)方法，其特 征在于所述的分化培養(yǎng)基的構(gòu)成為MS+2. 0mg/L6-BA+0. 1 mg / L NAA， 培養(yǎng)基中附加蔗糖30g/kg，瓊脂粉6g/kg。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的離體培養(yǎng)條件下麻風(fēng)樹(shù)多倍體誘導(dǎo)方法，其特征 在于所述的煉苗基質(zhì)為葉土與菜園土，其中重量配比葉土菜園土=1 : 1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種離體培養(yǎng)條件下麻風(fēng)樹(shù)多倍體誘導(dǎo)方法，該步驟包括培養(yǎng)麻風(fēng)樹(shù)無(wú)菌苗、誘導(dǎo)多倍體、培養(yǎng)多倍體的再生芽、保留穩(wěn)定的變異株并將該變異株在含活性炭的生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，植于基質(zhì)上煉苗，成活后即可移栽到大田。本發(fā)明采用秋水仙素在離體條件下誘導(dǎo)染色體加倍，容易控制實(shí)驗(yàn)條件和重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提高工作效率，并可得到大批染色體加倍的植株并減少或避免異倍性細(xì)胞嵌合體，對(duì)于提高麻風(fēng)樹(shù)抗逆性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，對(duì)麻風(fēng)樹(shù)的可再生能源開(kāi)發(fā)具有促進(jìn)作用。
文檔編號(hào)C12N5/04GK101112172SQ20071005771
公開(kāi)日2008年1月30日 申請(qǐng)日期2007年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月22日
發(fā)明者劉艷軍, 張偉玉, 楊恩芹, 楊靜慧 申請(qǐng)人:天津農(nóng)學(xué)院