專利名稱：觀賞竹芋組織培養(yǎng)無菌體系獲得的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域中的植物組織培養(yǎng)技術(shù)；特別涉及一種觀賞竹 芋組織培養(yǎng)無菌體系獲得的新方法。
背景技術(shù)：
植物組培苗的工廠化生產(chǎn)在我國發(fā)展速度很快，組織培養(yǎng)技術(shù)日趨完 善，在市場競爭中，如何降低成本是提高經(jīng)濟(jì)效益的首要問題，組織培養(yǎng)中 污染率的增加勢必導(dǎo)致組培苗成本的提高，經(jīng)濟(jì)損失很大；因此，組織培養(yǎng) 中降低污染率是工廠化生產(chǎn)中不可忽視的技術(shù)環(huán)節(jié)。
植物組織培養(yǎng)過程中造成污染的原因是多方面的，如外植體的消毒不 徹底或由內(nèi)源菌引起的污染；操作污染和環(huán)境污染；繼代培養(yǎng)中污染，除了 操作不慎帶菌外，繼代材料在培養(yǎng)室也可能被螨傳播的真菌污染。
我們在試驗(yàn)研究時發(fā)現(xiàn)，竹芋屬植物組培時，其外植體(頂芽或側(cè)芽) 的消毒很難，很多人因消毒不過關(guān)而前功盡棄，這是觀賞竹芋組培生產(chǎn)中必 須首先解決的關(guān)鍵技術(shù)問題；要使觀賞竹芋組培快繁從實(shí)驗(yàn)室走向產(chǎn)業(yè)化， 形成商品化，讓更多的植物組培苗走向市場，因此必須研究出一種有效、實(shí) 用、快捷的外植體消毒方法。
竹芋的芽全部位于栽培基質(zhì)內(nèi)，且地下部分有較發(fā)達(dá)的通氣組織；在我 們所進(jìn)行的大量試驗(yàn)中，通過各種方法甚至有些還是特別苛刻的消毒條件， 但由于竹芋組織內(nèi)部可能有寄生或或共生菌，多數(shù)竹芋組織材料均不能徹底 滅菌，致使竹芋組織材料的無菌外植體獲得率常常低于5%。
竹芋組織材料無菌外植體獲得較難，材料帶菌或因滅菌消毒時間太久引 起褐變，均會影響外植體的分化；外植體的選擇與滅菌是植物組培快繁中的 重要環(huán)節(jié)，它由原培養(yǎng)材料、滅菌劑、滅菌方法等因素決定，尋找快速、高 效的滅菌方法，減少污染瓶的丟棄，對于減少母本植株應(yīng)用數(shù)量、降低種苗 生產(chǎn)成本具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種觀賞竹芋組織培養(yǎng)無菌體系獲 得的新方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是
觀賞竹芋組織培養(yǎng)無菌體系獲得的新方法是利用組織培養(yǎng)母本植株二 次過渡栽培和外植體綜合滅菌及在培養(yǎng)基中添加消毒殺菌劑共培養(yǎng)的改良 方法，其特征在于
1) 植物組織培養(yǎng)是在無菌條件下實(shí)施；其過程包括-
2) 母本植株進(jìn)行二次過渡栽培，即在珍珠巖或陶粒中栽培2 3周后；再移 至水中進(jìn)行水培，誘導(dǎo)含有較少內(nèi)生菌的新芽后，取其新芽作為外植體進(jìn)行 組織培養(yǎng)；
3) 對材料進(jìn)行初步消毒和低溫預(yù)處理；
4)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加2種不同用量的消毒殺菌劑，制備出能抑菌的誘導(dǎo) i昔養(yǎng)基；
5)采用綜合方法對外植體進(jìn)行表面消毒。
本發(fā)明解決了觀賞竹芋組織培養(yǎng)中無菌體系難以獲得的難題，從而形成 了一種簡單、易行且在無菌條件下的植物組織培養(yǎng)方法；
我們解決了觀賞竹芋組織培養(yǎng)中無菌體系難以獲得的難題，從而形成了 一種簡單、易行且在無菌條件下的植物組織培養(yǎng)方法，該方法獨(dú)特且簡單實(shí) 惠，應(yīng)用價值高。
針對觀賞竹芋組織培養(yǎng)傳統(tǒng)技術(shù)難以獲得無菌體系的問題，發(fā)明人進(jìn)行 了大量的研究工作，最終獲得了利用組織培養(yǎng)母本植株二次過渡栽培和外植 體綜合滅菌及在培養(yǎng)基中添加消毒殺菌劑共培養(yǎng)的改良方法，從而在觀賞竹 芋組織培養(yǎng)時短時間內(nèi)大量獲得無菌體系，建立試管苗的無菌繁殖體系,進(jìn) 而為叢生芽的誘導(dǎo)與繼代增殖培養(yǎng)和試管苗的批量化生產(chǎn)提供了物質(zhì)基礎(chǔ) 和技術(shù)保障。
本發(fā)明旨在提供一種科學(xué)有效的觀賞竹芋組織培養(yǎng)無菌體系獲得的新 法；通過該方法在短時間內(nèi)大量獲得無菌體系，為叢生芽的誘導(dǎo)與繼代增殖 培養(yǎng)提供了大量無菌系。
本發(fā)明之目的通過如下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)-
1)引進(jìn)盆栽的觀賞竹芋種苗，剪去部分老根和老葉，洗凈栽培基質(zhì)， 在500 800倍多菌靈溶液中浸泡20min，稍晾干后栽培于已洗凈的大粒珍 珠巖的竹筐中，用噴壺澆足水分，每天保濕，室溫保持在25 3(TC;每隔4
5天噴灑1次500 800倍多菌靈溶液；
2) 無土栽培2 3周后，取出植株，洗凈栽培基質(zhì)，并剪去部分老根和 老葉，用塑料定植籃固定植株，再移至水中進(jìn)行水培，玻璃瓶中水位不能太 高，只需淹沒根系長的1/3即可，水中加入5 10ml專用水培營養(yǎng)液，將培 養(yǎng)材料置于滿足植物生長的溫度、光照條件的房間或設(shè)施(如溫室)內(nèi)進(jìn)行 培養(yǎng)；每隔4 5天噴灑1次500 800倍多菌靈溶液；3 4周后，在莖節(jié) 植株處能形成4-6厘米的新芽，以此新芽作為初步滅菌的外植體；
3) 先對材料進(jìn)行預(yù)處理從水培容器中取生長旺盛的竹芋植株，除去 根與葉，用自來水沖洗干凈后，用0.1X的高錳酸鉀溶液浸泡5min，取出毛 巾將根狀莖抹干，再放入0.1X的多菌靈溶液浸泡5min;把帶芽莖段置于冰 箱ld (4°C 5°C)后，并用10mg/L培福朗溶液預(yù)處理16 24h備用；
4) 室內(nèi)配制含有消毒殺菌劑的抑菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基這些消毒殺菌劑包括 SDAs (—種廣譜生物殺菌劑，性質(zhì)穩(wěn)定，耐高壓滅菌，能與其它抗生素配合 使用)(添加量為0. 2 0. 3%) 、 0. 3°/0 0. 5%的丙酸鈉、0. 3% 0. 5%的苯甲 酸鈉(苯甲酸鈉、丙酸鈉等常用作食品中的防腐劑，能耐高溫高壓，使用比 較方便)、0.5% 1.0%多菌靈(多菌靈不耐高溫，需要采用過濾滅菌)；這些 消毒殺菌劑可以單用，也可合用；并將培養(yǎng)基的PH值由5.8調(diào)至4.3 4.5;
5) 外植體誘導(dǎo)材料的表面消毒外植體消毒用70% 75%的乙醇溶液 0.5 1.0 min， 3. 0 5. 0%的次氯酸鈉和0. 1%的升汞1: 1混合溶液浸泡 12 14min，混合溶液中加2滴吐溫-80，通過磁棒攪動或不斷震蕩搖動，無 菌水沖洗5 6次，可減少對材料的殺傷作用；用解剖刀剝除芽鱗片，每剝 一層鱗片，用0.1X升汞浸泡1.0min,，無菌水沖洗三次，直至剝至露出生 長點(diǎn)為止；將已消毒的生長點(diǎn)放入含0. 2 0. 3%殺菌劑SDAsl/4MS無機(jī)鹽中 浸泡10 16rain后接種；
6) 接種后日常管理將培養(yǎng)材料置于滿足植物組織培養(yǎng)的溫度(25土 1 °C)、光照條件(2000 25001ux) (16h/d光照)的房間或設(shè)施(如溫室)內(nèi)進(jìn) 行培養(yǎng)；
7) 改善環(huán)境條件接種室與培養(yǎng)室要定期做好消毒與凈化，接種前工 作臺或接種箱要開紫外燈30min以上；培養(yǎng)室的相對濕度應(yīng)控制在70%左 右，相對濕度太高時可以用抽濕機(jī)抽濕；
8) 接種人員應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，對接種中所需的工具，必須經(jīng)嚴(yán)格 滅菌后才能使用；在超凈工作臺的操作區(qū)內(nèi)，不要放入過多的待用材料，避免氣流被擋??；還要定期檢査超凈工作臺的工作質(zhì)量；
9) 嚴(yán)査接種材料，淘汰被真菌與細(xì)菌污染的接種材料；
10) 經(jīng)常檢查消毒鍋的滅菌質(zhì)量，若發(fā)現(xiàn)問題要立即檢修；
11) 檢查培養(yǎng)容器是否存在問題；培養(yǎng)容器封口多用塑料蓋、膠塞、棉 塞、薄膜等，塑料蓋用久了易老化，密封性差，也會造成污染。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)
1. 該技術(shù)具有獨(dú)特且簡單實(shí)惠、應(yīng)用價值高等優(yōu)點(diǎn)；將其應(yīng)用到觀賞竹 芋組織培養(yǎng)時能在較短的時間內(nèi)大量獲得無菌體系，節(jié)約時間和人力和經(jīng) 費(fèi)，具有很好的實(shí)際應(yīng)用效果。
2. 本方法利用組織培養(yǎng)母本植株二次過渡栽培和外植體綜合滅菌及在 培養(yǎng)基中添加消毒殺菌劑共培養(yǎng)的改良方法；與國內(nèi)目前大多數(shù)人所采用的 傳統(tǒng)常規(guī)外植體滅菌方法相比，可以較好地解決了觀賞竹芋組織培養(yǎng)中無菌 體系難以獲得的難題，使無菌外植體的獲得率達(dá)到65 70%，大大高于傳統(tǒng) 常規(guī)外植體滅菌法(5%以下)。


圖1是觀賞竹芋組織培養(yǎng)無菌體系獲得的新方法技術(shù)路線圖
具體實(shí)施例方式
觀賞竹芋組織培養(yǎng)無菌體系獲得的新方法是利用組織培養(yǎng)母本植株二 次過渡栽培和外植體綜合滅菌及在培養(yǎng)基中添加消毒殺菌劑共培養(yǎng)的改良 方法，其特征在于-
植物組織培養(yǎng)是在無菌條件下實(shí)施；其過程包括母本植株進(jìn)行二次的 過渡栽培，即在珍珠巖或陶粒中栽培2 3周后，再移至水中進(jìn)行水培，誘 導(dǎo)出新芽后，取其新芽進(jìn)行組織培養(yǎng)；采取外植體綜合滅菌；在培養(yǎng)基中添 加消毒殺菌劑，制備抑菌培養(yǎng)基；接種后；將培養(yǎng)材料置于滿足植物組織培 養(yǎng)的溫度、光照條件的房間或設(shè)施內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；本發(fā)明解決了觀賞竹芋組織 培養(yǎng)中無菌體系難以獲得的難題，從而形成了一種簡單、易行且在無菌條件 下的植物組織培養(yǎng)方法；
下面通過具體實(shí)施例，進(jìn)一步詳細(xì)介紹本發(fā)明； 實(shí)施例1
1)從市場購入盆栽觀賞竹芋"浪星"(紫背竹芋)種苗，洗凈基質(zhì)，剪
去部分老根和老葉，在500倍多菌靈溶液中浸泡20min后栽于已洗凈的珍珠 巖中，用噴壺澆足水分，每天保濕，室溫保持在25 28'C;每隔5天噴灑 800倍多菌靈溶液1次；
2) 3周后，挖出植株，洗凈珍珠巖，再次剪去部分老根和老葉，移至 水中進(jìn)行水培，玻璃瓶中水位只需淹沒根系長的1/3即可，水中加入10ml 專用水培營養(yǎng)液，將水培材料置于滿足植物生長的溫度、光照條件的房間或 設(shè)施(如溫室)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)；每隔5天噴灑800倍多菌靈溶液1次；3 4 周后，在莖節(jié)植株處形成4-6厘米的新芽；
3) 從水培容器中生長旺盛的"浪星"(紫背竹芋)植株上，用小刀切取 4-6厘米長的新芽，沖洗干凈后，用0.1X的高錳酸鉀溶液浸泡5min,再放 入0.r^的多菌靈溶液浸泡5min;置于冰箱Id (5°C)后備用；
4) 配制抑菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基在MS基本培養(yǎng)基中添加SDAs0.20/。 、 0. 3%的 丙酸鈉，并加入誘導(dǎo)芽所需的細(xì)胞分裂素和生長素，將培養(yǎng)基的PH值由5.8 調(diào)至4. 3 4. 5;
5) 外植體表面消毒外植體先用75。/。的乙醇溶液1.0min，無菌水沖洗 4次；3%的次氯酸鈉和0. 1°/。的升汞1: 1混合溶液(加吐溫-80 2滴)浸泡 14min，不斷震蕩搖動，無菌水沖洗5次；用解剖刀剝除芽鱗片，每剝一層 鱗片，用0.1X升汞浸泡1.0min，，無菌水沖洗3次，直至剝至露出生長點(diǎn) 為止；將已消毒的生長點(diǎn)放入含0. 2 0. 3%殺菌劑SDAsl/4MS無機(jī)鹽中浸泡 10min后接種；
6) 接種后日常管理將培養(yǎng)材料置于滿足植物組織培養(yǎng)的溫度(25士1 °C)、光照條件(2000 25001ux) (16h/d光照)的房間或設(shè)施(如溫室)內(nèi)進(jìn) 行培養(yǎng)；30 35天左右開始萌發(fā)出新的叢生芽，以后視生長情況可轉(zhuǎn)入繼 代增殖培養(yǎng)；
7) 日常管理與其他組培要求一致。
權(quán)利要求
1、一種觀賞竹芋組織培養(yǎng)無菌體系獲得的新方法，其特征在于利用組織培養(yǎng)母本植株的二次過渡栽培和外植體綜合滅菌及在培養(yǎng)基中添加消毒殺菌劑共培養(yǎng)以獲得無菌體系的改良方法1)植物組織培養(yǎng)是在無菌條件下實(shí)施；其過程包括2)母本植株進(jìn)行二次過渡栽培，即在珍珠巖或陶粒中栽培2～3周后；再移至水中進(jìn)行水培，誘導(dǎo)含有較少內(nèi)生菌的新芽后，取其新芽作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)；3)對材料進(jìn)行初步消毒和低溫預(yù)處理；4)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加2種不同用量的消毒殺菌劑，制備出能抑菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)基；5)采用綜合方法對外植體進(jìn)行表面消毒。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的觀賞竹芋組織培養(yǎng)無菌體系獲得的新方法，其特征 在于1) 引進(jìn)盆栽的觀賞竹芋種苗，剪去部分老根和老葉，洗凈栽培基質(zhì)，在 500 800倍多菌靈溶液中浸泡20min，稍晾干后栽培于已洗凈的大粒珍珠巖 的竹筐中，用噴壺澆足水分，每天保濕，室溫保持在25 30。C;每隔4 5天 噴灑1次500 800倍多菌靈溶液；2) 無土栽培2 3周后，取出植株，洗凈栽培基質(zhì)，并剪去部分老根和 老葉，用塑料定植籃固定植株，再移至水中進(jìn)行水培，玻璃瓶中水位不能太 高，只需淹沒根系長的1/3即可，水中加入5 10ml專用水培營養(yǎng)液，將培 養(yǎng)材料置于滿足植物生長的溫度、光照條件的房間或設(shè)施，溫室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng); 每隔4 5天噴灑1次500 800倍多菌靈溶液；3 4周后，在莖節(jié)植株處能 形成4-6厘米的新芽，以此新芽作為初步滅菌的外植體；3) 先對材料進(jìn)行預(yù)處理從水培容器中取生長旺盛的竹芋植株，除去根 與葉，用自來水沖洗干凈后，用0.1%的高錳酸鉀溶液浸泡5min，取出毛巾 將根狀莖抹干，再放入0.1Q/^的多菌靈溶液浸泡5min;把帶芽莖段置于冰箱 Id--4"C 5t:后，并用10m g/L培福朗溶液預(yù)處理16 24h備用；4) 室內(nèi)配制含有消毒殺菌劑的抑菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基這些消毒殺菌劑包括 一種性質(zhì)穩(wěn)定，耐高壓滅菌并能與其它抗生素配合使用的廣譜生物殺菌劑 SDAs，添加量為0. 2 0. 3%、丙酸鈉0. 3% 0. 5%、苯甲酸鈉0. 3% 0. 5%的、 多菌靈0.5% 1.0%;這些消毒殺菌劑可以單用，也可合用；并將培養(yǎng)基的PH 值由5.8調(diào)至4.3 4. 5;5) 外植體誘導(dǎo)材料的表面消毒外植體消毒用70% 75%的乙醇溶液0. 5 1.0 min， 3.0 5.0%的次氯酸鈉和0. 1%的升汞h 1混合溶液浸泡12 14min，混合溶液中加2滴吐溫-80，通過磁棒攪動或不斷震蕩搖動，無菌水 沖洗5 6次，可減少對材料的殺傷作用；用解剖刀剝除芽鱗片，每剝一層鱗 片，用0.1X升汞浸泡1.0min，，無菌水沖洗三次，直至剝至露出生長點(diǎn)為止； 將己消毒的生長點(diǎn)放入含0.2 0.3%殺菌劑SDAsl/4MS無機(jī)鹽中浸泡10 16min后接種；6) 接種后日常管理將培養(yǎng)材料置于滿足植物組織培養(yǎng)的溫度25±1 。C、光照條件2000 25001ux; 16h/d光照的房間或設(shè)施；如溫室內(nèi)進(jìn)行培 養(yǎng)；7) 改善環(huán)境條件接種室與培養(yǎng)室要定期做好消毒與凈化，接種前工作 臺或接種箱要開紫外燈30min以上；培養(yǎng)室的相對濕度應(yīng)控制在70%左右， 相對濕度太高時可以用抽濕機(jī)抽濕；8) 接種人員應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，對接種中所需的工具，必須經(jīng)嚴(yán)格滅 菌后才能使用；在超凈工作臺的操作區(qū)內(nèi)，不要放入過多的待用材料，避免 氣流被擋??；還要定期檢查超凈工作臺的工作質(zhì)量；9) 嚴(yán)查接種材料，淘汰被真菌與細(xì)菌污染的接種材料；10) 經(jīng)常檢查消毒鍋的滅菌質(zhì)量，若發(fā)現(xiàn)問題要立即檢修；11) 檢查培養(yǎng)容器是否存在問題；培養(yǎng)容器封口多用塑料蓋、膠塞、棉 塞、薄膜等，塑料蓋用久了易老化，密封性差，也會造成污染。
全文摘要
一種觀賞竹芋組織培養(yǎng)無菌體系獲得的新方法，利用組織培養(yǎng)母本植株的二次過渡栽培和外植體綜合滅菌及在培養(yǎng)基中添加消毒殺菌劑共培養(yǎng)以獲得無菌體系的改良方法植物組織培養(yǎng)是在無菌條件下實(shí)施；其過程母本植株進(jìn)行二次過渡栽培，即在珍珠巖或陶粒中栽培2～3周后；再移至水中進(jìn)行水培，誘導(dǎo)含有較少內(nèi)生菌的新芽后，取其新芽作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)；對材料進(jìn)行初步消毒和低溫預(yù)處理；在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加2種不同用量的消毒殺菌劑，制備出能抑菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)基；采用綜合方法對外植體進(jìn)行表面消毒。具有獨(dú)特、簡單、實(shí)惠、應(yīng)用價值高特點(diǎn)；在較短時間內(nèi)獲得大量無菌體系，節(jié)約時間、人力、經(jīng)費(fèi)。使無菌外植體的獲得率達(dá)到65～70％。
文檔編號C12N5/04GK101390494SQ20071005961
公開日2009年3月25日 申請日期2007年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月21日
發(fā)明者夏時云, 崔汝玉 申請人:天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心